全 文 ：书泰山照山白金丝桃苷诱导人乳腺癌细胞的
细胞周期阻滞和凋亡的机制研究
*
周长香1 李福荣2
(1．泰安市第一人民医院，山东 泰安，271000;2． 泰山医学院药物化学教研室，山东 泰安，271016)
摘要:目的 观察泰山照山白金丝桃苷(Hyperin)对人乳腺癌细胞株 MCF － 7 细胞周期及凋亡影响及其机制。
方法 体外培养人乳腺癌细胞 MCF － 7，加入不同金丝桃苷浓度处理，运用 MTT法检测细胞生长、流式细胞术 PI染
色检测细胞周期，western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶 2(cyclin － dependent kinase 2 ，CDK2)、细胞周期蛋白
A (Cyclin A)及 caspase 3 的表达。结果 与对照组相比，经金丝桃苷处理后细胞生长呈时间及浓度依赖性抑制;
MCF － 7 细胞周期阻滞在 G2 /M期，该期细胞比例增多;CDK2、Cyclin A蛋白水平的表达与对照组相比明显下降而
caspase 3 蛋白水平的表达明显升高。结论 通过细胞周期的 G2 /M 期阻滞诱导细胞凋亡可能是金丝桃苷发挥抗
肿瘤作用的可能机制之一。
关键词:金丝桃苷;乳腺癌细胞;细胞周期;细胞周期蛋白 A;凋亡
中图分类号:Ｒ271． 9 文献标识码:A 文章编号:1004-7115(2014)02-0081-04
doi:10． 3969 / j． issn． 1004-7115． 2014． 02． 001
The mechanism of hyperin on cell cycle arrest and apoptosis of human breast cancer cell
ZHOU Chang － xiang1 LI Fu － rong2
(1． The number 1 hospital of Taian，Taian 271000，China;2． Taishan Medical University，Taian 271016，China)
Abstract:Objective:To investigate the effect and mechanism of the Hyperin on cell cycle and apoptosis on human
breast cancer cell lines MCF － 7． Methods:MCF － 7 cells cultured in vitro，MTT assay was used to detect cell viability with
various concentration of Hyperin，flow cytometry was used to detect cell cycle，western blot to test protein expression of cell
cycle protein and apoptosis retelated protein． Ｒesults:Compared with vehicle treated，cell viability decreased in a dose and
time dependent way treated with Hyperin，and cell cycle was blocked in G2 /M phase and cell number in G2 /M phase was
increased and S phase was obviously decreased at the meantime，expression of cyclin － dependent kinase 2 (CDK2)，Cyc-
lin A was decreased and caspase 3 were significantly increased compared to control group． Conclusion:By activating the
cell cycle arrest related apoptosis pathway may be one of the mechanism of antitumor effect of Hyperin．
Key words:hyperin;human breast cancer cells;cell cycle;Cyclin A;apoptosis
照山白(Ｒhododendron micranthum Turcz)，又名
万经棵、照山白杜鹃，属于杜鹃花科杜鹃花属植物小
花杜鹃［1］。主要分布在我国东北、华北等地［3］。
照山白中含有皂苷、鞣质、还原性物质、多糖、黄
酮、油脂和挥发油等多种化学成分，目前对照山白
化学成分报道较少。从传统的中医记载看［2，3］，照
山白有祛风通络、调经止痛、化痰止咳的作用。枝叶
入药，用于慢性气管炎、风湿麻痹、痛经、产后关节
痛、高血压等［4］。但对照山白单体如金丝桃苷(Hy-
perin)成分的研究及抗氧化损伤和抗肿瘤作用研究
鲜有报道。已有学者证实照山白提取物可有效抑制
多种癌细胞的增长，诱导癌细胞的凋亡，具有抗肿瘤
的作用，但其促进细胞凋亡的途径及分子生物学机
制尚不明确［5］。
细胞凋亡或称程序性细胞死亡(programmed
cell death，PCD)，近年来发现细胞凋亡与许多疾病
尤其是肿瘤有密切关系，在肿瘤的发生发展中往往
伴有抑凋亡基因的表达增强或促凋亡基因表达的受
抑，因而细胞凋亡的研究对肿瘤的发生、预防和治疗
都有着广阔的前景［5］。然而目前中药成分抗肿瘤
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JOUＲNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 35 No. 2 2014
* 基金项目:泰安市科技计划项目( 20103003) 。
作者简介:周长香( 1970—) ，女，山东泰安人，本科，主管检验师，主要从事临床检验工作。
通讯作者:李福荣。E － mail: lfr700209@ 126． com。
在分子水平上的研究尚不深入，为了进一步探讨照
山白抗癌细胞的作用机制，本实验应用 MTT 法，流
式细胞术 PI染色、及 western blot检测金丝桃苷处理
对人乳腺癌细胞株 MCF － 7 的细胞生长、细胞周期
以及凋亡相关蛋白的表达的影响，旨在进一步探讨
其抗乳腺癌的可能机制。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
1． 1． 1 材料 人乳腺癌细胞株 MCF － 7 购于中科
院生化细胞所，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基
生物公司，兔抗人 CDK2、Cyclin A 及 caspase 3 多克
隆抗体及二抗羊抗兔 IgG均购自美国基因(CST)公
司。二甲基亚砜(DMSO)为北京化工厂产品;ＲPMI
－ 1640 培养基、胎牛血清(FBS)购自 GIBCO 公司;
MTT购自 Sigma 公司;胰蛋白酶 － EDTA 消化液购
自北京 Solarbio科技有限公司。
1． 1． 2 照山白金丝桃苷单体的制备 金丝桃苷由
泰山医学院药物化学合成教研室提供。根据已有文
献［6］从泰山杜鹃属植物照山白枝叶中提取，纯化，
经与对照品比对，高效液相色谱法测定纯度在 98%
以上。将金丝桃苷溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，
作为原液，储存在 － 20 ℃，并在实验前用培养基稀
释。整个研究过程中 DMSO 的终浓度的不超过
0. 1%，对照组相应的用含 0． 1%DMSO培养基处理。
1． 1． 3 细胞培养及干预 将 MCF － 7 细胞置于含
10% FBS的 ＲPMI － 1640 培养基中，置于 37 ℃、5%
CO2 恒温培养箱中培养，80% ～ 85%融合率后常规
传代。
1． 2 方法
1． 2． 1 MTT 法检测细胞生长 取对数生长期细
胞，制成 1 × 105 / ml 的细胞悬液，接种于 96 孔培
养板，每孔加细胞悬液 100 μl 培养过夜，PBS 洗涤，
实验组分别加入浓度为 1 μg /L、10 μg /L、100 μg /L、
1 mg /L、2 mg /L 的金丝桃苷，对照组只加培养基。
金丝桃苷组分别继续培养 24 h、48 h、72 h、96 h、120
h后，加入 MTT溶液(5 mg /ml)10 μl 继续培养 4
h，弃去各孔内液体，每孔加入 100 μl二甲基亚砜，
置振荡器上振荡 5 min，使细胞内和周围的紫色颗
粒充分溶解，室温放置 10 min，于全自动酶标仪上测
定各孔 A490 nm 值，取 3 孔平均值计算细胞抑制
率:抑制率% = (1 －实验组 A 值)/对照组 A 值 ×
100%。
1． 2． 2 流式细胞仪 PI 染色分析各实验组细胞周
期变化:以含 10% FBS 的 ＲPMI － 1640 培养液调整
细胞密度至每毫升 1 × 105 个，按每瓶 2 ml 接种于
25 ml的细胞培养瓶，每 48 h 更换培养液 1 次。待
细胞融合率为 80% ～85%时，无血清培养使细胞同
步化于 G0 期，然后按分组分别加金丝桃苷处理 24
h。细胞分组如下。对照组:仅含培养基;金丝桃苷
低、中、高剂量处理组:(10 μg /L、100 μg /L、1 mg /
L)。取出各处理组细胞培养瓶，胰蛋白酶消化，分
别收集细胞入试管中。以 1000 转 /分离心 5 min，弃
上清，加入 4℃PBS 缓冲液，涡旋混匀，再离心，洗涤
细胞 2 次。4 ℃ 70%的乙醇约 0． 5 ml 贴壁缓慢加
入试管中固定细胞。以 1800 转 /分离心 5 min，弃去
固定液。再加 PBS离心洗涤细胞 1 次。每 106 细胞
加入 500 U的 ＲNA酶，置 37℃孵育 30 min。离心去
除 ＲNA酶，再经 PBS 洗 1 次，离心去上清液。加入
50 mg /L的 PI lml，室温下避光染色 20 min 后，300
目尼龙网过滤。上流式细胞仪测定(激发波长 488
nm ，氢离子激光)，用 multcycleDNA 分析软件包进
行细胞周期分析。
1． 2． 3 Western blot 法检测蛋白的表达 细胞接
种、分组、消化处理同上，预冷的 PBS 洗 2 次，加入
1ml细胞裂解液充分混合，冰上放置 30 min，12000
转 /min 离心 10 min，取上清，BCA法进行蛋白定量。
总蛋白经 SDS － PAGE 分离后，转移至 PVDF 膜上，
加入 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，再加入 1∶ 1000 稀
释的兔抗人的抗体，4 ℃过夜，用 TBST洗 3 次，加入
相应的二抗，室温孵育 1 h，漂洗 4 次，ECL 显色后，
用 Image软件进行灰度分析。
1． 2． 4 统计学处理 实验数据以均数 ±标准差表
示。采用 SPSS 13． 0 软件分析对实验数据进行 one
－ way ANOVA 分析及 LSD 两两比较。P ＜ 0． 05 为
差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 金丝桃苷对人乳腺癌细胞株 MCF － 7 增殖的
抑制作用(表 1，图 1)。
MTT法测定结果显示金丝桃苷对人乳腺癌细
胞株 MCF －7 有抑制作用，并呈浓度和时间依赖效
应。
图 1 MTT检测金丝桃苷对 MCF － 7 生长的抑制作用
2． 2 实验各组药物对细胞周期的影响(表 2)。
与对照组相比，金丝桃苷各处理组 DNA倍体分
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析显示 G2 /M期细胞比例显著高于对照组、S 期细
胞百分比低于对照组(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)，表 1
为流式细胞仪 PI 染色 DNA倍体分析统计结果。
表 1 金丝桃苷对人乳腺癌细胞株 MCF － 7 生长的抑制作用(珋x ± s，n = 4)
组别 0h 24h 48h 72h 96h 120h
vehicle control 1 0． 930 ± 0． 06 0． 841 ± 0． 08 0． 977 ± 0． 09 0． 954 ± 0． 07 0． 938 ± 0． 08
Hyperin(10μg /L) 1 0． 873 ± 0． 07a 0． 733 ± 0． 05a 0． 632 ± 0． 05a 0． 449 ± 0． 07a 0． 442 ± 0． 06b
Hyperin(100μg /L) 1 0． 733 ± 0． 07a 0． 706 ± 0． 09a 0． 510 ± 0． 04a 0． 421 ± 0． 07b 0． 331 ± 0． 05b
Hyperin (1mg /L) 1 0． 633 ± 0． 07a 0． 527 ± 0． 01a 0． 453 ± 0． 03a 0． 221 ± 0． 07c 0． 131 ± 0． 02c
注:aP ＜ 0． 05vs vehicle control，bP ＜ 0． 01 vs vehicle control，cP ＜ 0． 01 vs 10 μg /L Hyperin。
表 2 金丝桃苷对人乳腺癌细胞株 MCF － 7 各细胞周期细胞数量分布的影响(珋x ± s，n = 4)
Group G0 /G1 S G2 /M
vehicle control 54． 84 ± 4． 76 37． 64 ± 3． 23 9． 47 ± 1． 38
Hyperi(10μg /L) 53． 23 ± 5． 07 31． 79 ± 3． 92a 15． 14 ± 1． 05a
Hyperin (100μg /L) 53． 99 ± 3． 30 29． 88 ± 4． 75a 20． 14 ± 0． 87b
Hyperin (1mg /L) 50． 91 ± 5． 72 24． 64 ± 3． 69b 25． 22 ± 0． 68c
aP ＜ 0． 05vs vehicle control，bP ＜ 0． 01 vs vehicle control，cP ＜ 0． 01 vs 10μg /L Hyperin。
2． 3 实验各组细胞周期及凋亡相关蛋白表达的变
化(图 2)。
Western blot结果表明，与对照组相比，经金丝
桃苷处理后，CDK2、Cyclin A 表达降低而 caspase 3
的表达增高，其中高剂量组较低剂量组组间则有明
显差异(P ＜ 0． 05)。
图 2 金丝桃苷对细胞周期相关蛋白 Cyclin A，
CDK2 和凋亡相关蛋白 caspase 3 表达的影响
a:vehicle treated;b:10μg /L Hyperin;c:100μg /L Hyperin;d:
1mg /L Hyperin
3 讨 论
已有研究表明，金丝桃苷和槲皮素等黄酮类成
分对心肌缺血损伤有明显的保护作用。而金丝桃苷
作为黄酮醇苷化合物具有抗氧化和镇痛作用，已被
广泛用于临床治疗。与其他黄酮类物质相比，金丝
桃苷具有低毒、无诱变性等特点，具有抑制癌细胞的
活性。
细胞要分裂，必须正确复制 DNA和达到一定的
体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进
行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点
(check point)的严格检控下进行的，当 DNA 发生损
伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻
断［7］。细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK2 与细胞周期
蛋白结合才具有激酶的活性，另外，细胞中还具有细
胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDK inhibitor，
CKI)对细胞周期起负调控作用，在 G2 /M 期，cycli-
nA、cyclinB 与 CDK1 结合，CDK1 使底物蛋白磷酸
化、如将组蛋白 H1 磷酸化导致染色体凝缩，核纤层
蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件，完成
一个细胞周期［7］。
为了探讨金丝桃苷诱导乳腺癌细胞凋亡的具体
通路，本研究应用 MTT 法检测细胞生长的抑制作
用，结果显示，10μg － 1mg /L 金丝桃苷能显著抑制
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细胞的生长，10μg /L 金丝桃苷作用 48h 后抑制率
可达 23． 81%，并且金丝桃苷对乳腺癌细胞的抑制
作用具有时间和剂量依赖性效应。为探究细胞生长
抑制的原因，本研究应用流式细胞术 PI 染色检测细
胞周期的分布，显示细胞分裂增殖最旺盛的 G2 /M
期细胞比率显著增多，提示细胞分裂被明显抑制，复
制不完全，正常细胞周期被阻断。而在下一步的实
验中，促进通过细胞周期 G2 /M 期检验点的细胞周
期调节蛋白 cyclin A 与 CDK2 表达下降，同时凋亡
家族的最后通路 caspase 3 表达增高，可见金丝桃苷
抑制肿瘤细胞的生长与细胞周期阻滞，促进细胞凋
亡有关。
目前认为除既往研究较清楚的两个主要通路:
细胞凋亡的细胞膜死亡受体通路;细胞色素 C 释放
和 caspases激活的线粒体途经。细胞凋亡不仅在维
持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克
隆选择方面起着作用，而且在肿瘤发生、发展及抗
肿瘤治疗等方面有十分重要的作用［9］。研究细胞
凋亡对肿瘤的发生发展及治疗均有指导意义。用现
代生物学技术研究中医药抗肿瘤疗效及其分子机制
的研究越来越引起人们的关注［8，9］。
总之，实验结果证实，金丝桃苷作用后抑制
MCF －7 细胞生长，呈时间和剂量依赖性地诱导细
胞周期 G2 /M期阻滞及细胞凋亡。这提示金丝桃苷
通过阻断细胞生长的正常细胞周期、使 DNA复制受
阻、同时激活 caspases 凋亡途径可能是乳腺癌细胞
凋亡发生的重要环节，通过研究金丝桃苷抑制癌细
胞的信号转导途径，将为寻找低毒、少副作用的抗癌
制剂提供新线索，开发靶点特异、高效的天然抗癌药
物，可望为恶性肿瘤的中医药治疗及其机制研究提
供新的切入点。至于金丝桃苷对促凋亡蛋白表达调
控具体的信号转导机制还有待进一步研究。
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(收稿日期 2013 － 11 － 8)
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