全 文 ：仲恺农业技术学院学报 , 15(4):43～ 48 , 2002
Journal of Zhongkai Agrotechnical College
文章编号:1006-0774(2002)04-0043-06
　
收稿日期:2002-10-02
基金项目:国家星火计划资助项目(2001EA780018)
作者简介:周俊辉(1963-),男 ,江西临川人 , 副教授 ,博士.
玛丽安万年青茎段培养的污染防止
周俊辉 ,刘花全 ,罗慧君 ,谢海佳 ,黄树行
(仲恺农业技术学院园艺系 , 广东 广州 510225)
摘要:以天南星科黛粉叶属(Dieffenbachia)的玛丽安万年青(Dieffenbachia amoena cv.` Camilla )茎
段为试材 , 用预培养 、减压灭菌和在培养基中加入不同抑菌剂和抗菌素的方式进行研究.结果
表明 , ①减压灭菌效果明显好于常规灭菌 , 未污染率从常规的 6.7%升到 60.0%,成活率从常规
的3.3%升到 43.3%;②用不同抗菌素对外植体进行预培养 , 以抑菌剂 ANB1 和 ANB2 的抑菌效
果较好 ,未污染率分别为 63.3%和 76.7%, 成活率分别为 60.0%和 50.0%;③在培养基中加入不
同抑菌剂 ,对外植体的毒害严重 , 效果不理想.
关键词:玛丽安万年青(Dieffenbachia amoena cv.`Camilla );茎段培养;污染防止
中图分类号:Q943.1;S601　　　　　文献标识码:A
　　在植物的组织培养过程中 ,存在两种类型的污染:一类是通常所讲的污染 ,即外植体因
消毒不彻底 、无菌操作和培养过程中如培养基 、接种工具 、接种室消毒不严格或操作不规范
而导致的污染;另一类是内源菌污染 ,内源菌包括真菌和细菌 ,内源菌污染一般是指内源细
菌所致的污染 ,那些生长在高温多雨的热带 、亚热带植物和多年生木本植物容易表现内源细
菌污染[ 1].内源细菌不能被一般的表面消毒方法所消除 ,若未能对其有效的消除 ,它将随着
材料进入培养过程 ,引起不同程度的污染 ,产生程度不一的危害.在早期往往会导致培养失
败 ,增殖率降低 ,培养物生长减缓 ,玻璃化苗增加等;后期则导致试管苗移栽困难和死亡.有
时污染还会引起培养物的遗传变异[ 2 , 3] .
防止内源细菌污染的方法主要有 ,对母树 、母枝或外植体进行预处理 ,改进灭菌方法
等[ 1].如朱光廉[ 4]对相思树的芽和茎段灭菌时 ,用皂液刷洗和乙醇杀菌后 ,转入 2 g/L苯菌
灵和 2 g/L链霉素溶液中 ,在摇床上振荡过夜 ,再用体积分数 80%乙醇和 1 g/L HgCl2分别杀
菌1 min和15min.Reuveni等[ 5]用300mg/L 利福平处理番木瓜侧芽可以减轻内源细菌污染;
傅婉华等[ 6]把海芋的茎尖用 400 mg/L庆大霉素 、林可霉素液体处理 ,再置入加有 8 mg/L 的
抗菌素培养基中培养.Singh等[ 7]对宽叶紫荆木的茎段用含聚乙烯吡咯烷酮 、柠檬酸 、抗坏
血酸 、多菌灵 、氨苄青霉素或氯霉素的混合液预处理减少了污染.对马蹄莲的根用克菌丹
(Captain)、代森锰锌 、抗生素 ABM1和亚胺青霉烯进行预处理有灭菌效果[ 8].
作者以天南星科黛粉叶属(Dieffenbachia)的玛丽安万年青(Dieffenbachia amoena cv.
`Camilla )为试材 ,以期为降低外植体内源细菌污染提供有效方法.
1　材料与方法
1.1　材料
　　玛丽安万年青取自仲恺农业技术学院农场花圃.
1.2　方法
　　用手术刀将植物体叶片从叶柄处切断 ,用自来水冲洗干净 ,完全去除叶柄以露出腋芽 ,
然后用肥皂水冲洗 1次 ,再用自来水冲洗 2 ～ 3 h后进行处理.
1.2.1　常规消毒　用体积分数 75%的酒精浸泡1 min ,无菌水冲洗 1 ～ 2次 ,再用1 g/L HgCl2
浸泡 15 min ,无菌水冲洗 3 ～ 5次后接种.
1.2.2　减压灭菌
常规减压灭菌　用 1 g/L HgCl2 减压抽滤(真空压力为0.8 kg/cm2 ,下同)8 min ,以无菌水
冲洗 1 ～ 2次 ,再用 1 g/L HgCl2 浸泡 5 min ,无菌水冲洗3 ～ 5次后接种.
加入抗菌素的减压灭菌　配制浓度均为 500mg/L 的5种抗菌素(其中ANB1 、ANB2分别
由江西东方制药厂和上海嘉善善生药业有限公司出品 ,其他为市售),分别与 1 g/L HgCl2 的
混合 ,将外植体置于溶液中进行减压8 min ,无菌水冲洗 1 ～ 2次 ,再用1 g/L HgCl2浸泡5 min ,
无菌水冲洗3 ～ 5次后接种.
1.2.3　外植体的预培养　将洗干净的外植体分别置于 5 种浓度均为 500 mg/L 的抗菌素溶
液中并在摇床上振荡 1 d ,取出用自来水冲洗干净 ,用体积分数 75%酒精浸泡 1 min ,无菌水
冲洗 1 ～ 2次 ,再用 1 g/L HgCl2 浸泡 15 min ,无菌水冲洗 3 ～ 5次后接种.
1.2.4　抗菌素预培养浓度的筛选　选出预处理中表现最好的一种抗菌素 ,分别于培养基中
加入不同浓度的抗菌素对外植体进行 1 d的预培养 ,其他方法步骤同 1.2.1.
1.2.5　在培养基里加入抑菌剂　在培养基中分别加入不同浓度的丙酸钠 、磷酸钠 、八羟基
喹啉 、苯甲酸等抑菌剂.
1.3　培养条件
　　培养基配方　MS 、蔗糖30 g/L 、琼脂 6 ～ 7 g/L、pH 6.2 ,温度25 ～ 28℃,各处理接种30瓶 ,
每瓶接种 1个茎段 ,20 d后观察统计.
2　结果与分析
2.1　减压抽滤对万年青茎段培养污染防止的效果
　　采用 1 g/L HgCl2 浸泡 ,减压灭菌 8 min ,再用 1 g/L HgCl2消毒材料 ,未污染率为 60.0%,
成活率为 43.3%,效果优于常规消毒(表 1).
2.2　外植体的预处理对万年青茎段培养污染防止的效果
　　采用ANB1和 ANB2处理材料所取得的效果较好 ,未污染率和成活率都比较高 ,都达到
50%以上.其中ANB2的未污染率达到76.7%、成活率为50.0%(表2),说明ANB2这种抗菌
素能比较有效地抑制外植体内源细菌的污染.
44　　 仲恺农业技术学院学报 第 15 卷
表 1　常规消毒与减压抽滤对万年青茎段污染防止效果的比较
Table 1　Comparison of sterilization effect between depressurizing disinfection and
convention disinfection in stem culture of D.amoena cv.` Camilla
处理
Treatment
接种茎段数
Inoculating stem number
未污染Uncontaminated
茎段数
Number of stems
比例/ %
成活 Surviving
茎段数
Number of stems
比例/ %
常规消毒
Conventional disinfection
30 2 6.7 1 3.3
减压灭菌
Depressurizing disinfection
30 18 60.0 13 43.3
表 2　不同抗菌素预处理对万年青茎段培养污染防止的影响
Table 2　Influence of contamination control of preparative culture by different antibiotic on
stem culture of D.amoena cv.`Camilla
处理
Treatment
接种茎段数
Inoculating stem number
未污染Uncontaminated
茎段数
Number of stems
比例/ %
成活 Surviving
茎段数
Number of stems
比例/ %
ANB1 30 19 63.3 18 60.0
头孢拉定 Cephaloridine 30 0 0.0 0 0.0
ANB2 30 23 76.7 15 50.0
林肯霉素 Lincomycin 30 7 23.3 5 16.7
庆大霉素 Gentamycin 30 15 50.0 8 26.7
对照 CK 30 2 6.7 1 3.3
2.3　加入抗菌素后减压灭菌对万年青茎段培养污染防止的效果
　　加入不同抗菌素后进行真空减压灭菌 ,对污染防止的效果低于对照 ,实验中还观察到有
的组合起化学反应 ,从而影响了抑菌的效果(表 3).
表 3　1 g/ L HgCl2 分别与不同抗菌素进行真空减压灭菌对万年青茎段培养污染防止的效果
Table 3　Contamination control effect of depressurizing disinfection with different antibiotics combining with
0.2% HgCl2 respectively on stem culture of D.amoena cv.` Camilla
处理
Treatment
接种茎段数
Inoculating stem number
未污染Uncontaminated
茎段数
Number of stems
比例/ %
成活 Surviving
茎段数
Number of stems
比例/ %
ANB1 30 16 53.3 14 46.7
头孢拉定 Cephaloridine 30 13 43.3 7 23.3
ANB2 30 9 30.0 8 26.7
林肯霉素 Lincomycin 30 11 36.7 11 36.7
庆大霉素 Gentamycin 30 8 26.7 5 16.7
对照 CK 30 18 60.0 13 43.3
2.4　ANB2抗菌素预处理浓度对万年青茎段培养污染防止的效果
以300 、400 、500 mg/L的 ANB2预处理 , 3种浓度的抑菌效果相比差异不明显(表 4).但
45第 4 期 周俊辉 , 等:玛丽安万年青茎段培养的污染防止 　　
从使用成本角度出发 ,300 mg/L的 ANB2比较经济.
表 4　不同ANB2预处理浓度对万年青茎段培养污染防止的效果
Table 4　Contamination control effect of preparative culture by different concentration of ANB2 antibiotic on
stem culture of D.amoena cv.`Camilla
处理
Treatment
接种茎段数
Inoculating stem number
未污染 Uncontaminated
茎段数
Number of stems
比例/ %
成活 Surviving
茎段数
Number of stems
比例/ %
100 30 8 26.7 8 26.7
200 30 6 20.0 6 20.0
300 30 15 50.0 15 50.0
400 30 15 50.0 14 46.7
500 31 16 51.6 15 48.4
2.5　培养基中加入不同抑菌剂对万年青茎段培养污染的影响
　　丙酸钠 、磷酸钠 、八羟基喹啉 、苯甲酸 4种抑菌剂在低浓度时抑菌作用较差 ,而在中高浓
度时的抑菌作用虽然不错 ,但对外植体的毒害也很严重 ,高浓度处理后的死亡率在 50%以
上 ,甚至全部死亡 ,总的效果不理想(表 5).
表 5　不同抑菌剂加入 MS 培养基中对万年青茎段培养污染防止的效果
Table 5　Contamination control effect by different inhibitors added to MS medium on
stem culture of D.amoena `Camilla
处理
Treatment
浓度
Conc.
接种茎段数
Inoculating stem number
未污染 Uncontaminated
　茎段数
　Number of stems
比例/ %
成活 Surviving
　茎段数
　Number of stems
比例/ %
丙酸钠 3 g/ L 28 9 32.1 1 3.6
Sodium propionate 7 g/ L 30 14 46.7 0 0.0
10 g/ L 30 17 56.7 2 6.7
磷酸钠 3 g/ L 29 12 41.4 0 0.0
Sodium phosphate 7 g/ L 26 0 0.0 0 0.0
10 g/ L 32 21 65.6 0 0.0
8-羟基喹啉 50 mg/ L 30 9 30.0 2 6.7
8-hydroxyquinoline 100 mg/ L 29 17 58.6 1 3.4
200 mg/ L 29 24 82.8 0 0.0
苯甲酸 20 mg/ L 30 8 26.7 1 3.3
Benzoic acid 40 mg/ L 29 7 24.1 2 6.9
60 mg/ L 29 16 55.2 0 0.0
3　讨论
　　在初代培养中 ,表面细菌引起的污染通常在 2 ～ 3 d就能在外植体周围或培养基表面形
成明显的如水污状 、油污状 、气泡或干皱的红 、黄 、乳白等颜色的菌落.而在外植体培养后 3
46　　 仲恺农业技术学院学报 第 15 卷
～ 5 d内并末发现细菌污染 ,以后则不断出现明显的或不明显的细菌菌落 ,可能是由内生细
菌引起的污染[ 2 ,3].而某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染 ,并不形成明显
的菌落而只在培养基内部形成“丝状物” , “晕状物” ,不易被肉眼察觉 ,如不仔细观察很易被
忽视(背光检查时较易被发现)[ 2] ,随着继代培养次数的增加 ,菌量逐渐累积 ,才在培养基上
显现出来[ 8].
在组培前期对外植体进行预处理 ,则能有效降低内源细菌的污染 ,如将田间采集的枝条
用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中 ,使其发芽 ,然后以这种新抽出的嫩枝作为外
植体 ,可大大减少材料的污染.在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养 ,待抽出徒长的
黄化枝条时取材 ,也可减少污染[ 9] ,又如使用仙客来黄化的叶柄进行培养 ,可控制内源细菌
的污染[ 10 ,11].Langens等[ 12]将美丽百合(Lilium speciosum)的鳞茎外植体放入试管中 43.5℃或
45℃热击处理 ,可有效地减少内源细菌污染.朱光廉[ 13]对相思树的芽和茎段灭菌时 ,用皂液
刷洗和乙醇杀菌后 ,转入 2 g/L 苯菌灵和 2 g/L 链霉素溶液中 ,在摇床上振荡过夜 ,再用体积
分数 80%乙醇和 1 g/L HgCl2 分别杀菌 1 min和 15 min ,灭菌获得了满意的效果.
内源细菌的污染 ,无论用何种表面消毒方法都不能彻底消除 ,因此 ,大多使用抗菌素进
行间接防止处理.本试验表明ANB2的抑菌效果优于其他抗菌素 ,未污染率从对照的 6.7%
上升到 76.7%,成活率从 3.3%上升到 50%.300 、400和 500 mg/L ANB2对材料抑菌效果没
有明显的差异 ,从成本上看 ,一般应选用 300 mg/L的 ANB2;对较难灭菌或组织较老的材料
可使用较高浓度 ,而对于组织较嫩的材料则可使用稍低一些的浓度.
减压灭菌就是利用减压抽走植物组织中的气体使消毒剂更易穿过表面组织 ,进入植物
内部 ,从而增强杀菌效果.本试验表明 ,进行减压处理相对于常规处理有明显的抑菌效果 ,
可以把污染率从对照的 93.3%降低到 40.0%;但加入抗菌素后再进行减压处理 ,抗菌素则未
能取得明显的效果 ,并对外植体有杀死作用.
许婉芳等[ 14]在杀菌剂加入培养基中对金线莲组织培养中微生物污染的抑制实验中 ,
50%多菌灵的效果优于 70%甲基托布津和 25%甲霜灵 ,其抑菌率达 100%,且能促进金线莲
生长.对细菌抑制的实验表明 ,丙酸钠 、磷酸钠均能耐高温高压 ,3 g/L 的丙酸钠有较好的抑
菌效果[ 15] .我们分别用了 4种抑菌剂以不同浓度加入培养基中 ,结果在低浓度时抑菌作用
均较差 ,而在中高浓度时的抑菌作用虽然不错 ,但对外植体的毒害都很严重 ,看来还有待进
一步的研究.
参考文献:
[ 1] 　周俊辉 ,周厚高 , 刘花全.植物组织培养中的内生细菌污染问题[ J] .广西植物 , 2002 ,(6):32-35.
[ 2] 　LEIFERT C , WAITES W M.Contaminants of plant tissue cultures[ J] .Int Assoc Plant Tissue Culture Newsl ,
1990 , 60:2-13.
[ 3] 　周俊辉.植物快速繁殖技术中存在的问题与对策[ J] .仲恺农业技术学院学报 , 1999 , 12(4):64-70.
[ 4] 　朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌[ J] .植物生理学通讯 , 1996 , 32(6), 444-449.
[ 5] 　REUVENI O , SHLESINGER D R , LAVI U.In vitro propagation of dioecious Carica papaya L[ J] .Plant Cell Tissue
and Organ Culture , 1990 , 20(3):41-46.
[ 6] 　傅婉华 ,李文安.利用抗菌素进行的海芋快速繁殖[ J] .植物生理学通讯 , 1991 , 27(5):373-375.
47第 4 期 周俊辉 , 等:玛丽安万年青茎段培养的污染防止 　　
[ 7] 　SINGH H P , SANJAY Singh , SAXENA R P , et al.Pretreatment of nodal segments for in vitro establishment and
bud activation of Madhuca latifolia[ J] .Plant Physiology and Biochemistry New Delhi , 1992 , 19(2):116-122.
[ 8] 　KRITZINGER E M , VUUREN R J van , WOODWARD B , et al.Elimination of external and internal contaminants
in rhizomes of Zantedeschia aethiopica with commercial fungicides and antibiotics[ J] .Plant Cell , Tissue and Organ
Culture , 1998 , 52(1-2):61-65.
[ 9] 　曹孜义 ,刘国民.实用植物组织培养技术教程[ M] .兰州:甘肃科学技术出版社 , 1996.42-43.
[ 10] 　ANDO T ,MURASAKI K.In vitro propagation of Cyclamen by the use of etiolated petiole [ J] .Technol Bull Fac
Hort Chiba Univ , 1983 , 32 , 1-5.
[ 11] 　KARAM N S , A L-MajathoubM.In vitro shoot regeneration from mature tissue of wild Cyclamen persicumMill
[ J] .Scientia Hort , 2000 , 86:323-333.
[ 12] 　LANGENS Gerrits M , ALBERS M , KLERK G J de , et al.Hot-water treatment before tissue culture reduces ini-
tial contamination in Lilium and Acer[ J] .Plant Cell , Tissue and Organ Culture , 1998 , 52(1-2):75-77.
[ 13] 　朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌[ J] .植物生理学通讯 , 1996 , 32(6):444-449.
[ 14] 　许婉芳 ,龚福生 , 萧华山.杀菌剂对金线莲组织培养中微生物污染的抑制作用[ J] .福建果树 , 1999 ,
(4):6-7.
[ 15] 　周俊辉 ,李宏彬 , 杨耀强 ,等.植物组织培养中污染的鉴定与防止初步研究[ J] .微生物学杂志 , 2002 ,
22(2):53-55.
Studies on contamination control in stem culture of
Dieffenbachia amoena cv.`Camilla
ZHOU Jun-hui ,LIU Hua-quan ,Luo Hui-jun ,Xie Hai-jia ,Huang Shu-hang
(Horticulture Department , Zhongkai Agrotechnical College ,Guangzhou 510225 , China)
Abstract:There was serious contamination in the stem culture of Dieffenbachia amoena cv .`Camil-
la , belonging to Araceae.The methods such as depressurizing disinfection , preparative culture by dif-
ferent antibiotic , different inhibitor and antibiotics added to MS medium were used to prevent contami-
nation in stem culture.The results indicated that contamination control effect by depressurizing disin-
fection , whose uncontaminated rate was 60.0%, and the surviving rate was 43.3%, was better than
by convention disinfection , whose uncontaminated rate and the surviving rate were only 6.7% and
3.3% respectively;the inhibiting bacteria contamination effect of ANB1 and ANB2 , whose the uncon-
taminated rate was 63.3% and 76.7% respectively , and the surviving rate was 60.0% and 50.0%
respectively , was better than those of others.The contamination control effect by different inhibitor
added to MS medium was not obvious.
Key words:Dieffenbachia amoena cv .`Camilla ;stem culture;contamination control
【责任编辑　曾东发】
48　　 仲恺农业技术学院学报 第 15 卷