全 文 ：剑 麻 (Agave americana Linn.)是 龙 舌 兰 科
(Agavaceae)/石 蒜 科 (Amaryllidaceae)龙 舌 兰 属
(Agave Linn.)的多年生单子叶植物， 有时也泛指龙
舌兰麻类系单子叶植物[1]， 是经济栽培的种植园作
物[2]。 龙舌兰科植物共有 21个属约670个种[3]。 剑
麻叶片内含有丰富的纤维， 剑麻纤维因具有质地韧、
耐摩擦、 耐酸碱等多种优良性能而被广泛应用 [4-5]。
另外剑麻对重金属镉、 铜具有一定的耐性， 在重金
属污染土壤的修复中具有很好的应用前景[6-7]。
然而剑麻是多年生植物， 定植后生命周期长，
F1代可育的不多， 而且育种基础薄弱及育种效率不
高， 所以新品种的培育难度很大。 再加上斑马纹病
和茎腐病的影响， 使剑麻的生产受到严重的威胁。
李愿平等人以H.11648的珠芽为材料进行快速繁殖，
发现了芽分化、 芽增殖与生根培养基。 吕玲玲等[8]人
以剑麻的茎尖为材料通过摸索试验建立了 H.11648
的高效再生体系， 优化了芽分化与芽增殖的最适培
养基， 生根率也由 82%增至 93.3%。 但到目前为止
还没有剑麻的转基因报道， 本试验以剑麻无菌苗为
材料， 应用GUS基因瞬时表达技术， 建立并优化了
农杆菌介导的剑麻的遗传转化体系， 为今后开展剑
麻转基因研究提供有效的方法。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试剂
剑麻遗传转化体系的建立与优化①
丁 静 1,2)徐 立 2, 3)杜中军 2) 李志英 2,3)②
(1 海南大学农学院 海南儋州 571737；
2 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南儋州 571737；
3 农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室 海南儋州 571737)
摘 要 以剑麻无菌苗叶片为试材， 研究了潮霉素(Hyg)、 菌液浓度、 侵染时间、 乙酰丁香酮(As)及羧苄青霉素
(Car)等因素对剑麻遗传转化的影响。 结果表明， 剑麻最适遗传转化体系为： Hyg选择浓度为 25 mg/L， OD600＝
0.6左右的农杆菌菌液， 侵染时间为 10～15 min， As浓度为 200μmol/L， Car浓度为400 mg/L。
关键词 剑麻 ； 遗传转化 ； 优化 ； 瞬时表达率
分类号 S563.8
Establishment and Improvement of Agave Genetic Transformation System
DING Jing1,2) XU Li2) DU Zhongjun2) LI Zhiying2)
(1 College of Agronomy, Hainan University, Danzhou, Hainan 571737;
2 Tropical Crops Genetic Resources Institute, CATAS, Danzhou, Hainan 571737
3 Ministry of Agriculture Key Laboratory for Tropical Crop Germplasm Resources,
Danzhou, Hainan 571737)
Abstract Studied the various factors of Agave genetic transformation on the hygromycin (Hyg), bacteria
solution concentration, infection time, acetosyringone (As) and carbenicillin (Car). The results showed that
the optimal genetic transformation system was as follows: 25 mg/L, infecting in the (OD600=0.6) for 10～
15 min. As density was 200 μmol/L. Car density was 400 mg/L.
Keywords Agave americana Linn. ; genetic transformation ; improvement ; transient expression
① 基金项目： “948” 项目(No.2010-S6)； 农业部热带作物种质资源保护项目(No.10RZZY)。
收稿日期： 2011-04-25； 责任编辑/张海东； 编辑部 E-mail： rdnk@163.com。
② 通讯作者： 李志英。 E-mail: xllizhiying@vip.163.com。
Vol．31, No．6
2011年6月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第31卷第6期
June． 2011
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2011年6月 第31卷第6期热带农业科学
组织培养所用试剂盒其他化学试剂均为国产分
析纯产品。 羧苄青霉素(Carbenicillin, Car)， 母液浓
度为 100mg/mL； 潮霉素(Hygromycin, Hyg)， 母液
浓度为 10mg/mL； 卡那霉素(Kanamycin, Km)， 母
液浓度为 100mg/mL； 利福平(Rifampicin, Rif)， 母
液浓度为10mg/mL； GUS染色液[9]： 50mmol/L磷酸
钠缓冲液(pH7.0)中含 0.1mol/L的 K4[Fe(CN)6]，
0.1mol/L的K3[Fe(CN)6]， 0.001%(v/v)TritonX-100，
10mmol/L的 Na2EDTA， 20%甲醇， 0.5mg/mLX-Gluc
(先溶于少量的DMSO)。
1. 1. 2 受体材料与培养基
剑麻 H·11648 [Agave hybrid No.11648 = (A.
amaniensis Trelease et W. Nowell×A. angustifolia
Haworth)×A. amaniensis]无菌苗由中国热带农业
科学院热带作物品种资源研究所快繁中心提供。
剑麻无菌苗所用培养基为：
预培养： MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.1mg/L＋
30g/L蔗糖＋7g/L卡拉胶， pH5.8。
共培养： MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.1mg/L＋
As 200μmol/L＋30 g/L蔗糖＋7 g/L卡拉胶 ， pH
5.8。
选择培养： MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.1mg/L＋
Car400mg/L＋Hyg25mg/L＋30g/L蔗糖＋7g/L卡
拉胶， pH5.8。
1. 1. 3 质粒和菌株
质粒 pBI121及根癌农杆菌 LBA4404均由中国
热带农业科学院热带作物品种资源研究所快繁中心
保存。
1. 2 方法
1. 2. 1 预培养
将无菌苗的幼嫩叶片切成0.5cm2左右的小块，
放到预培养培养基上， 25℃暗培养2d。
1. 2. 2 潮霉素(Hyg)基础抗性测定
将剑麻叶片基部的叶段接种于 Hyg浓度分别
为： 0、 10、 15、 20、 25mg/L的培养基上， 21d后
统计叶片的褪绿程度。
1. 2. 3 菌液浓度对转化的影响
将保存在-80℃的已转化的农杆菌菌液在含有Km
50mg/L和 Rif100mg/L的LB固体培养基上涂板，
28℃倒置培养约48h。 挑取单菌落接种到含Km50mg/L
和 Rif100mg/L的 20mLLB液体培养基中， 28℃、
200r/min震荡培养直至 OD600分别为 0.2、 0.4、
0.6、0.8、1.0， 然后将菌液离心， 4kr/min×3min，
收集菌体， 并用 20mL液体的预培养培养基重新悬
浮。 用悬浮液侵染叶片10min， 每个处理30个， 3
次重复， 共培养2d后转移至抗性培养基上， 21d后
计算GUS瞬时表达率， 以确定最佳农杆菌侵染浓度。
1. 2. 4 侵染时间对转化的影响
将预培养的外植体浸泡在盛有农杆菌菌液的小
三角瓶中， 分别侵染5、 10、 15、 20、 25min， 然后
共培养 2d后转移至抗性培养基上， 21d后计算
GUS瞬时表达率， 以确定最佳侵染时间。
1. 2. 5 乙酰丁香酮(As)的浓度对转化的影响
在共培养培养基中加入不同浓度的 As(0、 100、
200、 300、 400μmol/L)， 每个处理 30个农杆菌浸泡过
的外植体， 3次重复， 以确定最佳As的浓度。
1. 2. 6 羧苄青霉素(Car)浓度对诱导愈伤的影响
外植体共培养后， 农杆菌会快速生长而抑制了
外植体的生长分化， 甚至导致外植体死亡。 为了抑
制农杆菌的生长， 在培养基中需要添加适宜的抑菌
剂， 保证外植体的正常生长。 本试验设置5个Car
的浓度： 0、 100、 200、 300、 400、 500mg/L， 观察
受体材料接种于不同浓度Car中的变化。
1. 2. 7 GUS组织化学染色
将农杆菌侵染后 1～4d的外植体进行 GUS组
织化学染色， 鉴定GUS基因的瞬时表达率。 取转化
后经选择培养获得的剑麻外植体， 置于培养板， 加
入适量的 GUS染色液， 盖上盖封好容器于 37℃条
件下反应14～18h。 同时取未转化的同步材料做阴
性对照吸掉反应液后加入70%的乙醇脱色， 常温放
置至阴性对照材料呈白色， 肉眼观察显色情况并拍
照记录。
2 结果与分析
2. 1 潮霉素(Hyg)基础抗性测定
在进行遗传转化之前， 首先对材料进行抗生素
筛选， 确定外植体对抗生素的敏感性， 选出合适的
抗生素浓度。 本试验设置了5个Hyg浓度梯度， 培
养21d后进行观察。 试验结果见表1。
随着 Hyg浓度的升高， 外植体持绿率急剧下
38- -
丁 静 等 剑麻遗传转化体系的建立与优化
降， 变为深褐色或者黑色。 当 Hyg浓度为 25mg/L
时， 剑麻叶片的持绿率已经降到 0(图1A)； 当 Hyg
浓度为15mg/L时， 剑麻叶片的持绿率为41.2%(图
1B)， 约为对照(ρHyg＝0mg/L)的一半， 即剑麻叶片出
现了半致死现象。 在后续实验中采用 Hyg浓度为
25mg/L作为外植体选择压力。
2. 2 菌液浓度对转化的影响
在农杆菌介导的遗传转化中， 合适的菌液浓度
是成功转化的一个关键性的影响因子。 试验结果见
图2。
OD600值在 0.2～0.6时， 随着菌液浓度的升
高， GUS瞬时表达率也随即升高。 当 OD600值达到
0.6左右时， GUS 瞬时表达率达到最高； 但是当
OD600值大于 0.6时 ， GUS 瞬时表达率呈下降趋
势。 当 OD600值大于 0.6时， 由于菌液浓度太大，
农杆菌过度繁殖导致外植体污染严重， 使外植体褐
化甚至死亡， 降低 GUS瞬时表达率。
2. 3 侵染时间对转化的影响
侵染的过程就是农杆菌向外植体表面附着的过
程， 掌握好侵染时间， 有助于减少后续试验中可能
造成的污染。 侵染的时间太短， 农杆菌尚未接触到
伤口表面； 侵染时间太长， 农杆菌会在伤口处大量
繁殖， 使外植体软腐， 变褐死亡。 见图3。
侵染时间在15min时， GUS瞬时表达率最高，
但是侵染超过 15min时， GUS 瞬时表达率开始降
低， 因此在后续试验中， 为了减少剑麻叶片受到的
伤害， 侵染时间应该控制在10～15min。
2. 4 乙酰丁香酮的浓度对转化的影响
剑麻属于单子叶植物， 对农杆菌不敏感。 研究
发现， 双子叶植物受到创伤后会产生酚类物质乙酰
丁香酮(As)。 As可以诱导农杆菌 Vir基因的活化，
而Vir区基因的活化与T-DNA区的转移有着直接的
关系。 As的加入， 大大促进了农杆菌向植物细胞
的附着和转移， 从而促进外源基因的整合。 从图4
可以看出， 在共培养培养基中加入一定量的 As，
可以明显的提高 GUS瞬时表达率。 当As浓度增加
至200μmol/L时， GUS瞬时表达率达到最高； 但是
当As浓度继续增加时， GUS瞬时表达率反而降低。
所以， 在后续试验中往共培养培养基中加入 200
μmol/L的As。
表 1 剑麻叶片的 Hyg敏感性试验结果
Hyg浓度/(mg·L-1) 持绿率/%
0 94.8
10 70.3
15 41.2
20 28.7
25 0
图 1A 全致死 图 1B 半致死
0
5
10
15
20
25
30
35
0.2 0.4 0.6 0.8 1
菌液浓度(OD600)
GU
S
瞬
时
表
达
率
/%
图 2 菌液浓度对 GUS瞬时表达率的影响
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
5
GU
S
瞬
时
表
达
率
/%
15 20 2510
浸染时间/min
图 3 侵染时间对 GUS瞬时表达率的影响
图 4 As 浓度对 GUS瞬时表达率的影响
30
25
20
15
10
5
0
GU
S
瞬
时
表
达
率
/%
0 100 200
As浓度
400300
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2011年6月 第31卷第6期热带农业科学
2. 5 羧苄青霉素浓度对诱导愈伤的影响
经侵染共培养后的外植体上附着大量的农杆
菌， 如果不及时抑制菌的生长与繁殖， 外植体将会
由于菌的污染而导致褐化甚至死亡。 试验表明， 0、
100、 200、 300、 400mg/L的羧苄青霉素几乎不影响
剑麻叶片愈伤组织的诱导。 使用 500mg/L的羧苄
青霉素时， 剑麻的叶片很难长出愈伤组织。 为了能
抑制住菌的污染并且保证转化体细胞的正常分化，
在后续试验中往选择培养培养基中加入 400mg/L
的羧苄青霉素。
2. 6 GUS组织化学染色
表达载体pBI121中含有 35S∶GUS报告基因，
可以对转化后的外植体进行 GUS组织化学染色检
测。 随机抽取几个转化后的剑麻叶片(图 5A)， 进
行GUS染色鉴定； 同时取几个未转化的叶片作对照
(图5B)。 GUS基因的组织化学染色结果发现， 剑麻
叶片出现不同程度的蓝斑， 说明GUS基因已转入剑
麻叶片中。
3 讨论
遗传转化细胞的再生要求受体材料有高效稳定
的再生能力[10]。 在本实验中， 剑麻叶片愈伤组织的
诱导过程中经常碰到玻璃化现象， 愈伤组织变得水
渍化， 软腐失去分化能力， 在培养过程中应采取一
些措施尽量降低培养皿内的湿度[11-12]， 比如稍微增
加卡拉胶的浓度， 液体培养基凝固后封口以及采用
透气性好的材料等[13]。
在对外植体侵染的过程中， 本实验只使用了一
种菌种LBA4404， 不同的菌种对植物材料的侵染能
力不同， 在以后的研究中可以采用其他菌种进行实
验比较， 选出最佳的农杆菌菌种。
在后期的抑菌过程中， 虽然羧苄青霉素的浓度
越高， 抑菌效果越好， 但是会严重影响到剑麻愈伤
组织的诱导， 所以采用400mg/L的羧苄青霉素。 在
培养的后期如果发现农杆菌污染， 及时用羧苄青霉
素水清洗外植体， 这样既保证了外植体愈伤组织的
正常诱导， 又避免了农杆菌污染对外植体的影响。
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图 5A GUS染色 图 5B 对照 CK
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