全 文 ：四 川 大 学 学 报 （医 学 版 ）
Ｊ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ　Ｓｃｉ　Ｅｄｉ）
　２０１２；４３（５）：６５１－６５６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
狭叶重楼甾体皂苷类化学成分ＰＳⅡ体外抗
肿瘤作用的观察＊
肖　雪１，杨　媚１，白　鹏２，陈新莲３，刘珊玲１，邹　娟４，王　和１，３△
１．四川大学华西第二医院 妇产科 （成都６１００４１）；２．四川大学华西基础医学与法医学院 法医物证学教研室 （成都６１００４１）；
３．四川大学华西第二医院 遗传实验室 （成都６１００４１）；４．四川大学华西第二医院 病理科 （成都６１００４１）
　　【摘要】　目的　研究狭叶重楼甾体皂苷类化学成分（ＰＳⅡ）的抗瘤活性及机制。方法　分离纯化狭叶重楼主
要化合物ＰＳⅡ，根据理化性质、波谱数据鉴定其结构。体外实验中采用 ＭＴＴ法评价ＰＳⅡ对肿瘤细胞株ＳＫＯＶ３
的毒性及时效和量效关系，并以化疗药物依托泊苷（ＶＰ１６）为对照；通过流式技术和缺口末端标记（ＴＵＮＥＬ）技术
探讨ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞凋亡的影响。采用免疫印迹技术探讨药物对丝裂原激活蛋白酶（ＭＡＰＫｓ）和线粒体信号
通路的影响。结果　ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞株的５０％生长抑制浓度（ＩＣ５０）为４．８１μｍｏｌ／Ｌ。流式细胞和ＴＵＮＥＬ技
术进一步证实了ＳＫＯＶ３细胞经ＰＳⅡ干预后凋亡率增加，并有剂量和时间依赖性（Ｐ＜０．０５）。ＰＳⅡ抑制细胞外信
号调节蛋白激酶（ＥＲＫ）１／２的活性并促进凋亡蛋白Ｂｉｄ、Ｂａｘ表达增加，下游蛋白ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－３以及ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－９的
表达下调。结论　ＰＳⅡ通过影响 ＭＡＰＫｓ信号传导途径靶蛋白，特别是对启始因子ＥＲＫ１／２活性的抑制，激活线
粒体凋亡通路，促进肿瘤细胞的凋亡。
【关键词】　ＰＳⅡ　凋亡　线粒体通路　丝裂原激活蛋白酶通路
Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＳⅡＩｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｒｈｉｚｏｍａ　Ｐａｒｉｄｉｓ　ＸＩＡＯ　Ｘｕｅ１，ＹＡＮＧ　Ｍｅｉ１，ＢＡＩ　Ｐｅｎｇ２，
ＣＨＥＮ　Ｘｉｎ－ｌｉａｎ３，ＬＩＵ　Ｓｈａｎ－ｌｉｎｇ１，ＺＯＵ　Ｊｕａｎ４，ＷＡＮＧ　Ｈｅ１，３△．　１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，
Ｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００４１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｌａｂ　ｏｆ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００４１，Ｃｈｉｎａ；４．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００４１，Ｃｈｉｎａ
△Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｅ＿ｃｄ＠１２６．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｐａｒｉｓ　ｓａｐｏｎｉｎⅡ（ＰＳⅡ）ｆｒｏｍ　Ｒｈｉｚｏｍａ　Ｐａｒｉｄｉｓ　ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｉｔｓ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＰＳⅡ ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１　Ｈ
ａｎｄ　１３　Ｃ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ．ＰＳⅡ ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｒｅａｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ
ａｎｄ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｉｍｅ－ａｎｄ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ＴＵＮＥＬ
ａｓｓａｙ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＰＳⅡｔｏ　ＭＡＰＫｓ　ａｎｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＰＳⅡｏｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ＳＫＯＶ３ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ＩＣ５０ｏｆ　ＰＳ
Ⅱｔｏ　ＳＫＯＶ３ｗａｓ　４．８１μｍｏｌ／Ｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ａｎｄ　ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ
Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ＴＵＮＥＬ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＥＲＫ１／２ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ＰＳⅡａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｎｅ
ｃ，ｃａｓｐａｓｅ－３ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ－９ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｎｏｔｉｃｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＰＳⅡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＰＳⅡｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ
ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　ＳＫＯＶ３ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｋｅｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　ＭＡＰＫｓ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ
ＥＲＫ１／２ａｎｄ　ｅｖｅｎｔｕａｌｙ　ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ　ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　ＳＫＯＶ３．Ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｍａｙ　ｂｅ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＰＳⅡｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　　Ｐａｒｉｓ　ｓａｐｏｎｉｎⅡ　　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　　ＭＡＰＫｓ　ｐａｔｈｗａｙ
　　中药重楼，又名七月一枝花，产于欧亚大陆的热
带至温带地区，为延龄草科重楼属植物华重楼和滇
重楼的干燥根茎［１］。药理实验发现重楼皂苷具有止
血、抑菌、抗微生物、调节免疫及镇痛和镇静等多种
＊ 国家自然科学基金（Ｎｏ．８１００１１５９）资助
△ 通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｅ＿ｃｄ＠１２６．ｃｏｍ
生理活性［２］。前期实验［３］发现重楼皂苷有抗肿瘤作
用，其中抗肿瘤活性最强的单体重楼皂苷Ⅱ（ＰＳⅡ）
对包括ＳＫＯＶ３细胞株等多种肿瘤细胞株有显著的
细胞毒性，而对源于内胚层、中胚层和外胚层的正常
细胞未见明显抑制作用，提示ＰＳⅡ可以作为抗肿瘤
的潜在药物进行研究和开发。本研究探讨了ＰＳⅡ
对卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ３的增殖抑制作用及其作用
DOI:10.13464/j.scuxbyxb.2012.05.003
四川大学学报（医学版） 第４３卷
机制。
１　材料与方法
１．１　材料
狭叶重楼干燥根茎来源于四川大学华西药学院
重楼种植中心。ＤＭＥＭ培养基、胰蛋白酶购自美国
Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，胎牛血清购自Ｇｉｂｃｏ公司，二甲基亚
枫（ＤＭＳＯ）、噻唑蓝（ＭＴＴ）、４’，６－二脒基－２－苯基吲
哚 （４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ， ＤＡＰＩ）、
Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（ＶＰ１６）和β－ａｃｔｉｎ抗体均购自美国Ｓｉｇｍａ
公司，细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶 （ＥＲＫ）１／２、
ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、
Ｂｉｄ、ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－３、ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－９、聚腺苷酸二磷酸核
糖转移酶（ＰＡＲＰ）和Ｃｌｅａｖｅｄ－ＲＡＲＰ抗体购自美国
Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，ＡｎｎｅｘｉｎⅤ－ＦＩＴＣ／ＰＩ凋亡检测试
剂盒购自南京凯基生物技术发展有限公司。
１．２　ＰＳⅡ的提取
狭叶重楼干燥根茎１５ｋｇ，粉碎后用７０％乙醇
反复渗漉提取，石油醚脱脂，乙酸乙酯萃取。乙酸乙
酯萃取部位经反复硅胶柱层析 （氯仿－甲醇梯度洗
脱）并结合重结晶得白色针晶后分别上反相硅胶
ＲＰ－Ｃ１８中压液相柱层析最终获得化合物ＰＳⅡ。经
过结构鉴定后，药物溶解于无血清培养基中，制备为
储存液，稀释液中的ＤＭＳＯ浓度不超过０．１％。
１．３　细胞株和细胞的培养
人卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ３由四川大学华西第二
医院分子生物实验室馈赠，复苏培养于含有１０％胎
牛血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养基中，于３７℃、５％ＣＯ２
饱和湿度孵箱内常规培养。每次药物干预前更换新
鲜培养基。
１．４　ＭＴＴ法检测ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞增殖抑制的
影响
采用 ＭＴＴ法检测ＰＳⅡ不同浓度作用不同时
间对ＳＫＯＶ３细胞增殖抑制的作用。将ＳＫＯＶ３细
胞株按照５０００／孔密度接种于９６孔板，并孵育２４ｈ
使其同步化，然后加入药物 ＰＳⅡ（５、１０、１５、２０
μｍｏｌ／Ｌ），化疗药物依托泊苷（ＶＰ１６）相同浓度作为
实验对照，空白对照组不加入任何处理药物，溶剂对
照组仅加ＤＭＳＯ，各设３个复孔。ＰＳⅡ干预后１、３、
５、７ｄ，在每个干预时段结束后每孔分别加入 ＭＴＴ
溶液（５ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ，３７℃放置４ｈ后，弃上清，
每孔加入ＤＭＳＯ　１５０μＬ溶解结晶物，用酶联免疫
检测仪在４７０ｎｍ波长处测定其光密度（ＯＤ）值。计
算细胞增殖抑制率。细胞抑制率（％）＝１－（实验组
ＯＤ值－空白对照ＯＤ值）／（溶剂对照ＯＤ值－空白
对照ＯＤ值）×１００％。并根据剂量－反应曲线和时
间－反应曲线计算出５０％生长抑止浓度（ＩＣ５０）。实
验重复３次，取其均值。
１．５　ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞凋亡和细胞周期的影响
１．５．１　流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期　收
集ＰＳⅡ不同浓度（１、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ）和作用不同
时间（０ｈ，２４ｈ，４８ｈ，７２ｈ）的ＳＫＯＶ３细胞，对照
组不加入任何处理药物（含等量的ＤＭＳＯ），用冰乙
醇重悬细胞并固定。用流式细胞仪检测 ＤＮＡ 含
量，并利用ＣｅｌＱｕｅｓｔ软件和 ＭｏｄＦｉｔ软件 （Ｖｅｒｉｔｙ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｈｏｕｓｅ，Ｔｏｐｓｈａｍ，ＵＳＡ）分析细胞凋亡
和细胞周期分布的变化。重复实验３次，取平均值。
１．５．２　ＴＵＮＥＬ技术检测细胞凋亡　ＰＳⅡ不同浓
度（１、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ）作用２４ｈ的ＳＫＯＶ３细胞
爬片，经多聚甲醛固定后，置于含１ｇ／Ｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－
１００的１ｇ／Ｌ枸橼酸钠穿透液中。采用原位末端标
记试剂盒进行检测。检测结果以核阳性为判定标
准，结合ＨＥ染色，对ＨＥ染色证实为坏死的细胞不
记数。随机移动细胞爬片进行计数，选择相邻的１０
个视野，排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域。
ＴＵＮＥＬ标记指数（ＴＵＮＥＬ　ＬＩ）是计数每张细胞爬
片中至少３０００个细胞核中出现的凋亡细胞数。
１．６　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞线粒体
通路中蛋白含量的影响
１０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＳⅡ干预ＳＫＯＶ３细胞１０、２０、３０、
６０、１２０、２４０ｍｉｎ之后，经过裂解液作用后提取上清
液，检测上清液的蛋白浓度。１、５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ
ＰＳⅡ分别干预ＳＫＯＶ３细胞２４ｈ，经过裂解液作用
后提取上清液，检测上清液的蛋白浓度。等量的上
清液蛋白煮沸１０ｍｉｎ后，通过ＡＤＡ－ＰＡＧＥ电泳分
离，转入ＰＶＤＦ膜。经过３％ ＢＳＡ室温下封闭１ｈ
后，加入一抗４℃过夜。次日漂洗后加入１∶５００二
抗室温平摇１ｈ。洗膜３次，加入发光底物，可见显
色的条带。ＥＲＫ１／２、细胞凋亡相关蛋白Ｂａｘ、Ｂｃｌ－
２、Ｂｉｄ、ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－３、ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－９、ＰＡＲＰ 和
Ｃｌｅａｖｅｄ－ＲＡＲＰ各蛋白与 β－ａｃｔｉｎ 的积分光密度
（ＩＯＤ）比值为蛋白的相对表达量。
１．７　统计学方法
多组间比较采用单因素方差分析，组间比较用
ｔ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２　结果
２．１　ＰＳⅡ的结构特点
通过对狭叶重楼的化学成分研究，分离得到多
２５６
第５期 肖　雪等：狭叶重楼甾体皂苷类化学成分ＰＳⅡ体外抗肿瘤作用的观察
个甾体皂苷类化合物，其中 ＰＳⅡ 的结构式为
（３ｂｅｔａ，２５Ｒ）－Ｓｐｉｒｏｓｔ－５－ｅｎ－３－ｙｌ－Ｏ－６－ｄｅｏｘｙ－ａｌｐｈａ－Ｌ－
ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１－２ ）－Ｏ－［Ｏ－６－ｄｅｏｘｙ－ａｌｐｈａ－Ｌ－
ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－（１－４）－６－ｄｅｏｘｙ－ａｌｐｈａ－Ｌ－ｍａｎｎｏｐｙ－
ｒａｎｏｓｙｌ－（１－４）］－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，见图１。
图１　ＰＳⅡ的化学结构示意图
Ｆｉｇ　１　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐａｒｉｓ　ｓａｐｏｎｉｎⅡ
２．２　ＰＳⅡ对卵巢癌细胞ＳＫＯＶ３的生长抑制作用
ＰＳⅡ对卵巢癌细胞ＳＫＯＶ３的生长存在明显抑
制，且随着ＰＳⅡ浓度的增高以及干预时间的延长，
对ＳＫＯＶ３ 生长的抑制作用增强 （Ｐ＜０．０５）。
ＳＫＯＶ３对 ＰＳⅡ 和 ＶＰ１６ 敏感性不一，ＰＳⅡ 对
ＳＫＯＶ３细胞的ＩＣ５０（２４ｈ）为４．８１μｍｏｌ／Ｌ，低于
ＶＰ１６组的 １３．５２μｍｏｌ／Ｌ。１０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＳⅡ 和
ＶＰ１６分别干预ＳＫＯＶ３细胞到第５ｄ，对ＳＫＯＶ３
的抑制率分别为８０．１％和６０．１％ （Ｐ＜０．０５）；２０
μｍｏｌ／Ｌ　ＰＳⅡ和 ＶＰ１６分别干预ＳＫＯＶ３细胞到第
７ｄ，对ＳＫＯＶ３的抑制率分别为９０．０％和７０．４％
（Ｐ＜０．０５），ＰＳⅡ总体抗瘤活性强于ＶＰ１６（图２）。
２．３　ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞凋亡和细胞周期的影响
荧光显微镜下观察 ＴＵＮＥＬ染色，结果显示
（图３），ＰＳⅡ干预后的ＳＫＯＶ３细胞随着浓度的升
高，阳性信号逐渐增加，甚至可见成簇分布的黄绿色
或黄色荧光阳性ＴＵＮＥＬ信号。高浓度ＰＳⅡ干预
组ＴＵＮＥＬ　ＬＩ值（１０μｍｏｌ／Ｌ，８２．６％）高于低浓度
干预组（１μｍｏｌ／Ｌ，１０．８％，５μｍｏｌ／Ｌ，５３．２％）和对
照组（０μｍｏｌ／Ｌ，３．７％），差异均有统计学意义
（Ｐ＜０．０５）。
图２　不同浓度ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞生长的抑制（ｎ＝３）
Ｆｉｇ　２　Ｉｎｈｉｂｉｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＳⅡｏｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ｎ＝３）
＊Ｐ＜０．０５，ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　１μｍｏｌ／Ｌ　ＰＳⅡｇｒｏｕｐｓ；△ Ｐ＜０．０５，ｖｓ．５μｍｏｌ／Ｌ　ＰＳⅡｇｒｏｕｐ；＃ Ｐ＜０．０５，ｖｓ．ＶＰ１６ｇｒｏｕｐ　ｉｎ　ｓａｍｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ａ：ＰＳⅡ；Ｂ：ＶＰ１６
　　 流式细胞结果显示 １０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＳⅡ 干预
ＳＫＯＶ３细胞０、２４、４８和７２ｈ后凋亡率分别为
２．２％、４．５％、２２．１％和６０．０％（Ｐ＜０．０５），１、５、１０、
２０μｍｏｌ／Ｌ　ＰＳⅡ干预ＳＫＯＶ３细胞２４ｈ后凋亡率
分别为１．４％、２．０％、５．７％和４６．１％（Ｐ＜０．０１），
凋亡率的上升有剂量和时间的依赖性。同时发现干
预后的ＳＫＯＶ３细胞存在Ｇ２／Ｍ 期的阻滞。在浓度
为１０μｍｏｌ／Ｌ时，Ｇ２／Ｍ 期的细胞达到３１．４％，凋
亡峰可见（图４）。
２．４　ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞线粒体通路中各种蛋白
含量的影响
ＰＳⅡ 对 ＥＲＫ１／２ 的抑制作用在 ＰＳⅡ 干预
ＳＫＯＶ３细胞３０ｍｉｎ后就出现，此后随着时间的延
长，抑制作用逐渐减弱。提示ＰＳⅡ能够通过损伤或
图３　不同浓度ＰＳⅡ对ＳＫＯＶ３细胞的凋亡作用。ＴＵＮＥＬ　×４００
Ｆｉｇ　３　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＳⅡ
ａｎｄ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴＵＮＥＬ　ａｎｄ　ＤＡＰＩ　ａｆｔｅｒ　２４ｈｏｕｒｓ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ
ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＴＵＮＥＬ　×４００
３５６
四川大学学报（医学版） 第４３卷
图４　流式细胞仪分析凋亡率和细胞周期
Ｆｉｇ　４　ＦＡＣＳ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
Ａ：ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＰＳⅡｆｏｒ　２４ｈ；Ｂ：ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＳⅡ （１０μｍｏｌ／Ｌ）ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ
ｆｏｒ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔ；Ｃ：ＰＳⅡｉｎｄｕｃｅｓ　Ｇ２／Ｍ　ｐｈａｓｅ　ａｒｒｅｓｔ　ｉｎ　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ；
Ｄ：ＰＳⅡｉｎｄｕｃｅｓ　Ｇ２／Ｍ　ｐｈａｓｅ　ａｒｒｅｓｔ　ｉｎ　ＳＫＯＶ３ｃｅｌｓ　ｉｎ　ａ　ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ
破坏ＥＲＫ１／２活性，抑制细胞增殖，促进其凋亡。
　　ＰＳⅡ干预ＳＫＯＶ３细胞后２４ｈ，促凋亡蛋白
Ｂｉｄ、凋亡前蛋白Ｂａｘ的表达增强，抗凋亡蛋白Ｂｃｌ－２
的表达降低，下游的活化前凋亡蛋白ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－３
以及ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－９表达下调。ＰＡＲＰ酶随着ＰＳⅡ
浓度的增高表达增强（图５）。
３　讨论
重楼属植物是重要的中药材，是民间治疗炎症
的一种安全有效的药物，但国内外迄今为止鲜见对
其甾体皂苷类化学成分抗癌作用机制的报道。仅康
利平和 Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ等［１，２］提出ＰＳⅠ通过干预线
粒体通路诱导肝癌细胞 ＨｅｐＧ２ 和耐 Ｄｏｘ的 Ｒ－
ＨｅｐＧ２ 细胞凋亡。本研究显示，重楼另一重要化学
单体ＰＳⅡ具有更强的抗肿瘤活性。ＰＳⅡ对妇科肿
瘤细胞株有较强的毒性。通过细胞毒性实验比
较［４，５］，ＰＳⅡ比临床常用化疗药物 ＶＰ１６具有更强
的抗肿瘤活性并且具有剂量依赖效应，其潜在优势
４５６
第５期 肖　雪等：狭叶重楼甾体皂苷类化学成分ＰＳⅡ体外抗肿瘤作用的观察
图５　重要信号传导通路靶蛋白的表达改变
Ｆｉｇ　５　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＰＳⅡｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｋｅｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｐ－ＥＲＫ１／２：Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２；Ｔ－ＥＲＫ１／２：Ｔｏｔａｌ　ＥＲＫ１／２；＊Ｐ＜０．０５，ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ａ：Ｅｆｆｅｃｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ；Ｂ：Ｅｆｆｅｃｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
已见端倪。其临床意义在于通过天然药物重楼有效
成分的研发，对卵巢癌的治疗提供新选择。
　　文献认为正常的细胞凋亡在维持生物机体细胞
死亡与增殖的平衡过程中起关键作用。恶性肿瘤细
胞的产生是丧失自发凋亡能力的后果，因此最有效
的抗癌治疗可能是诱导肿瘤细胞的凋亡，而不仅是
抑制其增殖，因此利用药物诱导肿瘤细胞恢复凋亡
能力对治疗肿瘤疾病具有重要意义［６－８］。ＰＳⅡ干
预后的细胞显示出典型的凋亡特征。线粒体通路参
与了ＰＳⅡ促ＳＫＯＶ３细胞凋亡的过程。ＰＳⅡ作用
于细胞膜受体Ｒａｓ蛋白后，使磷酸化ＥＲＫ１／２表达
降低，影响ＥＲＫ１／２活性。同时，由于Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ
的 失 衡 引 发 线 粒 体 功 能 的 破 坏［９，１０］，释 放
ｃｙｔｏｃｈｒｏｎｅ　ｃ至细胞浆，导致下游ｃａｓｐａｓｅ因子的激
活，产生凋亡，这一过程同ＰＳⅠ抗肿瘤机制类似［３］。
国外报道称线粒体破坏过程中有膜电位的变化，认
为产生的活性氧（ＲＯＳ）及随之ｃｙｔｏｃｈｒｏｎｅ　ｃ和凋亡
诱导因子（ＡＩＦ）的释放参与了整个过程［１１，１２］。不仅
如此，后期实验也预示扭转线粒体的失活能缓解ＰＳ
Ⅱ所致的细胞毒性，反向证实了ＰＳⅡ通过损伤线粒
体诱导卵巢癌细胞ＳＫＯＶ３的凋亡［１３］。本研究还
发现随着ＰＳⅡ剂量逐渐增大，Ｇ２／Ｍ 期ＳＫＯＶ３细
胞比 例 逐 渐 升 高，至 １０ μｍｏｌ／Ｌ 时 Ｇ２／Ｍ 期
ＳＫＯＶ３细胞达到３１．４％，出现了明显的 Ｇ２／Ｍ 期
阻滞，细胞不能增殖。由此可见，ＰＳⅡ干预ＳＫＯＶ３
的过程中，丝裂原激活蛋白酶（ＭＡＰＫｓ）加上各种上
游影响因子和下游作用底物，构成了功能多样的信
号网络。其中各通路之间是协同抑或叠加作用，都
有待进一步的实验研究才能阐述。
综上所述，重楼皂苷中的有效成分 ＰＳⅡ在
ＳＫＯＶ３细胞株表现出很强的细胞毒性。其诱导细
胞凋亡和Ｇ２／Ｍ期阻滞可能是抗卵巢癌作用的主要
机制［１４］。ＭＡＰＫｓ／ＥＲＫ通路可作为卵巢癌治疗的
新的作用靶点，ＰＳⅡ可以作为卵巢癌治疗的重要药
物。
参 考 文 献
１ 康利平，马百平．重楼中甾体皂苷的分离与结构鉴定．中国药
物化学杂志，２００５；１５（１）：２５－３１．
２ Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ　Ｙ．Ｐａｒｉｓ　Ｐｏｌｙｐｈｙｌａ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａ　ｌｉｔｅｒａｒｙ
ｆａｖｏｕｒ　ｔｏ　ｗｏｒｌｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎｅｗｓｆｉｎｄｅｒ，２００７；９（５）：１０２－１１８．
３ Ｘｉａｏ　Ｘ，Ｂａｉ　Ｐ，Ｂｕｉ　Ｎｇｕｙｅｎ　ＴＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ　ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ　Ｐａｒｉｓ　ＳａｐｏｎｉｎⅠａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ，２００９；８
（５）：１１７９－１１８８．
４ Ｖｅｒｍｅｓ　Ｉ，Ｈａａｎｅｎ　Ｃ，Ｓｔｅｆｆｅｎｓ－Ｎａｋｋｅｎ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｓｓａｙ
ｆｏｒ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｎ　ｅａｒｌｙ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｌａｂｅｌｅｄ
５５６
四川大学学报（医学版） 第４３卷
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ｐｒｅｅｃｌａｍｐｔｉｃ　ｐｌａｃｅｎｔａｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　Ｂａｘ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　１４－３－３
ｚｅｔａ　ｔｈｒｏｕｇｈ　１４－３－３ｚｅｔａ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｐｌａｃｅｎｔａ，２００８；２９
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６ Ｃｈｅｕｎｇ　ＪＹ，Ｏｎｇ　ＲＣ，Ｓｕｅｎ　ＹＫ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｏｌｙｐｈｙｌｉｎ　Ｄ　ｉｓ　ａ
ｐｏｔｅｎｔ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｉｎ　ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ＨｅｐＧ２ｃｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ
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ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｈ２Ｏ２－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｖｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃａｓｐａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐ３８ＭＡＰＫ
ｐａｔｈｗａｙ．Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ，２０１２；３（４）：１１０１－１１１０．
８ Ｌｉｎ　ＪＷ，Ｃｈｅｎ　ＪＴ，Ｈｏｎｇ　ＣＹ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｏｎｏｋｉｏｌ　ｔｒａｖｅｒｓｅｓ　ｔｈｅ
ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｓ
ｖｉａ　ａｎ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｂａｘ－ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ－ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ－ｃａｓｐａｓｅ
ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｎｅｕｒｏ　Ｏｎｃｏｌ，２０１２；１４（３）：３０２－３１４．
９ Ｔａｎ　Ｈ，Ｌｉｎｇ　Ｈ，Ｈｅ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＲＫ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
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ｌｅｕｋｅｍｉａ　ＨＬ－６０ｃｅｌｓ．Ａｒｃｈ　Ｐｈａｒｍ　Ｒｅｓ，２００８；３１（６）：７８６－７９３．
１０ Ｌｅｅ　ＳＲ，Ｌｏ　ＥＨ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ
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１１ Ｙａｎ　Ｆ，Ｗａｎｇ　Ｍ，Ｌｉ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｇａｍｂｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｒｅｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｐｈｏｓｐｈｏ－
Ｅｒｋ１／２ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８ ＭＡＰＫ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ＨｅｐＧ２
ｃｅｌｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１２；３３（２０１２）：１８１－１９０．
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Ｄ，ａ　ｓｔｅｒｏｉｄａｌ　ｓａｐｏｎｉｎ　ｉｎ　Ｐａｒｉｓ　ｐｏｌｙｐｈｙｌａ，ｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
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Ｔｈｅｒ，２００５；４（１１）：１２４８－１２５４．
１３ 朱丽丽，李惠芬．重楼皂苷对ＳＧＣ－７９０１细胞增殖抑制及诱导
凋亡的实验研究．时珍国医国药，２００９；２０（６）：１５０１－１５０２．
１４ 刘永萍，凌　杨．重楼复方与氟尿嘧啶对胃癌细胞的体外协同
作用研究．现代肿瘤医学，２０１０；１８（３）：４４２－４４５．
（２０１２－０４－１１收稿，２０１２－０６－１８修回）
编辑　沈　
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进
·个案报告·
腹膜透析患者合并腹膜炎和感染性心内膜炎１例报
告
张紫媛，钟　慧△
四川大学华西医院 肾脏内科 （成都６１００４１）
【关键词】　腹膜透析　感染性心内膜炎　抗中性粒细胞胞
浆抗体（ＡＮＣＡ）相关性血管炎
　　患者男，４４岁，因“发现肌酐升高６月，维持性腹膜透析
５月，腹痛１ｄ”入院。查体：Ｔ　３８℃，ＢＰ　１２０／７０ｍｍＨｇ（１
ｍｍＨｇ＝０．１３３３ｋＰａ），四肢及腹部有散在出血点，双肺未闻
及干湿啰音，心律齐，主动脉瓣区可闻４／６收缩期杂音，腹平
软，有压痛，无反跳痛，双下肢轻度水肿。既往诊断“风湿性
心脏病”７年。６月前心脏彩超提示主动脉瓣（中度）狭窄（中
度）返流，肌酐４９８μｍｏｌ／Ｌ，予对症治疗。５月前肌酐升高至
６９８μｍｏｌ／Ｌ，开始腹膜透析。３月前因四肢关节肌肉疼痛查
胞浆型抗中性粒细胞胞浆抗体（ｃ－ＡＮＣＡ）１∶１０阳性，抗蛋
白酶３（ＡＮＣＡ－ＰＲ３）阳性，肾穿提示新月体肾小球肾炎。给
予甲强龙冲击后改为口服强的松及环磷酰胺，因白细胞下降
停用环磷酰胺，１周后发生腹膜炎，抗感染治疗２周痊愈。
此次患者因腹痛入院。
入院查：血红蛋白７５ｇ／Ｌ，白细胞５．８３×１０９／Ｌ，中性粒
细胞比率８４．６％，肌酐３２４．１μｍｏｌ／Ｌ，Ｃ反应蛋白３５．４
ｍｇ／Ｌ，类风湿因子３４．４ＩＵ／ｍＬ，ｃ－ＡＮＣＡ　１∶１０，ＡＮＣＡ－
ＰＲ　３阳性，腹透液培养出热带念珠菌，心电图：预激综合征。
△ 通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：Ｚｈｏｎｇｈｕｉ３９＠１２６．ｃｏｍ
心脏彩超：感染性心内膜炎，主动脉瓣右冠瓣赘生物形成，继
发狭窄（中度）伴返流（重度），二尖瓣返流（轻度）。两次血培
养阴性，予及时行腹膜透析拔管术，并予氟康唑、去甲万古霉
素抗感染等对症治疗，后复查肌酐３６０μｍｏｌ／Ｌ，心脏彩超示
主动脉瓣赘生物机化。
讨论　既往有关慢性肾脏病合并感染性心内膜炎的报
道大多出自血液透析，本例腹膜透析的 ＡＮＣＡ相关性血管
炎患者合并腹膜炎及感染性心内膜炎尚属首次报道。
慢性透析的患者存在心血管钙化、钙磷代谢紊乱、尿毒
症慢性微炎症环境、长期留置导管，这些都增加了感染性心
内膜炎的发生率，本例患者既往有风湿性心脏病基础，长期
透析并留置腹透管，近期一直服用激素及免疫抑制剂，反复
发生腹膜透析相关性腹膜炎而广泛使用抗生素，均是其发生
真菌性心内膜炎的高危因素，其腹透液也培养出热带念珠
菌，但多次血培养阴性，使得我们难以鉴别此心内膜炎为细
菌性抑或真菌性。感染性心内膜炎死亡率较高，影响其预后
的主要因素包括：病情特征、是否有并发症、病源微生物种
类、超声心动图征象、左室功能不全、持续感染、肾功能衰竭
等，普遍认为药物＋手术治疗可降低死亡率。但此患者肾功
能不全，腹透拔管后肌酐仍在３６０μｍｏｌ／Ｌ左右，心脏外科会
诊后暂不行手术，经验性抗感染治疗６周，随访直至目前未
出现感染性心内膜炎的不良并发症。因ＡＮＣＡ相关性血管
炎本身的预后较差，又合并感染性心内膜炎，该患者预后有
待继续观察和随访。
（２０１２－０２－２０收稿，２０１２－０５－３０修回）
编辑　吕　熙
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