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广南天料木茎的抗氧化活性



全 文 :第 2 9卷第1期
2 0 1 2 年 1 月
精 细 化 工
FINE CHEMICALS
Vol . 2 9,No . 1
Jan. 2 0 1 2
中药现代化技术
收稿日期:2011 - 10 - 05;定用日期:2011 - 11 - 07
基金项目:国家高技术研究发展计划“863 计划”(2007AA021500) ;海南省重点科技计划项目(06202)
作者简介:许琼情(1987 -) ,女,海南大学研究生。联系人:刘平怀(1967 -) ,男,教授、药学研究员、制药高级工程师,电话:0898 -
66291892,E - mail:twlph@ 163. com。
广南天料木茎的抗氧化活性
许琼情,时 杰,李恒颜,陈德力,汪春牛,刘平怀*
(海南大学 材料与化工学院 海南优势资源化工材料应用技术教育部重点实验室,海南 海口 570228)
摘要:以抗坏血酸(Vc)、二叔丁基羟基甲苯(BHT)和芦丁(Rutin)为阳性对照,利用酶标仪,采用二苯代苦味肼基
自由基(DPPH)法、铁离子还原总抗氧化力(FRAP)法两种微量体外抗氧化活性分析方法对广南天料木茎加速
溶剂萃取物及常规溶剂提取物进行评价。研究表明,乙酸乙酯加速溶剂萃取物(ASE - EtOAc,EC50 = 20. 8 mg /
L)清除 DPPH 自由基的能力最强,但弱于阳性对照。二氯甲烷加速溶剂萃取物(ASE - DCM)还原 Fe3 +能力最
强〔FRAP值 =(793. 3 ± 45. 7)mol TE /g〕,强于阳性对照 BHT,弱于阳性对照 Vc和 Rutin。常规水提取物(W)清
除 DPPH自由基的能力和还原 Fe3 +能力最弱。综合比较发现,常规正丁醇提取物(NBA)抗氧化能力较强、制备
简单,具有更为广阔的研究与应用前景。
关键词:广南天料木;抗氧化活性;加速溶剂萃取;中药现代化技术
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1003 - 5214(2012)01 - 0030 - 04
Antioxidant Activity of Homalium Paniculiforum Stem
XU Qiong-qing,SHI Jie,LI Heng-yan,CHEN De-li,WANG Chun-niu,LIU Ping-huai*
(Key Laboratory of Hainan Superior Resources Chemical Material Application Technology of the Ministry of Education,
College of Material and Chemical Engineering,Hainan University,Haikou 570228,Hainan,China)
Abstract:The antioxidant activity of two groups of Homalium paniculiflorum stem extracts,accelerated
solvent extracts and conventional solvent extracts,was evaluated respectively with microplate reader,
DPPH method and FRAP method,taking ascorbic acid(Vc) ,butylated hydroxytoluene(BHT)and rutin
(Rutin)as positive controls. The results show that,among these extracts,ASE - EtOAc extracts had the
strongest(yet weaker than all positive controls)capacity of DPPH free radical scavenging(EC50 = 20. 8
mg /L) ;ASE - DCM had the strongest(stronger than BHT yet weaker than Vc and Rutin)reduction
capacity of Fe3 +〔FRAP value =(793. 3 ± 45. 7)mol TE /g〕;conventional water extracts W displayed
the weakest capacity in either DPPH free radical scavenging or Fe3 + reducing. Judging from
comprehensive comparison,conventional NBA extracts hold out better prospects for application and
extensive research,for it can be easily prepared and has noticeable antioxidant ability.
Key words:Homalium paniculiforum;antioxidant activity;accelerated solvent extraction;modernization
technology of traditional Chinese medicines
Foundation items:Supported by the National High Technology Research and Development Program of
China(863 Program) (2007AA021500)and Important Science Program of Hainan Province of China
(06202)
广南天料木属天料木属(genus Homalium)植
物,是热带亚热带地区特有的药用植物。据报道,该
属植物主要含有生物碱类、苷类、香豆素类、三萜类
等化学成分,具有抗病毒、抗糖尿病等药理活
DOI:10.13550/j.jxhg.2012.01.002
性[1 - 3]。迄今为止,仅虞俊[4]等人从广南天料木茎
的乙酸乙酯部位分离鉴定出了 14 个化合物,却未对
其进行任何生物活性的探索。为了研究广南天料木
茎的抗氧化有效成分,筛选出抗氧化能力较强、制备
简单的活性部位,本文用酶标仪,采用两种微量分析
方法对广南天料木茎加速溶剂萃取物及常规溶剂提
取物进行体外抗氧化活性评价。
1 实验部分
1. 1 材料与试剂
广南天料木茎于 2010 年 9 月采自海南省陵水
县吊罗山,由海南大学材料与化工学院生物工程系
刘平怀教授鉴定,标本存放于海南优势资源化工材
料应用技术教育部重点实验室。采后自然阴干,粉
碎,置烘箱中 50 ℃烘干,贮存备用。
二苯代苦味肼基自由基(DPPH,美国 Alfa Aesar
公司)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,日本东京化成
工业株式会社) ,芦丁(Rutin,上海生工生物工程技
术服务有限公司) ,抗坏血酸、石油醚、乙酸乙酯、二
氯甲烷、正丁醇、乙醇、甲醇均为国产 AR试剂。
1. 2 主要仪器
ASE150 加速溶剂萃取仪(美国 Dionex 公司)、
xMARK微孔板分光光度计(美国 BIO RAD公司)。
1. 3 试样制备
1. 3. 1 ASE提取物
取适量的广南天料木茎粉末,装入 100 mL不锈
钢萃取池中,萃取池底部提前加装纤维素过滤膜。
置于 ASE萃取仪中,逐次使用溶剂极性由小到大的
石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇为萃取剂,设定
ASE提取方法参数[5]〔温度 120 ℃、静态提取时间 5
min、循环次数为 2、供液压力为 1. 034 MPa、以 60%
(体积分数)池体积的溶剂冲洗、N2 吹扫时间 100
s〕,提取液减压浓缩至干,备用。
1. 3. 2 常规溶剂提取物
取适量干燥的广南天料木茎经粉碎后用体积分
数 95%工业乙醇回流提取 3 次,每次 3 h,合并提取
液,回收乙醇至无醇味,所得总浸膏加水适量稀释,
依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,并回收溶剂,
得各段粗提物浸膏,待用。
1. 3. 3 不同质量浓度待测溶液的配制
取各段粗提物 40 mg用无水乙醇或甲醇溶液定
容于 10 mL容量瓶中为4 000 mg /L,再稀释 5 个质
量浓度为2 000、1 000、500、250、125 mg /L。
1. 4 抗氧化活性测定方法
1. 4. 1 DPPH法
参考文献[6 - 8]并适当改进,建立 DPPH 微量抗
氧化筛选方法。在 96 孔板中将配制好的溶液按照
表 1 参数加样,避光静置 30 min 后于 515 nm 下测
定 A0、Ai、Aj 吸光度,每个试样做 6 个平行实验和 5
次重复测试。按下式计算样品对自由基的清除率:
DPPH清除率 /% = 100 -(Ai - Aj)/A0 × 100
以待测溶液质量浓度为横坐标,采用 Origin 8. 0 进
行清除率平均值及误差分析,并进行指数函数拟合,
计算不同样品在对 DPPH 清除率为 50%时的质量
浓度(即 EC50) ,并进行抗氧化能力比较,即 EC50越
小,抗氧化能力越强。
表 1 DPPH加样参数表
Table 1 DPPH sample parameter table
加样参数
A0 190 μL DPPH溶液 + 10 μL溶剂
Ai 190 μL DPPH溶液 + 10 μL样品溶液
Aj 190 μL甲醇 + 10 μL样品溶液
1. 4. 2 FRAP法
以 FeSO4 溶液的质量浓度为横坐标,吸光度值
为纵坐标绘制标准曲线。之后对各提取物总还原能
力进行如下测定[9]:吸取 2. 5 mL 20 mmol /L 的
FeCl3 溶液与 2. 5 mL 10 mmol /L TPTZ溶液和 25 mL
300 mmol /L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH =3. 6)混合,再
吸取该混合液 150 μL 加入 96 孔酶标板中,放入
xMark酶标仪内,升温至 37 ℃,于 593 nm 下读取吸
光值(反应前)。加入 20 μL 500 mg /L 抗氧化物质
反应 8 min后再次读数。吸光度变化值根据上述标
准曲线转化为单位为 mol TE /g 的 FRAP 值,FRAP
值越大,抗氧化能力越强。采用同样的方法获得
500 mg /L Vc、BHT和 Rutin的 FRAP值,所有实验重
复 4 次。
2 结果与讨论
2. 1 DPPH法
由图 1、表 2 可知,广南天料木茎各提取物与阳
性对照对 DPPH 自由基的清除能力顺序为:Vc >
Rutin > BHT > ASE - EtOAc > ASE - DCM > NBA >
ASE - MeOH > EtOAc > ASE - MSO > MSO > W。8
个提取物中,加速溶剂萃取物清除 DPPH 自由基的
能力皆强于常规溶剂提取物,且提取物 ASE -
EtOAc清除 DPPH 自由基的能力最强(EC50 = 20. 8
mg /L) ,提取物 ASE - DCM 次之(EC50 = 21. 3 mg /
L) ;常规溶剂提取物中,提取物 NBA 清除 DPPH 自
由基的能力最强(EC50 = 24. 5 mg /L) ,提取物 W 最
弱(EC50 = 176. 8 mg /L)。
·13·第 1 期 许琼情,等:广南天料木茎的抗氧化活性
表 2 广南天料木茎不同提取物的 DPPH抗氧化活性
Table 2 Antioxidant activity of the different extracts from
Homalium paniculiforum stem
常规溶剂
提取物
DPPH法
EC50
/(mg/L)
加速溶剂
萃取物
DPPH法
EC50
/(mg/L)
阳性
对照品
DPPH法
EC50
/(mg/L)
石油醚(MSO) 114. 4 石油醚(ASE - MSO) 40. 4 Vc 3. 7
乙酸乙酯(EtOAc) 33. 6 二氯甲烷(ASE - DCM) 21. 3 BHT 6. 8
正丁醇(NBA) 24. 5 乙酸乙酯(ASE - EtOAc) 20. 8 Rutin 4. 9
水(W) 176. 8 甲醇(ASE - MeOH) 28. 9
2. 2 FRAP法
图 2 显示,广南天料木茎提取物与阳性对照
Vc、BHT、Rutin 还原 Fe3 +能力顺序为:Vc > Rutin >
ASE - DCM > NBA > ASE - EtOAc > BHT > MSO >
EtOAc > ASE - MSO > ASE - MeOH > W。由此可以
看出,广南天料木茎提取物 ASE - DCM、NBA、ASE
- EtOAc还原 Fe3 +总抗氧化能力皆强于阳性对照
BHT〔FRAP值 =(568. 3 ± 58. 2)mol TE /g〕,弱于阳
性对照 Vc〔FRAP值 =(8 937. 7 ± 647. 7)mol TE /g〕
和Rutin〔FRAP值 =(2 755. 8 ±172. 0)mol TE /g〕,且
提取物 ASE - DCM还原 Fe3 +的能力最强〔FRAP 值
=(793. 3 ± 45. 7)mol TE /g〕,其他提取物还原 Fe3 +
的能力均低于 BHT,提取物 W 最弱〔FRAP 值 =
(242. 0 ± 66. 0)mol TE /g〕。
3 结论
本文利用酶标仪,采用 DPPH、FRAP 两种微量
测定法对广南天料木茎的加速溶剂萃取物及常规溶
剂提取物进行了体外抗氧化活性考察。
(1)加速溶剂萃取物清除 DPPH 自由基的能力
普遍较强。加速溶剂萃取显著提高了低极性溶剂提
取物的 DPPH抗氧化能力,而对中等极性溶剂提取
物的影响不大。
各提取物对 Fe3 +还原能力大致为中等极性溶
剂提取物 >低极性溶剂提取物 >大极性溶剂提取
物,仅提取物 ASE - DCM、NBA、ASE - EtOAc 还原
Fe3 +总抗氧化能力强于阳性对照 BHT〔FRAP 值 =
(568. 3 ± 58. 2)mol TE /g〕。
两种提取方式中,中等极性溶剂提取物都具有
较强的清除 DPPH 自由基的能力,且相差不大。而
大极性溶剂提取物 W 清除 DPPH 自由基的能力和
还原 Fe3 +能力最弱〔EC50 = 176. 8 mg /L,FRAP 值 =
(242. 0 ± 66. 0)mol TE /g〕。
(2)广南天料木茎提取物 ASE - DCM、NBA、
ASE - EtOAc都具有较好的抗氧化能力,可以作为
天然抗氧化剂进行研究开发。综合比较,发现常规
溶剂提取物 NBA研究与应用前景更为广阔,值得深
入研究。 (下转第 40 页)
·23· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第 29 卷
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