全 文 :北方园艺2014(23):79~82 ·生物技术·
第一作者简介:王珍(1990-),女,硕士研究生,研究方向为植物细
胞遗传学。E-mail:chilaideaiwangzhen@qq.com.
责任作者:王振英(1965-),女,博士,教授,研究方向为植物抗性分
子生物学。
基金项目:天津市农委重点资助项目(5KN13001);天津师范大学
应用开发研究基金资助项目(52XK1210)。
收稿日期:2014-07-14
大蒜气生鳞茎快繁体系研究
王 珍,范 宝 莉,任 春 雪,顾 增 惠,刘 晓 颖,王 振 英
(天津师范大学 生命科学学院,天津300387)
摘 要:以宝坻大蒜气生鳞茎为试材,比较了不同低温处理时间、不同诱导培养基对试管苗
诱导率的影响,优化了气生鳞茎快繁体系。结果表明:低温处理14d,试管苗的诱导率最高;诱导
生根的最佳培养基为MS基本培养基。由于气生鳞茎诱导试管苗不经过脱分化和再分化过程,
所以不会产生遗传变异。
关键词:宝坻大蒜;气生鳞茎;植物脱毒;快繁
中图分类号:S 633.403.53 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2014)23-0079-04
大蒜(Alium sativumL.)属百合科(Liliacea)葱属
(Alium tistalosum),在我国栽培历史有2000余年,遍及
全国各地。大蒜以鳞茎(地蒜)、蒜薹和幼株食用,还可
以生产青蒜和蒜黄,是群众最喜爱的主要蔬菜之一。宝
坻大蒜“六瓣红”是津沽名优特产之一,营养价值高,具
有强力杀菌、防治癌症、排毒清肠、降低血糖和防治心脑
血管疾病等功效。但是大蒜通常以蒜瓣进行无性繁殖,
在长期的无性繁殖过程中,因病毒逐年积累并代代相
传,使种性逐渐退化,蒜头变小,产量、品质大幅下降。
大蒜采用气生鳞茎(天蒜)繁殖时,天蒜采自蒜薹(花薹)
顶端的花苞(生长点),而大蒜生长点部位一般不带病
毒,因而可自然脱毒[1]。
目前已建立了以茎尖[2]、根尖[3]、全展叶[4]、贮藏
叶[5]、茎盘切块[6]和花原始体[7]等为外植体的大蒜组织
培养再生体系。大蒜的离体再生途径主要有愈伤组织
途径和不定芽途径。愈伤组织途径是通过外植体的脱
分化实现的,但是愈伤组织再生途径的效率不高,因此
建立一种新的高效的大蒜快繁体系是非常必要的。大
蒜气生鳞茎在生产实践上主要被用来提纯及复壮[8],但
由于只有成熟的气生鳞茎才能做“种子”,而培养成熟的
气生鳞茎会争夺地蒜的营养,影响地蒜的产量,降低种
蒜的收益。该研究利用未成熟的大蒜气生鳞茎作为外
植体直接诱导试管苗,使大蒜实现天然脱毒的同时,又
避免愈伤组织途径脱分化、再分化、繁殖系数低以及容
易产生遗传变异的缺憾,同时不影响地蒜的正常生长,
以期为宝坻大蒜的脱毒快繁和种质创新打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为宝坻大蒜“六瓣红”的气生鳞茎。
1.2 试验方法
1.2.1 气生鳞茎的形态学解剖 选取3个花苞,按体积
的大小从中挑取10颗气生鳞茎进行排序,分别称量并
记录气生鳞茎重量,并进行形态学解剖,观察其是否含
有贮藏叶。统计重量为何值时气生鳞茎中不再含有贮
藏叶。因为只有含有贮藏叶,气生鳞茎才有可能诱导生
成试管苗。3次重复。
1.2.2 培养基的配置 以 MS培养基为基本培养基,
添加不同种类和浓度的激素,pH 5.8;高温高压灭菌
20min;待冷却至60℃时,分装到200mL的组培瓶中,
每瓶约35mL,盖紧瓶盖备用。试验中所用培养基为:试
管苗诱导培养基:MS基础培养基+1.0mg/L NAA+
5.0mg/L KT;试管苗生根培养基:MS基础培养基。
1.2.3 大蒜气生鳞茎的低温处理 在不影响地蒜生长
的前提下将尚未成熟的花苞采摘下来,4℃保存,共设置
低温7、14、28、84d4个处理,用于试管苗诱导试验。
1.2.4 接种及试管苗的诱导 取生长良好有贮藏叶的
宝坻大蒜气生鳞茎,用75%的乙醇浸泡10min,用无菌
水冲洗,滤纸吸干,再用0.1%的HgCl2 灭菌10min,用
无菌水冲洗3次,滤纸吸干,接入试管苗诱导培养基上,
每瓶接入7颗气生鳞茎,每个处理20瓶,按1.2.3下的
方法低温处理。培养条件为日温25℃,夜温20℃,光照
1 500lx,光照时间14h/d。培养49d,每7d进行观察
统计诱导率。
1.2.5 生根培养 将诱导出来的生长旺盛的苗转入生
根培养基中,诱导生根,生根培养基为 MS基础培养基。
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·生物技术· 北方园艺2014(23):79~82
35d之后统计生根率。
1.2.6 试管苗的练苗及移栽 生根后的试管苗,待其长
到3片真叶、生根3~4条时,室温开瓶练苗,7~10d后
将小植株从试管中取出,洗去根部培养基将其移栽至灭
菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土(1∶3∶6)中,移栽后保持日
温25℃,夜温15℃,在组织培养室中放置30d壮苗,之
后移栽到大田。
1.2.7 气生鳞茎试管苗根尖和地蒜根尖染色体的观察
待地蒜根(对照)和气生鳞茎诱导的试管苗的根长到
1cm时将根取下,用卡诺固定液固定24h,于70%乙醇
中保存,用于染色体观察。将根在1mol/L盐酸、60℃条
件下解离8min,蒸馏水冲洗3遍,用滤纸将处理好的根
擦干,取根尖,用卡宝品红染色8min,压片,进行染色体
的观察。
2 结果与分析
2.1 气生鳞茎大小与储藏叶的关系
气生鳞茎是否含有贮藏叶是其能否发芽的关键,只
有含有贮藏叶的气生鳞茎才有可能被诱导生成试管苗,
所以,在气生鳞茎诱导培养之前,对不同大小的气生鳞
茎做形态学解剖,找出气生鳞茎的重量与是否含有贮藏
叶之间的关联,最终通过称重挑选带有贮藏叶的气生鳞
茎进行试管苗诱导。从表1可以看出,在第1组中重量
为0.0093g的气生鳞茎含有贮藏叶,重量为0.0076g的
气生鳞茎不含有贮藏叶,第2组中重量为0.0089g的含
有贮藏叶,重量为0.0078g的不含有贮藏叶,在第3组
中重量为0.0088g的含有贮藏叶,重量为0.0082g不含
有贮藏叶。3次试验中不含贮藏叶的气生鳞茎重量的平
均值为0.009g,所以,选取重量大于0.009g的气生鳞茎
用于试管苗的诱导,弃掉重量小于0.009g的气生鳞茎。
表1 不同重量的气生鳞茎与贮藏叶的关系
Table 1 The relationship between aerial bulb weight and storage leaf
组数
Group
number
编号
Number
重 量
Weight
/g
是否含有贮藏叶
Whether it contain
storage leaf
能否诱导试管苗
Whether induction
plantlets
组数
Group
number
编号
Number
重 量
Weight
/g
是否含有贮藏叶
Whether it contain
storage leaf
能否诱导试管苗
Whether induction
plantlets
组数
Group
number
编号
Number
重 量
Weight
/g
是否含有贮藏叶
Whether it contain
storage leaf
能否诱导试管苗
Whether induction
plantlets
1 0.1883 是 能 1 0.1724 是 能 1 0.1655 是 能
2 0.1415 是 能 2 0.1567 是 能 2 0.1519 是 能
3 0.0903 是 能 3 0.1203 是 能 3 0.0951 是 能
4 0.0502 是 能 4 0.0676 是 能 4 0.0830 是 能
第1 5 0.0423 是 能 第2 5 0.0478 是 能 第3 5 0.0592 是 能
组 6 0.0170 是 能 组 6 0.0250 是 能 组 6 0.0277 是 能
7 0.0115 是 能 7 0.0162 是 能 7 0.0125 是 能
8 0.0093 是 能 8 0.0089 是 能 8 0.0088 是 能
9 0.0076 否 否 9 0.0078 否 否 9 0.0082 否 否
10 0.0028 否 否 10 0.0053 否 否 10 0.0063 否 否
2.2 不同时间低温处理对试管苗诱导率的影响
从表2可以看出,低温处理7、14、28、84d的气生鳞
茎,培养7d后,前3种处理的气生鳞茎诱导率基本相
近,分别为2.09%、2.16%、2.12%,而低温处理84d的
表2 不同时间低温处理试管苗的诱导率
Table 2 The induction rate of plantlets under
low temperature treatment with diferent time
诱导时间
Induction
time/d
诱导率Induction rate/%
低温处理7d
Low temperature
treatment for
7days
低温处理14d
Low temperature
treatment for
14days
低温处理28d
Low temperature
treatment for
28days
低温处理84d
Low temperature
treatment for
84days
7 2.09 2.16 2.12 0
14 15.24 17.35 14.86 0
21 26.83 47.47 42.72 2.24
28 49.2 65.24 48.11 19.24
35 55.62 73.47 44.68 27.75
42 61.35 77.26 42.24 30.26
49 64.24 79.71 36.85 32.71
56 67.79 82.60 36.85 33.24
63 71.43 81.66 34.24 36.57
70 68.61 81.66 34.24 38.65
气生鳞茎,培养7d后诱导率为0,到21d时才达到
2.24%,此时低温处理14d的气生鳞茎诱导率已经达到
47.47%;培养到第70天时,试管苗的诱导率分别为
68.61%、81.66%、34.24%、38.65%,显然低温处理14d
的气生鳞茎萌发率和试管苗的诱导率都高于其它低温
处理组。
2.3 大蒜气生鳞茎可以直接诱导试管苗
由图1可以看出,在接入诱导培养基7d后,气生鳞
茎的表面开始变绿(图B);生长14d后,部分气生鳞茎
的内部开始长出嫩芽(图C);21d后,气生鳞茎诱导生成
的苗逐渐长大,数量开始增多,诱导率逐渐增大(图D);
生长28d后,气生鳞茎诱导出的苗不断生长,出苗率不
断增加;发育至49d时,苗已长至10cm左右,生长强
壮、呈深绿色(图E-H)。每个宝坻大蒜的花苞平均含有
70颗气生鳞茎,其中65颗含有贮藏叶,可用于试管苗的
诱导,一个花苞平均可以获得试管苗40株(繁殖系数为
40),与用地蒜繁殖大蒜(繁殖系数为6)相比,效率提高
了6.67倍。
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北方园艺2014(23):79~82 ·生物技术·
注:A:气生鳞茎刚接入诱导培养基;B:生长7d;C:生长14d;D:生长21d;E:生长28d;F:生长35d;G:生长42d;H:生长49d。
Note:A:Aerial bulb vaccinate to inductive medium;B:growth for 7days;C:growth for 14days;D:growth for 21days;E:growth for 28days;F:growth for
35days;G:growth for 42days;H:growth for 49days.
图1 气生鳞茎诱导试管苗
Fig.1 Aerial bulbils induce plantlets
2.4 试管苗的生根培养
有9%的气生鳞茎试管苗在诱导培养基上出现生根
现象,但绝大多数的试管苗没有生根。将未生根的试管
苗接种在生根培养基上(MS基础培养基),6d后,部分
试管苗出现生根现象,继续培养到45d时,试管苗的生
根率达到95%以上(图2)。
图2 气生鳞茎试管苗的生根情况
Fig.2 Roots of plantlet induced from aerial bulils
2.5 试管苗练苗及移栽
为了提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其
光合作用的能力,促使组培苗健壮,移栽成活率高,试管
苗必需经过一段时间的练苗后方可移栽。该研究共移
栽试管苗330株,成活330株,成活率为100%。
2.6 气生鳞茎试管苗与地蒜染色体观察分析
从图3可以看出,A为大蒜根尖细胞分裂前期图,B
为细胞分裂中期图,能清晰的看出细胞中含有16条染
色体。C为细胞分裂后期图。D为气生鳞茎试管苗根尖
细胞分裂前期图,B为细胞分裂中期图,能清晰的看出细
胞中含有16条染色体。F为细胞分裂后期图。上述结
果说明,用气生鳞茎直接诱导的试管苗细胞染色体数
目、形态结构正常,诱导过程中没有发生染色体变异,进
一步说明不经过脱分化和再分化过程,对保持大蒜品种
的遗传特性有现实意义。
3 讨论
用大蒜愈伤组织进行脱毒和快繁虽然有诸多优点,
但大蒜愈伤组织在脱分化和再分化过程中普遍存在着
染色体的高变异率,Maggioni等[9]用叶片外植体诱导的
愈伤组织,只有45.9%的细胞是二倍体,其它为八倍体、
三倍体、四倍体、非整倍体,还有20%的细胞含很多染色
体。为了保持大蒜的遗传特性,同时又能进行大蒜的脱
毒、快繁,生产上常常用成熟的气生鳞茎做“种子”进行
大蒜提纯、复壮繁殖。张绍文等[10]对大蒜气生鳞茎利用
价值进行研究,发现用成熟的天蒜播种,其增殖倍数均
在30倍以上,但留天蒜植株的地蒜产量较不留株减产
22.6%~33.0%。该研究建立了用未成熟的气生鳞茎进
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注:A~C为大蒜根尖染色体观察;D-F为气生鳞茎试管苗根尖染色体观察。A:前期图;B:中期图;C:后期图;D:前期图;E:中期图;F:后期图。
Note:A-C observation of chromosome in garlic root tip;D-F observation of chromosome in plantlets root tip.A:prophase B:metaphase;C:anaphase;D:pro-
phase;E:metaphase;F:anaphase.
图3 大蒜和气生鳞茎试管苗染色体观察
Fig.3 Observation of chromosome in garlic root tip and plantlets root tip
行大蒜脱毒快繁的技术体系,在不影响地蒜生长的情况
下实现了大蒜快繁。
大蒜气生鳞茎的萌发受到贮藏时间、温度、气生鳞
茎大小、植物激素配比等多种因素的影响。低温处理时
间对气生鳞茎试管苗的诱导率有一定的影响,李小川
等[11]、Seabrook[12]认为气生鳞茎在4℃的低温条件下贮
藏一定的时间能够打破其休眠,促进试管鳞茎的萌发。
但该研究发现,虽然低温贮藏能够促进气生鳞茎的萌
发,但是低温贮藏时间有一定的限度,该研究用4℃低温
贮藏气生鳞茎14d,试管苗的诱导率最高能达到81.66%,
而随着贮藏时间的增加其诱导率逐渐降低,可能是由于
低温贮藏时间长,引起气生鳞茎内源代谢发生紊乱,从
而造成气生鳞茎的生理活性降低,因此低温贮藏时间应
在14d左右为宜。
参考文献
[1] 强芳英,王转军.大蒜气生鳞茎繁种复壮效果与技术[J].上海蔬菜,
2010(6):18.
[2] 于德才,李学湛,吕典秋,等.大蒜茎尖脱毒及快繁研究[J].北方园
艺,2005(6):84-85.
[3] 张昌伟,侯喜林,袁建玉,等.太仓大蒜根尖离体培养直接诱导不定
芽及试管鳞茎的形成[J].植物生理学通讯,2004,40(2):167-170.
[4] 杨乃博.大蒜全展叶愈伤组织的诱导和植株再生[J].植物生理学通
讯,l981(6):47-48.
[5] 周云罗,钱迎倩,蔡起贵,等.大蒜贮藏叶诱导愈伤组织及植株再生
[J].植物学报,1980,22(4):402-403.
[6] Mohamed Yasseen Y.In vitro bulb formation and plant recovery from
onion infloreseenees[J].Hortscienee,1993,28(10):1052.
[7] 栾非时,陈典,陈友.脱毒大蒜花原始体培养增殖技术的研究[J].中
国蔬菜,1995(3):4-6.
[8] 马雯,李唯,李金娟.贮藏时间和外源激素对大蒜气生鳞茎形成的影
响[J].湖南农业科学,2011(19):41-44,56.
[9] Maggioni L,Cordi C,Fogher C.Calus induction ploidy level and plant
regeneration in vitro garlic(Allium sativum L.)cultures[J].Journal of
Genetics and Breeding,1989,43(4):251-254.
[10]张绍文,孙治强,杨佳辉,等.大蒜气生鳞茎(天蒜)利用价值的研究
[J].中国蔬菜,1994(4):14-16.
[11]李小川,赵美华.大蒜鳞茎生长点离体培养诱导小鳞茎的形成[J].山
西农业科学,1996,24(3):59-60.
[12]Seabrook J E A.In vitor propagation and bulb formation of garlic[J].
Canadian Journal of Plant Science,1994,74:155-158.
Research on the Rapid Propagation System of Garlic Bulbils
WANG Zhen,FAN Bao-li,REN Chun-xue,GU Zeng-hui,LIU Xiao-ying,WANG Zhen-ying
(Colege of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387)
Abstract:Taking the bulbils of the Baodi garlic as materials,the conditions of the rapid propagation system were optimized
by comparing the diferent low temperatures processing time and diferent medium induction rate.The results showed
that the highest induction rate of plantlets was acquired when processed under low temperature for two weeks.The basic
MS medium was the best medium for root induction.Since bulbils induced plantlets without dediferentiation and
re-diferentiation process,so it would not produce genetic variation.
Keywords:Baodi garlic;bulbil;virus elimination;rapid propagation
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