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参薯多糖检测及其体外抗氧化能力研究



全 文 :收稿日期:2011-06-20
基金项目:陕西省科技厅“13115”工程中心项目(2010ZDGC-23-18)
作者简介:裴会鹏(1986-),男,河南安阳人,在读硕士研究生,研究方向:植物生物技术。E-mail:peihuipeng@eyou.com
*通讯作者:杨培君(1960-),男,陕西汉中人,教授,硕士,主要从事资源植物方面研究。E-mail:yang@snut.edu.cn
参薯多糖检测及其体外抗氧化能力研究
裴会鹏,黄 俊,吴凯旋,杨培君*
(陕西理工学院 生物科学与工程学院,陕西 汉中723001)
摘要:以参薯 (Dioscorea alata L.)块茎为研究材料,采用热水浸提、Savage法除蛋白、乙醇沉淀及
有机溶剂纯化的方法,获得参薯粗多糖。通过蒽酮-硫酸显色法测定参薯的多糖含量,研究了参薯
粗多糖体外对羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)的清除能力。结果表明:参薯多糖含量高达
19.17%,参薯粗多糖对羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)具有一定的清除活性,抗氧化能力与
多糖浓度之间存在良好的相关性。当粗多糖质量浓度分别达到9.0mg/mL和0.5mg/mL时,对
羟自由基和过氧化氢的清除率可达到100%。参薯多糖具有较好的体外抗氧化作用,是一种具有
开发价值的天然抗氧化剂。
关键词:参薯;多糖;体外抗氧化作用
中图分类号:Q946.3  文献标识码:A  文章编号:1004-3268(2011)11-0113-04
Determination and Antioxidant Activity in vitro of
Polysaccharides from Dioscorea alata
PEI Hui-peng,HUANG Jun,WU Kai-xuan,YANG Pei-jun*
(School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China)
Abstract:The tuber of Dioscorea alata was used as test material to determine the polysaccharide
and the antioxidant activity in vitro.The methods contained hot water extraction,Sevage removal
protein,precipitation by ethanol,purifying polysaccharide by organic solvents,producing polysac-
charide of D.alata.Moreover,the antioxidant activities in vitro of D.alatapolysaccharide on hy-
droxyl radicals(·OH)and hydrogen peroxide(H2O2)were researched with anthrone-sulfuric
acid colorimetric.The results indicated that the content of D.alata polysaccharide was 19.17%
and had a clearing ability on·OH and H2O2,the antioxidant activity was significantly correlated
with its concentration.The polysaccharide completely scavenged the hydroxyl and hydrogen per-
oxide free radicals when its mass concentration was 9.0mg/mL and 0.5mg/mL respectively.D.
alatacan be used as a resource of plant active polysaccharides with a strong antioxidant effect,
and can be exploited as a natural antioxidant.
Key words:Dioscorea alata L.;Polysaccharide;Antioxidant activity in vitro
  参薯 (Dioscorea alata L.)属薯蓣科薯蓣属多
年生草质缠绕藤本,又名大薯、脚板山药等[1]。参薯
块茎中含有薯蓣皂苷元、多糖、多酚等多种成分。薯
蓣属植物为重要的资源植物之一,薯蓣具健脾、补
肺、固肾、益精之功效[2]。有研究表明,薯蓣植物粗
提物对禁食大鼠和兔子有降血糖的作用,能控制四
氧嘧啶引起的高血糖,其乙醇提取物的水溶液部分
与降血糖活性有关[3]。传统的用药习惯,常将参薯
作为淮山药入药,《浙江省中药炮制规范》亦明确把
其列为淮山药的一个品种来源,而2010版《中国药
典》中没有记载。但参薯在形状、显微、理化鉴别上
与怀山药都有差异[4]。
多糖是一类重要的植物活性物质,是生命有机
体的重要组成部分,并与维持生命所需的多种生理
 河南农业科学,2011,40(11):113-116
 Journal of Henan Agricultural Sciences
DOI:10.15933/j.cnki.1004-3268.2011.11.028
功能有关,具有促进免疫、抗肿瘤、抗突变、降血脂、
抗病毒等作用。近年来,对植物活性多糖的研究倍
受关注,关于多糖的分离纯化、结构及生理活性等方
面已有报道,但关于参薯粗多糖体外抗氧化能力的
研究还未见报道。随着多糖研究的不断深入,活性
多糖将被应用于更多的领域,为人类健康和安全提
供更有利的帮助。本研究测定了参薯中多糖的含
量,探究了粗多糖体外抗氧化能力,旨在为综合评价
参薯的资源学地位提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
参薯块茎采自于陕西省城固县栽培种,块茎清洗
干净、切片,60℃干燥,粉碎,过0.63mm孔径筛备用。
葡萄糖、硫酸亚铁、双氧水、乙醇、乙醚、磷酸二氢钠、
磷酸氢二钠、蒽酮、硫酸、邻二氮菲等化学试剂均为国
产分析纯。
紫外分光光度计(UV-2550日本岛津)、旋转蒸发
仪(RV10德国IKA)、高速冷冻离心机、电子天平(梅
特勒AL204,精确度0.000 1g)、数显恒温水浴锅(北
京科伟)、移液器(芬兰大龙)、索氏提取仪等。
1.2 参薯多糖的提取与精制
准确称取20.0g参薯块茎粉末,用滤纸包好置于
索氏提取装置,加入乙醚(40~60℃)回流5h,挥干材
料中的乙醚。脱脂后的材料用95%乙醇200mL,
90℃回流1h,趁热抽滤,滤渣重复提取一次。挥干乙
醇后,按浸提温度100℃、浸提时间4h、料液比1∶20
(mg/mL)提取,将提取液冷却后离心,沉淀物按同样
条件重复一次,合并提取液。提取液旋转蒸发浓缩至
100mL左右,用Sevag法脱蛋白,离心,到无蛋白层出
现为止。收集的水层中加入4倍量的无水乙醇使得
醇含量达到80%,于4℃冰箱静置12h,抽滤,沉淀用
无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤多次,60℃烘干,置干
燥器中至恒定质量,备用。
1.3 葡萄糖标准曲线的绘制
1.3.1 标准溶液的配制 精确称取0.1g葡萄糖于
105~110℃烘干3h,冷却后用纯水溶解并定容于
100mL容量瓶,作为母液,分别吸取母液1.0mL、
2.0mL、3.0mL、4.0mL和5.0mL于5个50mL的容
量瓶中并定容。得到葡萄糖标准溶液的梯度为:
20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L。
1.3.2 蒽酮-硫酸溶液的配制 准确称取0.33g蒽
酮,加100mL浓硫酸,置于棕色瓶中,混合摇匀置于
冰箱中(现配现用)。
1.3.3 标准曲线的绘制 分别取纯水、20mg/L、
40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L葡萄糖标准
溶液各1.0mL于试管中,分别在冰水浴中缓慢加入
8.0mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液摇匀后于沸水浴中,水
浴10min后,迅速置于冰水浴中冷却,静置10min
后,在紫外-可见分光光度计上,于620nm检测。
1.4 参薯多糖含量制备
1.4.1 样品溶液的绘制 准确称取参薯粉末2.0g,
用95%乙醇90℃回流1h,趁热抽滤,滤渣重复提取
一次,挥干乙醇后的材料,按料液比1∶20(mg/mL),
提取温度100℃,提取时间4h,抽滤,滤渣按同样方法
重复提取一次,合并水提液,定容至250mL,再吸取
2.5mL定容至50mL容量瓶,得样品溶液。
1.4.2 样品溶液多糖含量测定 精密吸取1.4.1制
备的样品溶液1.0mL于试管中,按1.3项的方法测
定吸光度,用回归方程计算多糖浓度(C),按下面的公
式计算多糖含量。
多糖含量=CD/m×100%,式中:D为样品溶液
的稀释因素,m为材料质量。
1.4.3 重现性试验 精密称取同批参薯粉末5份各
2.0g,按1.4.1项的方法同时制备样品溶液。吸取
1.0mL样品液于试管中,按1.3项的方法测定吸光
度,计算参薯多糖含量。
1.4.4 精密度试验 精密吸取样品溶液1.0mL分
别置于试管,按1.3项的方法测吸光度,平行测
定5次。
1.4.5 稳定性试验 精密吸取样品溶液于试管中,
按1.3项的方法测定吸光度,每30min测一次,连续
测2h,考察稳定性。
1.4.6 回收率试验 准确吸取3份已知质量浓度的
供试样品溶液0.5mL于试管中,分别加入20mg/L、
40mg/L和60mg/L的标准葡萄糖溶液0.5mL,按
1.3项的方法测定吸光度值,按下式计算回收率。
回收率(%)=(加标试样测定值-试样测定值)/
加标量×100。
1.5 参薯多糖体外抗氧化作用
1.5.1 参薯粗多糖溶液制备 取1.2项制备的粗多
糖1.0g,定容至100mL得10mg/mL母液,然后再稀
释配制不同浓度的粗多糖溶液,备用。
1.5.2 参薯多糖对羟自由基(·OH)的清除体系 
采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[5],H2O2/Fe体系可以通
过Fenton反应产生·OH,·OH把邻二氮菲-Fe2+
水溶液氧化为邻二氮菲-Fe3+后,其536nm最大吸
收峰消失。取0.75mmol/L邻二氮菲溶液1.0mL,
加入150mmol/L、pH7.4磷酸缓冲液(PB)1.5mL充
·411· 河南农业科学 第40卷 
分混匀后,加入0.75mmol/L FeSO4 溶液1.0mL,每
加一管,立即混匀,加0.01% H2O21.0mL,最后以超
纯水补充至总体积为10.0mL。反应液37℃保温
1h,测定波长536nm处的吸光度A损伤。参薯多糖对
·OH清除作用,依上法,分别加入1.0mL不同质量
浓度多糖溶液后再加入0.01% H2O2,37℃保温1h,
测A加样。未损伤管为不加 H2O2 及多糖溶液。以维
生素C为对照。具体加样量见表1。
清除率(%)=[(A加样-A损伤)/(A未损伤-A损伤)]
×100。
表1 清除·OH多糖加样量 mL 
试剂 未损伤管 损伤管 样品管
邻二氮菲 1.0  1.0  1.0
磷酸缓冲液(PB) 1.5  1.5  1.5
FeSO4 1.0  1.0  1.0
不同质量浓度多糖或维生素C - - 1.0
H2O2 - 1.0  1.0
蒸馏水 6.5  5.5  4.5
总体积 10.0  10.0  10.0
1.5.3 参薯多糖对过氧化氢(H2O2)的清除体系[6]
 加入由50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.4)配制的
5mmol/L的H2O2 溶液2.8mL,再加入不同质量浓
度的多糖溶液1.0mL,用纯净水补齐至10.0mL,
25℃放置10min后,于波长230nm处测定吸光度值
A样品,对照为不加多糖溶液。以维生素C作为对照。
具体加样量见表2。
清除率(%)=(A样品-A对照)/A对照×100。
表2 清除H2O2 多糖加样量 mL 
试剂 对照管 样品管
H2O2 2.8  2.8
不同浓度多糖或维生素C - 1.0
蒸馏水 7.2  6.2
总体积 10.0  10.0
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线结果
依据1.3.3项测得吸光度(A)为横坐标,以葡萄
糖标准溶液的浓度梯度(C)为纵坐标做标准曲线。得
到标准曲线的回归方程C=353.26A+2.015 3,r2=
0.999 3。表明在20~100μg/mL范围内葡萄糖质量
浓度与吸光度具有良好的线性关系(图1)。
2.2 重现性试验结果
按照1.4.3项方法,在同等条件下进行5次重复
试验,得到的多糖含量为19.17%,RSD值为1.25%
(n=5),小于5%,表明本试验的重复性良好(表3)。
图1 葡萄糖标准曲线
表3 重现性试验结果(n=5)
项目
样品编号
1  2  3  4  5
多糖含量/% 19.05  19.08  18.88  19.46  19.37
RSD/% 1.25
2.3 精密度试验结果
按照1.4.4项方法,精密吸取样品溶液1.0mL分
别置于试管,按1.3项方法测吸光度,平行测定5次,得
到RSD=0.28%,小于5%,表明精密度良好(表4)。
表4 精密度试验结果(n=5)
项目
样品编号
1  2  3  4  5
多糖含量/% 19.04  19.08  19.07  19.01  19.15
RSD/% 0.28
2.4 稳定性试验结果
按照1.4.5项精密吸取样品溶液于试管中,按
1.3项方法测定吸光度,每30min测一次,连续测
2h,多糖含量在2h内基本保持不变,其RSD值为
3.35%,表明该方法稳定性良好(表5)。
表5 稳定性试验结果
项目
时间/h
0  0.5  1  1.5  2
吸光度(A) 0.211  0.212  0.210  0.199  0.198
RSD/% 3.35
2.5 加样回收率试验结果
准确吸取3份已知质量浓度的供试样品溶液
0.5mL于试管中,分别加入20mg/L、40mg/L和
60mg/L的标准葡萄糖液0.5mL,按1.3项方法测定
吸光度值,结果见表6,加样回收率达到97.29%,
RSD为1.00%。
表6 加样回收率试验结果(n=3)
样品
编号
样品含
量/μg
加入标
品量/μg
测得
值/μg
回收
率/%
平均回
收率/%
RSD/

1  10.0  47.94  98.40
2  38.10  20.0  57.48  96.90  97.29  1.00
3  30.0  67.07  96.57
·511· 第11期         裴会鹏等:参薯多糖检测及其体外抗氧化能力研究
2.6 参薯多糖对羟自由基(·OH)的清除活性
参薯多糖对 H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应
产生的·OH具有清除作用,且随质量浓度的增加,
清除率上升,二者呈正相关。当粗多糖质量浓度达
到9mg/mL时,清除率达到100%,作为对照的维
生素C为0.8mg/mL时,清除率已经达到100%,
根据半数有效浓度EC50[7],维生素C对·OH的清
除能力远远优于参薯多糖(图2)。
图2 参薯多糖和维生素C对·OH的清除能力
2.7 参薯多糖对过氧化氢(H2O2)的清除活性
参薯多糖和维生素C对H2O2 均有清除能力,且
随质量浓度增大,清除能力显著提高,呈较好的量效关
系,结果见图3。当粗多糖质量浓度达到0.5mg/mL
时清除率达到100%,对照维生素C为1.6mg/mL时
清除率达到100%。根据半数有效浓度EC50,参薯多糖
对H2O2的清除活性强于维生素C。
图3 参薯多糖和维生素C对H2O2 的清除作用
3 讨论
本试验结果表明,参薯粗多糖对羟自由基
(·OH)和过氧化氢(H2O2)都有一定的清除作用,
当粗多糖质量浓度达到9mg/mL时,对羟自由基清
除率达到 100%,当粗多糖质量浓度达到 0.5
mg/mL时,对过氧化氢清除率达到100%。维生素
C对·OH 的清除能力远远优于参薯多糖,但参薯
粗多糖对 H2O2 的清除活性强于维生素C。张泽庆
等[8]采用与本研究相同的方法研究了防风多糖对
·OH的清除作用,结果表明,在多糖质量浓度为
8.0mg/mL时,防风多糖对·OH 的清除率接近
70%,而参薯多糖在8mg/mL时,清除率就已经达
到80%,所以参薯多糖对·OH清除力强于防风多
糖。茹巧美等[9]研究了忽地笑多糖对 H2O2 的清除
作用,结果表明忽地笑多糖对 H2O2 的清除率达
50%时所需的质量浓度小于0.1mg/mL,而参薯多
糖清除 H2O2 的能力明显弱于忽地笑多糖。
根据试验结果可知,参薯块茎中的多糖含量高
达19.17%,与姜芳婷等[10]报道的广西参薯多糖含
量(17.56%)相近,较官波等[11]报道的山药多糖含
量(2.56%)高出数倍。并且参薯产量为7 500~
30 000kg/hm2,要高于同属植物产量,因此参薯可
作为一种植物活性多糖类药物源。
在提取参薯多糖的过程中,发现有大量黏液存
在,而在参薯黏液方面的研究还未曾报道。为确定
参薯的资源学地位,本研究还将在其他有效成分方
面进行研究,以期为参薯的综合开发和利用提供科
学依据。
参考文献:
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