全 文 ： ［收稿日期］ ２０１４－０６－１１；２０１４－０９－１９修回
［基金项目］ 贵州省教育厅自然科学研究重点项目“薏苡内生真菌的分离及其次生代谢产物活性研究”［黔教合ＫＹ字（２０１３）１９０］；贵州省
普通高等学校创新人才团队“民族药用生物资源研究与开发创新团队”［黔教合人才团队字（２０１３）３０］
［作者简介］ 张万芹（１９８２－），女，讲师，从事应用微生物学的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｑｉｎｚｈａｎｇ＠ｑｑ．ｃｏｍ
＊通讯作者：邱国俊（１９６０－），女，教授，从事医药药学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｘｎｚｗｅｉｘｉａｏ＠１６３．ｃｏｍ
［文章编号］１００１－３６０１（２０１４）１０－０６２０－０１５２－０６
薏苡种仁内生真菌的分离及其抗菌活性
张万芹１，文廷池２，邱国俊１＊
（１．兴义民族师范学院 生物与化学学院，贵州 兴义５６２４００；２．贵州大学 西南药用生物资源教育部工程研究
中心，贵州大学 贵州省生化工程中心，贵州大学 贵州省农业生物工程重点实验室，贵州大学 生命科学学
院，贵州 贵阳５５００２５）
［摘 要］为筛选薏苡种仁内生真菌的抗菌活性，采用组织分离法，从禾本科黍亚科蜀黍族薏苡种仁中
分离内生真菌，采用菌饼法筛选其抗菌活性。通过５．８ＳＩＴＳ 分子系统学鉴定菌种，高效液相色谱法
（ＨＰＬＣ）分析鉴定菌种发酵液正丁醇提取物次的生代谢产物。结果表明：分离共获得２３株薏苡种仁内生真
菌，其中，有弯孢霉属、链格孢属、砖孢属、茎点霉属、灰软盘菌属、稻黑孢属、玉蜀黍赤霉属、曲霉属及其他真
菌。５７％的菌株至少对测试菌株中的１种具有抗菌活性，且ＧＺＲ１９号菌株具有广谱抗菌活性并鉴定为１种
茎点霉（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．），其发酵液的次生代谢产物在该色谱条件下主要有４种物质含量较高，其中可能存在具
有抗菌活性的化合物。
［关键词］薏苡；种仁；内生真菌；分离；鉴定；抗菌活性
［中图分类号］Ｓ５６７．９；Ｑ９３９．１１ ［文献标识码］Ａ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎ
Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ Ｋｅｒｎｅｌｓ
ＺＨＡＮＧ Ｗａｎｑｉｎ １，ＷＥＮ Ｔｉｎｇｃｈｉ ２，ＱＩＵ Ｇｕｏｊｕｎ１＊
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｘｉｎｇｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｘｉｎｇｙｉ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５６２４００；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ ｋｅｒｎｅｌｓ ｗａｓ
ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ５．８ＳＩＴＳ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，ａｎｄ
ｆｉｎａｌｙ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｏｒ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ２３ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ， Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ， Ｄｉｃｔｙｏ－
ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃｆｕｎｇｉ，Ｐｈｏｍａ ｓｐ．，Ｍｏｌｌｉｓｉａ ｃｉｎｅｒｅａ，Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ ｏｒｙｚａｅ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ
ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ ａｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ．５７％ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｏｎｅ ｔｅｓｔ ｓｔｒａｉｎ ａｔ ｌｅａｓｔ．ＧＺＲ１９
ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐｈｏｍａ ｓｐ．ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｍａｉｎ ｆｏｕｒ
ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｏｒ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ
ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍａｙ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｆｏｕｒ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ；ｋｅｒｎｅｌ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙ
薏苡（Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－Ｊｏｂｉ）为禾本科黍亚科蜀
黍族一年生或多年生植物，是重要的药食兼用栽培
植物。其种子去除外壳和种皮入药，为薏仁（Ｓｅ－
ｍｅｎ Ｃｏｉｃｉｓ），又名薏苡仁、薏米、薏珠子等，最早记
载于《神农本草》，是历史悠久的常用中药［１］。其活
性物质具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、降血糖、免
疫调节等，以薏苡仁油为原料的康莱特注射液已用
于临床癌症治疗，并且经美国 ＦＤＡ批准进入治疗
非小细胞肺癌的二期临床试验［２－３］。
植物内生真菌是十分丰富的微生物类群。有文
献报道［４－５］，内生真菌系统地分布于植物体的各部分
组织、器官及细胞间隙中，其中叶、叶鞘和种子内的
真菌菌丝含量最多。近年来，药用植物内生真菌逐
渐成为新药或前体药物的潜在资源而广受关注。对
天然药物活性成分的筛选也是现代医药学的研究热
点，植物资源是天然药物的重要来源之一［６－７］。而内
生真菌由于能够产生同宿主植物类似的活性物质，
并能够产生多种次生代谢产物及易于发酵培养等特
点，成为新药或前体药物的潜在资源。自２０世纪
６０年代以来，国内外学者对薏苡的化学成分及药理
活性开展了多方面研究，首先是含薏苡仁酯活性成
分的康莱特注射液（ＫＬＴ）是得到普遍应用的抗肿
瘤药物，其作用机理是薏苡仁酯能抑制肿瘤血管的
生成［８］、诱导其细胞凋亡［９］、减少细胞有丝分裂，阻
止细胞增殖［１０－１１］等。另外，徐梓辉等［１２］通过酸水解
纸层析法测得具有降糖作用的薏苡仁多糖，有鼠李
贵州农业科学 ２０１４，４２（１０）：１５２～１５７
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖；Ｌｅｅ等［１３］用
甲醇从薏仁麸皮中分离出５种有抗肿瘤活性的内酰
胺类化合物等。目前，薏苡内生真菌及其次生代谢
产物的研究处于空白阶段。因此，对薏苡内生真菌
的研究是利用微生物对薏苡资源开发与研究新的思
路和方式。笔者从薏苡种仁中分离内生真菌，并对
其抗菌活性进行初步研究，为研究其次生代谢产物
提供一定的理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 分离材料 薏苡种子于２０１３年１０月采自
贵州省黔西南州娄纳地区，取材部位为去除外壳及
种皮的种仁。
１．１．２ 测试菌株 测试菌株购自中国典型培养物
保藏中心（ＣＣＴＣＣ），分别是大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、枯
草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）和酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａ－
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。
１．１．３ 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃
薯去皮２００ｇ，切成２ ｍｍ 小块，加蒸馏水煮沸
３０ｍｉｎ，４层纱布过滤，收集滤液，蒸馏水补充至
１ ０００ｍＬ，加葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，ｐＨ 自然，
１２１℃高压蒸汽灭菌３０ｍｉｎ。待分离培养基不烫手
时加１００Ｕ／ｍＬ青霉素和链霉素，马铃薯葡萄糖液
体发酵培养基去掉琼脂组分。牛肉膏蛋白胨培养
基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨１０ｇ，氯化钠５ｇ，琼脂１５ｇ，
蒸馏水１ ０００ｍＬ，ｐＨ ７．２，１２１℃高压蒸汽灭菌
３０ｍｉｎ。
１．１．４ 试剂与仪器 葡萄糖（分析纯，天津市津北
精细化工有限公司），琼脂粉、牛肉膏和蛋白胨（生化
试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司），青霉素、
链霉素（华北制药股份有限公司）。ＹＭ 系列不锈
钢（智能型）立式压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器
械有限公司），ＤＬ－ＣＪ－１Ｎ型超级洁净工作台（北京
东联哈尔仪器制造有限公司），ＸＳＰ－３生物显微镜
（上海普丹光学仪器有限公司），ＨＰＸ－９０８２ＭＢＥ电
恒温培养箱（常州市伟嘉仪器制造有限公司）等。
１．２ 种仁内生真菌的分离纯化
采用组织块法分离［１４］，选取秋季无病虫、无伤
口的新鲜成熟种子，去外壳及种皮，在超净工作台
上用 无 菌 水 洗 ６ 次， 解 剖 刀 将 种 仁 切 成
０．５ｍｍ×０．５ｍｍ小 块，置 于 ７５％ 的 乙 醇 浸 泡
３ｍｉｎ，无 菌 水 洗 ３ 次，用 ０．１％ 的 升 汞 处 理
２．５ｍｉｎ，无菌水洗３次，用解剖刀去除边缘，放在无
菌滤纸上吸干，再接入含有青霉素（１００Ｕ／ｍＬ）和
链霉素（１００Ｕ／ｍＬ）的马铃薯葡萄糖琼脂培养基
中，２８℃培养３～７ｄ，待切口处长出菌落，根据其形
态、颜色及长出时间的差异，采用尖端菌丝挑取法挑
取菌落边缘菌丝转接于新鲜马铃薯葡萄糖琼脂培养
基中，培养数日观察其菌落特征，并通过镜检无杂
菌，获得纯化菌落。种仁表面杀菌结束后采用漂洗
液检测法［１５］将漂洗液接种到分离培养基上作无菌
对照，同时采用组织印迹法［１６］将杀菌结束后的种仁
小块作印迹对照。
１．３ 种仁内生真菌的形态学鉴定
将培养７～１４ｄ的菌落，用油镜下观察不粗糙
且粘性好的胶带从菌落中心向边缘粘，７５％的乙醇
固定，乳酸石碳酸棉兰染液染色，盖上盖玻片，在油
镜（×１００）显微镜下观察菌丝及孢子等显微特征，对
照有关资料初步判定真菌的分类，分类检索参照文
献［１７］。
１．４ 种仁内生真菌的抗菌检测
采用菌饼法［７］对分离到的内生真菌进行抗菌检
测。测试菌的培养见参考文献［７］。菌饼的制备：将
内生真菌分别接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，于
２８℃培养７ｄ，用无菌９ｍｍ直径的试管口在酒精灯
下烧热印制菌饼备用。含指示菌培养基：用５ｍＬ
无菌生理盐水直接冲洗培养后的指示菌斜面，摇匀
后，采用血球计数法，将菌悬液浓度稀释到浓度为
１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黄色
葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、枯草芽孢杆菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ－
ｖｉｓｉａｅ）。取１００μＬ菌悬液快速倒入４０～５０℃的牛
肉膏蛋白胨培养基中，摇匀后迅速装到培养皿
（Φ９０）中，冷却后得到含有各指示菌的培养基。
将制备好的菌饼用接种针挑取置于含指示菌的
培养基上，长有菌丝的朝上，每个指示菌的培养皿中
放２～３个菌饼。置于３７℃的培养箱中恒温培养
２４ｈ，观察是否有抑菌圈，采用十字交叉法测其抑菌
圈直径。每株菌重复３次。
１．５ 种仁内生真菌的５．８ＳＩＴＳ分子鉴定
真菌基因组 ＤＮＡ的提取采用北京天根试剂盒
进行。ＰＣＲ扩增根据已知真菌的保守序列设计特
异性引物ＩＴＳ４与ＩＴＳ５，引物序列ＩＴＳ４，ＴＣＣＴＣ－
ＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ； ＩＴＳ５， ＧＧＡＡＧＴＡ－
ＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ均由上海生工生物工程
技术有限公司合成（ＰＡＧＥ纯化）。ＰＣＲ扩增反应
条件：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火
３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；最后７２℃延伸
５ｍｉｎ。基因组ＤＮＡ的序列工作由北京诺赛基因
组研究中心有限公司完成。测序的ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列
在ＧｅｎＢａｎｋ核酸序列数据库中进行Ｂｌａｓｔ比对，用
ＣｌｕｓｔａｌＸ １．８３软件对已测定的序列匹配排列，比对
后的序列用 Ｍｅｇａ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０５程序经１ ０００次
ｂｏｏｔｓｔｒａｐ统计学验证，构建系统树。
·３５１·
张万芹 等 薏苡种仁内生真菌的分离及其抗菌活性
ＺＨＡＮＧ Ｗａｎｑｉｎ ｅｔ ａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ Ｋｅｒｎｅｌｓ
１．６ 种仁内生真菌的发酵液提取
将薏苡内生真菌接种在１５个培养皿中培养
７ｄ，作为平板种子。用解剖刀将长满培养皿的真菌
制成０．５ｍｍ×０．５ｍｍ的菌块，将菌块接种在装有
１００ｍＬ马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，每瓶
接种２０个菌块，１２１ｒ／ｍｉｎ，２８℃下培养１４ｄ。用６
层纱布过滤，收集滤液，用正丁醇：滤液的体积比为
１∶１提取３次，旋转蒸发仪浓缩得浸膏。
１．７ 色谱分析条件
萃取液过０．４５μｍ滤头，在３３０ｎｍ下检测，选
择Ｄｉａｍｏｓｉｌ Ｃ１８ ５μｍ ２５０×４．６ｍｍ色谱柱进行分
离，选择乙腈作为有机相，水相为ｐＨ３．２的乙酸－乙
酸铵（乙酸铵１．２５ｍｏｌ／Ｌ），有机相１０％～１００％
（６０ｍｉｎ），进样２０μＬ观察出峰情况，３３０ｎｍ检测。
２ 结果与分析
２．１ 种仁内生真菌的分离
由表１可见，从薏苡种仁中共分离到的内生真
菌２３株，经过形态学初步判定（图１），分别为弯孢
霉属占４．３０％、链格孢属占１７．４０％、砖孢属占
４．３０％、茎 点 霉 属 占 １７．４０％、灰 软 盘 菌 属 占
４．３０％、稻 黑 孢 属 占８．７０％、玉 蜀 黍 赤 霉 属 占
８．７０％、曲霉属占８．７０％及无孢菌类内生真菌占
２１．６０％。
表１ 薏苡种仁内生真菌的分离结果
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣ．ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ ｋｅｒｎｅｌｓ
类别
Ｔｙｐｅｓ
数量／株
Ｎｕｍｂｅｒ
占种仁菌
株数的比列
Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ
从梗孢目 Ｍｏｎｉｌｉａｌｅｓ
暗梗孢科 Ｄｅｍａｔｉａｃｅａｅ
多孢亚科 Ｐｈｒａｇｍｏｓｐｏｒｏｉｄｅａｅ
弯孢霉属Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ １ ４．３０
从梗孢目 Ｍｏｎｉｌｉａｌｅｓ
暗梗孢科 Ｄｅｍａｔｉａｃｅａｅ
链格孢属Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ４ １７．４０
从梗孢目 Ｍｏｎｉｌｉａｌｅｓ
暗梗孢科 Ｄｅｍａｔｉａｃｅａｅ
砖格孢亚科
Ｄｉｃｔｙｏｓｐｏｒｏｉｄｅａｅ ｏｆ Ｄｅｍａｔｉａｃｅａｅ
砖孢属 Ｄｉｃｔｙｏ－ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ ｆｕｎｇｉ １ ４．３０
球壳孢目Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｄａｌｅｓ
球壳孢科 Ｐｈｙｌｏｓｔｉｃｔａ
茎点霉属Ｐｈｏｍａｓｐ ４ １７．４０
蜡钉菌目 Ｈｅｌｏｔｉａｌｅｓ
暗皮皿科 Ｍｏｌｉｓｉａｃｅａｅ
灰软盘菌属 Ｍｏｌｌｉｓｉａ ｉｎｅｒｅａ １ ４．３０
壳霉目Ｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｄａｌｅｓ
杯霉科 Ｄｉｓｃｅｌａｃｅａｅ
稻黑孢属 Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ ｏｒｙｚａｅ ２ ８．７０
肉座目 Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ
赤壳科 Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ
玉蜀黍赤霉属Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ ２ ８．７０
散囊菌目 Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓ
发菌科 Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ
曲霉属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ２ ８．７０
无孢菌类 ６ ２６．１０
注：Ａ，弯孢霉属；Ｂ，链格孢属；Ｃ，砖孢属。
Ｎｏｔｅ：Ａ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ；Ｂ：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ；Ｃ：Ｄｉｃｔｙｏ－ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ ｆｕｎｇｉ．
图１ 薏苡种仁内生真菌的孢子形态（×１００）
Ｆｉｇ．１ Ｓｐｏｒｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ
ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＣ．ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ ｋｅｒｎａｌｓ
２．２ 分离菌株的抗菌活性
２３ 株 薏 苡 种 仁 内 生 真 菌 编 号 为 ＧＺＲ１－
ＧＺＲ２３，其中有ＧＺＲ１１、ＧＺＲ１４、ＧＺＲ１９、ＧＺＲ２１号
菌株具有广谱的抗菌活性（表 ２），对大肠杆菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏ－
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酿酒
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）均有明显抗性；
ＧＺＲ３、ＧＺＲ６号菌株对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ－
ｌｉ）、金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、枯草
芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）有明显抗性；ＧＺＲ１６号
菌株对枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酿酒酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）有 抗 性；ＧＺＲ５、
ＧＺＲ１０、ＧＺＲ １５、ＧＺＲ ２０、ＧＺＲ ２２、ＧＺＲ ２３对金黄
·４５１·
贵 州 农 业 科 学
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
表２ 薏苡种仁内生真菌的抗菌活性
Ｔａｂｌｅ ２ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｆｒｏｍＣ．ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ ｋｅｒｎｅｌｓ
菌株 编号
Ｎｏ．ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ
抑菌圈大小／ｍｍ Ｓｉｚｅ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ
大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 酿酒酵母
ＧＺＲ１ － － － －
ＧＺＲ２ － － － －
ＧＺＲ３ １２．００±０．１２ １２．００±０．１７ １１．２５±０．１１ －
ＧＺＲ４ － － － －
ＧＺＲ５ － １１．２５±０．１５ － －
ＧＺＲ６ １０．２５±０．１１ １０．２５±０．１７ １１．００±０．１２ －
ＧＺＲ７ － － － －
ＧＺＲ８ － － － －
ＧＺＲ９ － － － －
ＧＺＲ１０ － １１．００±０．１２ － －
ＧＺＲ１１ １８．００±０．１３ １８．５０±０．１５ １２．００±０．１９ １３．００±０．１２
ＧＺＲ１２ － － － －
ＧＺＲ１３ － － － －
ＧＺＲ１４ １９．００±０．１６ １６．５０±０．１２ １２．２５±０．１０ １４．５０±０．１１
ＧＺＲ１５ － １７．００±０．１７ － －
ＧＺＲ１６ － － １０．００±０．１９ ９．７５±０．１８
ＧＺＲ１７ － － － －
ＧＺＲ１８ － － － －
ＧＺＲ１９ ２０．５０±０．１５ １８．５０±０．１９ １２．５０±０．１２ １５．５０±０．１３
ＧＺＲ２０ － １０．７５±０．１８ － －
ＧＺＲ２１ １８．５０±０．１１ １８．５０±０．１５ １２．７５±０．１９ １４．００±０．１７
ＧＺＲ２２ － １０．７５±０．１２ － －
ＧＺＲ２３ － １０．００±０．１９ － －
注：“－”表示无明显抑菌圈。
Ｎｏｔｅ：“－”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ．
注：Ａ，ＧＺＲ１９号菌株菌饼背面对酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）的抗性形成的抑菌圈；Ｂ，ＧＺＲ１９号菌株菌饼背面对金黄色葡萄球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）的抗性形成的抑菌圈；Ｃ，ＧＺＲ１９号菌株菌饼背面对枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）的抗性形成的抑菌圈；Ｄ，ＧＺＲ１９
号菌株菌饼背面对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）的抗性形成的抑菌圈；Ｅ，ＧＺＲ１９号菌株的菌落表面图片；Ｆ，ＧＺＲ１９号菌株的菌落背面图片；Ｇ，
ＧＺＲ１９号菌株的发酵液。
Ｎｏｔｅ：Ａ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｔｏ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｂ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｔｏ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｃ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｔｏ Ｂａｃｉｌ－
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｄ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ，ｃｏｌｏｎｙ ｓｕｒｆａｃｅ；Ｆ，ｃｏｌｏｎｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｉｄｅ；Ｇ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｏｒ．
图２ ＧＺＲ１９号菌株的抗菌性、菌落以及发酵液
Ｆｉｇ．２ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｏｒ ｏｆ ＧＺＲ１９ｓｔｒａｉｎ
·５５１·
张万芹 等 薏苡种仁内生真菌的分离及其抗菌活性
ＺＨＡＮＧ Ｗａｎｑｉｎ ｅｔ ａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ Ｋｅｒｎｅｌｓ
图３ ＧＺＲ １９号菌株及其参考菌株的ｒＤＮＡ ＩＴＳ序列的系统树
Ｆｉｇ．３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｒＤＮＡ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ ＧＺＲ１９ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ
色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）有明显抗性。
具有抗菌活性的菌株占总体分离到菌株数的
５６．５％，其中，ＧＺＲ１９号菌株抑菌效果明显高于其
他菌株（图２）。
图４ ＧＺＲ１９号菌株发酵液的正丁醇萃取物组分
Ｆｉｇ．４ Ｂｕｔａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｒｏｔｈ ｏｆ ＧＺＲ１９
２．３ 广谱抗菌活性菌株ＧＺＲ１９号的分子鉴定
在培养基上，ＧＺＲ１９号菌株的产孢结构不明
显，分子系统学（图３）分析显示，该菌株为１种茎点
霉（Ｐｈｏｍａ ｓｐ．）。
２．４ ＧＺＲ １９号菌株发酵液正丁醇提取液组分
在该条件下，正丁醇提取物中主要有４个组分
含量较高（图４），分别为１号、３号、４号和５号峰，
其含量为１号１％～１‰、３号０．５％～０．５‰、４号
０．２％～０．２‰和５号０．０４％～０．００４‰。另外，各
物质在２５０ｎｍ处具有更好的灵敏度，紫外光谱下
该溶剂体系获得了２３９种物质，即该浸膏至少含有
２３９种物质。
３ 结论与讨论
植物内生真菌在植物各组织中普遍存在，且数
量丰富。在分离薏苡种仁内生真菌的过程中，为获
得最大数量的内生真菌，采样时选取无病害、已成熟
且种外壳稍带黄色的种子。种仁表面杀菌处理后，
结合冲洗液检验法和组织印迹法检验种仁表面消毒
效果。在试验中可能有部分薏苡种仁内生真菌未被
分离出来；若改变培养基或培养条件，可能会发现这
些内生真菌。但要尽可能全部分离出薏苡种仁的内
生真菌，还需要进一步研究。
研究表明，从植物内生真菌分离的生物活性物
质５１％是以前未发现的化合物［１８］。因此，植物内生
真菌因其次生代谢产物丰富而成为应用前景广阔的
微生物资源。利用菌块对峙法初步筛选病原菌拮抗
菌的优点是直观、简便、成本低，是体外有效筛选活
·６５１·
贵 州 农 业 科 学
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
性内生真菌的方法，其拮抗带宽度或抑菌圈直径是
评价抑菌活性的重要参考指标。抗菌活性试验表
明，超过分离的５０％以上的薏苡种仁内生真菌至少
对１种测试菌株有抗菌活性，说明薏苡种仁内生真
菌抗菌活性普遍存在，并且其次生代谢产物中含有
抑菌活性的化学物质。尤其是ＧＺＲ１９号菌株，其对
４种指示菌株的抑菌圈明显大于其他菌株，可能其
次生代谢产物活性成分含量明显高于其他菌株，或
含有其他抑菌效果的化学物质。需大量发酵培养，
追踪其分离得到其具有抗菌活性的化学成分。ＩＴＳ
序列比对，鉴定 ＧＺＲ１９号菌株为茎点霉（Ｐｈｏｍａ
ｓｐ．）。ＨＰＬＣ对其次生代谢产物正丁醇提取液进行
初步分析显示，有４种组分含量较高，正在进行大量
发酵，下一步希望找到其具有活性成分的化合物。
［参 考 文 献］
［１］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草
［Ｍ］．８版．上海：上海科学技术出版社，１９９９：３２９．
［２］ Ｎｏｒｍｉｌｅ Ｄ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆａｃｅ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉ－
ｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，２９９（５６０４）：１８８－１９０．
［３］ 杨 爽，王李梅，王姝麒，等．薏苡化学成分及其活性
综述［Ｊ］．中药材，２０１１，３４（８）：１３０６－１３１１．
［４］ Ｐｅｌａｅｚ Ｆ，Ｃｏｌａｄｏ Ｊ，Ａｒｅｎａｌ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ
ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｌｉｖｉｎｇ ｏｎ ｇｙｐｓｕｍ ｓｏｉｌｓ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｓｅｃ－
ｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｌｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｍｙ－
ｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，１０２：７５５－７６１．
［５］ Ｌｉａｎｇ Ｄ Ｇ，Ｋｅｖｉｎ Ｄ，Ｈｙｄｅ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｘｏ－
ｎｏｍｉｃ ｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗｉｔｈｉｎ ｆｒｏｎｄ ｔｉｓ－
ｓｕｅｓ ｏｆ Ｌｉｖｉｓｔｏｎａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００１，２０
（１）：１－１３．
［６］ 杨明琰，田 稼，马 瑜，等．杜仲内生真菌的分离鉴
定及抗菌活性研究［Ｊ］．西北植物学报，２０１２，３２（１）：
０１９３－０１９８．
［７］ 刘 果，马养民，张弘弛．三尖杉内生真菌分离鉴定及
其抗菌活性研究［Ｍ］．中国药学杂志，２０１３，４８（３）：
１６５－１７０．
［８］ 姜晓玲，张 良，徐卓玉，等．薏苡仁注射液对血管生
成的影响［Ｊ］．肿瘤，２０００，２０（４）：３１３－３１４．
［９］ 韦长元，李 挺，唐宗平，等．薏苡仁提取物对人肝癌
细胞增殖、凋亡及ｐ５３表达的影响［Ｊ］．广西医科大学
学报，２００１，１８（６）：７９３－７９５．
［１０］ 韩苏夏，朱 青，杜蓓茹，等．薏苡仁酯诱导人宫颈癌
ＨｅＬａ细胞凋亡的实验研究［Ｊ］．肿瘤，２００２，２２（６）：
４８１－４８２．
［１１］ Ｃｈａｎｇ Ｈ Ｃ，Ｈｕａｎｇ Ｙ Ｃ，Ｈｕａｎｇ Ｗ Ｃ．Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａ－
ｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｌａｙ ｓｅｅｄ ｏｎ ｌｕｎｇ
ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，
２００３，５１（１２）：３６５６－３６６０．
［１２］ 徐梓辉，周世文，黄林清，等．薏苡仁多糖的分离提取
及其降血糖作用的研究［Ｊ］．第三军医大学学报，
２０００，２２（６）：５７８－５８１．
［１３］ Ｌｅｅ Ｍ Ｙ，Ｌｉｎ Ｈ Ｙ，Ｃｈｅｎｇ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒ－
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｌａｃｔａｍ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｌｕｎｇ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｌａｙ（Ｃｏｉｘ ｌａｃｈｒｙ－
ｍａｌ－ｊｏｂｉ Ｌ．ｖａｒ．ｍａ－ｙｕｅｎ Ｓｔａｐｆ）ｂｒａｎ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．
Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２００８，４６（６）：１９３３－１９３９．
［１４］ 黄 芳，韩 婷，秦路平．牡荆内生真菌的分离与鉴定
［Ｊ］．中国中药杂志，２０１１，３６（１４）：１９４５．
［１５］ 王 维，马养民，张弘弛．藏药黑果枸杞内生真菌的分
离鉴定及抑菌活性研究［Ｊ］．中国药学杂志２０１３，４８
（４）：２６２－２６６．
［１６］ 毕江涛，潘润霞，王 静，等．濒危药用植物南方山荷
叶内生真菌分离及其抑菌活性初步研究［Ｊ］．时珍国
医国药，２０１３，２４（３）：６１８－６２０．
［１７］ 魏景超．真菌鉴定手册［Ｍ］．上海：上海科学技术出版
社，１９８２：１２．
［１８］ Ｓｔｒｏｂｅｌ Ｇ Ａ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ａｓ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ，２００３，５（６）：５３５－５４４．
（责任编辑：刘忠丽）
·７５１·
张万芹 等 薏苡种仁内生真菌的分离及其抗菌活性
ＺＨＡＮＧ Ｗａｎｑｉｎ ｅｔ ａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ Ｋｅｒｎｅｌｓ