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红托竹荪多糖的提取工艺及其体外抗氧化活性



全 文 : [收稿日期] 2012-08-27;2012-10-20修回
 [基金项目] 贵州省固体废弃物综合利用科技创新人才团队项目(黔科合人才团队(2010)4011)
 [作者简介] 叶 敏(1979-),女,硕士,从事中草药活性成分的分离与纯化。
[文章编号]1001-3601(2012)12-0760-0172-04
红托竹荪多糖的提取工艺及其体外抗氧化活性
叶 敏
(毕节学院 化学与化工学院,贵州 毕节551700)
  [摘 要]为探明红托竹荪多糖的提取工艺及其体外抗氧化活性,采用水提醇沉法提取多糖,以多糖提
取率为考察指标,通过单因素试验和正交试验,确定红托竹荪多糖的提取工艺条件;采用分光光度法测定多
糖对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用以及还原能力。结果表明,红托竹荪多糖提取的最佳工艺条
件为料液比1∶25(g/mL),在80℃下提取3h,提取2次,红托竹荪多糖具有较好的还原能力,对·OH和
O-2 ·具有较强的清除作用,其IC50值分别为0.51mg/mL和0.83mg/mL。结论:红托竹荪多糖具有明显
的体外抗氧化活性。
[关键词]红托竹荪;多糖;提取工艺;抗氧化活性
[中图分类号]Q539 [文献标识码]A
Extraction Technology and in vitro Antioxidant Activity of
Polysaccharides from Dictyophora rubrovalvata
YE Min
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Bijie University,Bijie,Guizhou551700,China)
  Abstract:To explore the extraction technology and in vitro antioxidation of polysaccharides from
D.rubrovalvata.On the basis of single-factor experiments,the optimal extraction conditions of
D.rubrovalvata polysaccharides by water extraction and alcohol precipitation were investigated with
orthogonal experimental design.Meanwhile,the spectrophotometry was used to measure polysaccharides
to hydroxyl free radicals and superoxide free radical scavenging effect and reducing power.The results
showed that the optimal conditions were the ratio of solid-liquid 1∶25(g/mL),extraction temperature
80℃,extraction time 3h,extraction twice.The reducing power was excelent and the D.rubrovalvata
polysaccharides had powerful ability to clear off hydroxyl free radicals(IC50=0.51mg/mL)and superoxide
free radicals(IC50=0.83mg/mL).Conclusion:D.rubrovalvata polysaccharides has significant in vitro
antioxidation.
Key words:Dictyophora rubrovalvata;polysaccharides;extract technology;antioxidant activity
  红托竹荪(Dictyophora rubrovalvata)是藏穆
等于1976年在云南发现并命名的新种,是中国特产
的竹荪种类,主要分布在贵州、云南等高山地区的刚
竹等林下[1]。红托竹荪是竹荪家族中的珍品,不仅
外形美丽,营养丰富,而且味道鲜美,深受消费者欢
迎,是市场上商品价格较高的一类食用真菌。研究
发现,食用菌多糖能提高机体免疫能力,能激活和提
高网状内皮系统(RES)、巨噬细胞的吞噬能力,能清
除老化细胞和异物,直接杀灭肿瘤细胞,还可以活化
T、B淋巴细胞,促进干扰素和白细胞介素的产生而
抑制肿瘤的生长[2]。近年来对红托竹荪的研究发
现,其中含有多种氨基酸、维生素、多糖和多种无机
盐等。除其营养价值外,同时还具有一定的防病保
健作用,多糖是红托竹荪子实体中的重要组成成分
之一[3]。目前国内对红托竹荪生物学特性和栽培技
术的研究报道较多,但对其活性研究相对较少,贵州
省毕节地区为我国红托竹荪的主产地之一,对红托
竹荪的开发研究刻不容缓。因此,试验对其中的红
托竹荪多糖进行提取,并对其体外抗氧化作用进行
了研究,以期对红托竹荪多糖资源的开发利用提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 红托竹荪子实体(购于毕节地
区织金县),50℃烘干后粉碎成粉末。
1.1.2 主要试剂 葡萄糖(中国药品生物制品检
定所),蒽酮,浓硫酸,NaNO2、Al(NO3)3、乙醇、邻二
氮菲、邻苯三酚、铁氰化钾、三氯乙酸等均为分析纯。
1.2 仪器
电子分析天平FA2004N(上海菁海仪器有限公
司),可见分光光度计 V-5800,(上海元析仪器有限
公司),离心机800(金坛市富华有限公司),旋转蒸
发器RE-2000B(上海亚荣生化仪器厂),电热干燥
箱202-3(金坛市精达仪器制造厂)。
1.3 方法
1.3.1 红托竹荪多糖的提取[4] 称取红托竹荪粉
末5g,置于圆底烧瓶中,按一定的料液比,水浴温度
 贵州农业科学 2012,40(12):172~175
 Guizhou Agricultural Sciences
和浸提时间在热水浴中浸提数次,过滤,合并浸提
液,减压浓缩。在浓缩液中加入95%乙醇调至乙醇
终浓度为80%,醇沉、离心,沉淀依次用无水乙醇、
丙酮、无水乙醚洗涤,干燥后得粗多糖。将粗多糖用
蒸馏水溶解,sevage法游离蛋白,离心、沉淀、干燥
得精制粗多糖。
多糖提取率=
粗多糖质量
原料质量 ×100%
  1)单因素试验。A,料液比。准确称取红托竹
荪粉末5g,以水为提取剂,在80℃水浴中浸提3h,
改变料液比,考察料液比对红托竹荪多糖提取率的
影响。B,浸提温度。准确称取红托竹荪粉末5g,
以水为提取剂,按1∶30的料液比浸提3h,提取1
次,改变温度,考察浸提温度对红托竹荪多糖提取率
的影响。C,浸提时间。准确称取红托竹荪粉末5
g,以1∶30的料液比用水在80℃浸提1次,提取不
同时间,研究浸提时间对红托竹荪多糖提取率的影
响。D,提取次数。准确称取红托竹荪粉末5g,以
1∶30的料液比用水在80℃浸提3h,提取不同次
数,研究提取次数对红托竹荪多糖提取率的影响。
2)正交试验。在单因素试验结果的基础上,以
多糖提取率为考察指标,选取料液比(A)、浸提时间
(B)、浸提温度(C)、提取次数(D)作为考察因素进行
正交试验。正交试验设计见表1。
表1 红托竹荪多糖提取工艺正交试验设计
 Table 1 Orthogonal test design Extraction technology
of D.rubrovalvata polysaccharides
水平
Level
A料液比/
(g/mL)
Solid-
liquid ratio
B浸提
时间/h
Extraction
time
C浸提
温度/℃
Extraction
temperature
D提取
次数
Extraction
frequency
1  1∶20  2  60  1
2  1∶25  3  70  2
3  1∶30  4  80  3
1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制[5] 精确称取
105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100mg,用蒸馏
水溶解定容至100mL容量瓶中,配成1mg/mL的
葡萄糖标准溶液。分别吸取葡萄糖标准溶液0mL、
0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL于6支
10mL具塞管中,用蒸馏水补至1.00mL,摇匀,在
冰水浴中缓慢加入4.00mL蒽酮-硫酸试剂,摇匀,
冷却后置于沸水浴中反应10min,取出,立即用水
冷却至室温,于625nm波长处测定吸光度(以第1
管作为空白)。以吸光度为纵坐标,葡萄糖标准溶液
质量浓度为横坐标绘制标准曲线,得到回归方程
y=6.814x+0.0758,R2=0.995 5。
1.3.3 红托竹荪多糖的含量测定 精密称取
0.02mg粗多糖,加水溶解并定容至100mL容量瓶
中,取1mL,按1.3.2的方法测定吸光度,并按标准
曲线计算多糖含量。
1.3.4 红托竹荪多糖体外抗氧化作用的测定
1)还原能力的测定[6]。取不同浓度多糖样品
溶液1mL,加入2.5mL磷酸盐缓冲溶液(pH 6.6)
和2.5mL 1%铁氰化钾溶液,摇匀,于50℃水浴中
保温20min后取出,再加入2.5mL 10%三氯乙酸
溶液,混合后离心,取上清液2.5mL并加入2.5mL
蒸馏水和0.5mL 0.1%三氯化铁溶液,迅速混匀
后,在700nm波长处测吸光度,吸光度的大小则反
映了样品还原能力的大小。
2)清除羟自由基(·OH)的能力测定。多糖对
羟自由基的清除作用实验按照文献[7]的方法进行。
在1.5mL 5mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液中加
入4.0mL 0.75mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4),
充分混匀后加入 7.5 mmol/L 硫酸亚铁溶液
1.0mL,每加1种试剂立即摇匀,然后加入2.5mL
不同浓度的多糖样品溶液,最后加入1%H2O21.0
mL。将反应液于37℃水浴中保温1h,在536nm
处测吸光度A(样品)。空白组以等体积的蒸馏水代
替样品溶液测吸光度A(空白);对照组以蒸馏水代
替1%H2O2和样品溶液测吸光度A(对照),按下式
计算多糖对羟自由基的清除率:
清除率=A
(样品)-A(空白)
A(对照)-A(空白)×100%
  3)清除超氧阴离子自由基(O-2 ·)能力的测
定[8-9]。取 50 mmol/L Tris-HCl 缓 冲 溶 液
(pH 8.2)4.5mL,加入4.2mL蒸馏水,混匀后在
25℃水浴中保温20min,取出后立即加入在25℃水
浴中预热的 3 mmol/L 邻苯三酚 0.3 mL,(以
10mmol/L HCl代替邻苯三酚作为空白),迅速摇
匀后倒入比色管中,在325nm下每隔30s测定吸
光度,计算线性范围内每分钟吸光度的增加。样品
管在加邻苯三酚前,先加样品溶液1mL,蒸馏水补
充体积。按下式计算多糖对羟自由基的清除率:
清除率=ΔA0-ΔAΔA0
×100%
  公式中,ΔA0 为邻苯三酚自氧化速率,△A为
加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率,单位均为
吸光度每分钟的增加值。
2 结果与分析
2.1 不同因素对红托竹荪多糖提取率的影响
2.1.1 料液比 由图1可知,多糖提取率随料液
比增加而增大。当料液比为1∶30时,提取率为
7.42%,继续增大料液比,提取率趋于稳定,料液比
越大,浓缩时间越长,花费成本越高,故提取时料液
比选择1∶30。
2.1.2 浸提温度 当温度小于80℃时,多糖的提
取率随温度的增加而增加,温度超过80℃,提取率
有所下降(图1),可能是因为温度过高,使多糖分
解。
2.1.3 浸提时间 当浸提时间小于3h,多糖提取
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 叶 敏 等 红托竹荪多糖的提取工艺及其体外抗氧化活性
 YE Min et al Extraction Technology and in vitro Antioxidant Activity of Polysaccharides from Dictyophora rubrovalvata
图1 不同料液比、浸提温度、浸提时间、提取次数红托竹荪多糖的提取率
Fig.1 Effect of different ratio of solid-liquid、temperature、time、extraction frequency on yield of polysaccharides
率随着时间的增加而增加。但超过3h,提取率增
加不明显(图1),说明多糖基本上全部溶于热水中,
提取在3h已基本上达到平衡。
2.1.4 提取次数 由图1可知,多糖提取率随着
浸提次数的增加而增加。提取至第4次时,提取率
有所下降,说明多糖已基本提尽。
2.2 红托竹荪多糖提取的最佳工艺
由表2可知,料液比(A)、浸提时间(B)、浸提温
度(C)、提取次数(D)4个因素对多糖提取率的主次
影响顺序为C>B>D>A,并得到最佳工艺条件为
料液比1∶25(g/mL),浸提时间3h,浸提温度
80℃,提取2次,即A2B2C3D2。在此最佳提取条件
下进行验证试验,测得红托竹荪多糖的提取率为
7.23%。
表2 红托竹荪多糖提取的正交试验结果L9(34)
Table 2 The result of extraction to D.rubrovalvata polysaccharides in L9(34)orthogonal test
试验编号
No.
A料液比/(g/mL)
Solid-liquid ratio
B浸提时间/h/
Extraction time
C浸提温度/℃/
Extraction temperature
D提取次数
Extraction frequency
多糖提取率(%)
Extraction yield
1  1  1  1  1  5.36
2  1  2  2  2  6.98
3  1  3  3  3  7.12
4  2  1  2  3  5.98
5  2  2  3  1  7.03
6  2  3  1  2  6.51
7  3  1  3  2  6.62
8  3  2  1  3  5.99
9  3  3  2  1  6.29
k1 6.487  5.987  5.953  6.227
k2 6.507  6.667  6.417  6.703
k3 6.300  6.640  6.923  6.363
R  0.207  0.680  0.970  0.476
图2 红托竹荪多糖的体外抗氧化性
Fig.2 The in vivo antioxidation of D.rubrovalvata polysaccharides
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2.3 体外抗氧化性
2.3.1 还原能力 还原能力考察了活性物质提供
电子或氢原子的能力,它是物质抗氧化能力的一种
表现形式[8]。由图2可知,随红托竹荪多糖浓度的
增加,吸光度逐渐增加,表明其还原能力随着浓度增
加而增大。
2.3.2 对羟自由基的清除能力 羟自由基是目前
已知的氧化性最强的自由基,反应性极强,几乎可以
和所有细胞成分发生反应,对机体危害极大[8]。由
图2可知,红托竹荪多糖对羟基自由基的抑制能力
随着浓度的增加而增强,不同浓度的红托竹荪多糖
对羟自由基均具有一定的抑制能力。红托竹荪多糖
对羟 自 由 基 的 半 数 抑 制 质 量 浓 度 (IC50)为
0.51mg/mL。结果表明,红托竹荪多糖具有明显
的抑制羟自由基的能力。
2.3.3 对超氧阴离子自由基的清除作用 如图2
所示,红托竹荪多糖对超氧阴离子自由基的清除作
用随着多糖浓度的增加而增加,当红托竹荪多糖的
浓度为0.8mg/mL,对超氧阴离子自由基的清除作
用达50%,多糖在大于1mg/mL时,随浓度的增
加,其清除率的增加变缓。对超氧阴离子自由基的
半数抑制质量浓度(IC50)为0.83mg/mL,结果表
明,红托竹荪多糖对超氧阴离子具有明显的清除作
用。
3 讨论与结论
自由基是细胞正常代谢的产物,但过多的活性
氧自由基通过脂质过氧化反应破坏DNA、抑制蛋白
质合成,对各种生物大分子具有潜在的危险并导致
许多疾病的产生。自由基种类较多,其中以·OH
和O-2 ·的危害最严重[10]。因此,清除自由基的抗
氧化剂的研究普遍受到人们的关注,其中寻找安全、
有效的天然抗氧化剂已成为当前研究的热点。
试验采用水提醇沉法提取了红托竹荪多糖并研
究其体外抗氧化活性。得到最佳工艺条件为料液比
1∶25(g/mL),在80℃下提取3h,提取2次,在此
最佳提取条件下进行试验验证,测得红托竹荪多糖
的提取率为7.23%。通过测定还原力、超氧阴离子
自由基和羟自由基的清除率试验来评价红托竹荪多
糖的抗氧化活性,结果表明,红托竹荪多糖具有较好
的还原能力和自由基清除效果。随着多糖浓度的增
加,其还原能力和抑制自由基能力有一定程度的提
高,从IC50的效果来看,红托竹荪多糖对羟自由基的
清除率高于对超氧阴离子的清除效果。说明红托竹
荪多糖具有明显的体外抗氧化活性。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:孙小岚)
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