全 文 ：书　［收稿日期］　２０１５－０８－１７；２０１６－０３－０４修回
　［基金项目］　贵州省科技厅、毕节市科技局、毕节学院科技联合基金项目“红托竹荪多糖的分离纯化及其药理活性研究”［黔科合Ｊ字ＬＫＢ
（２０１２）０６］
　［作者简介］　叶　敏（１９７９－），女，副教授，从事天然产物生物活性研究。Ｅ－ｍａｉｌ：２８７１９８６１＠ｑｑ．ｃｏｍ
［文章编号］１００１－３６０１（２０１６）０５－０２２１－０１３１－０４
不同方法对红托竹荪多糖的脱蛋白效果
叶 敏１，文 竹１，王 庆２，薛天乐２，梁光伟１
（１．毕节学院 化学工程学院，贵州 毕节５５１７００；２．亳州职业技术学院，安徽 亳州２３６８００）
　　［摘　要］为保证多糖的药理活性，以蛋白脱出率和多糖损失率为考察指标，比较Ｓｅｖａｇ法、ＴＣＡ法、木
瓜蛋白酶法和酶－Ｓｅｖａｇ联用法对红托竹荪粗多糖脱蛋白的效果。结果表明：木瓜蛋白酶法脱蛋白效果最
佳，其最佳脱蛋白条件为木瓜蛋白酶浓度４％、酶解温度５５℃、酶解时间３ｈ，酶液ｐＨ　６．０，在此条件下，蛋白
脱出率为７７．９７％，多糖损失率为１９．３１％。该法用于脱除红托竹荪多糖蛋白质的工艺简单，成本低，具有一
定的应用价值。
［关键词］红托竹荪；多糖；脱蛋白方法
［中图分类号］Ｓ３９；ＴＳ２０１ ［文献标识码］Ａ
Ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ　ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ
Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｂｙ　Ｄｉｆｅｒｅｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＹＥ　Ｍｉｎ１，ＷＥＮ　Ｚｈｕ１，ＷＡＮＧ　Ｑｉｎｇ２，ＸＵＥ　Ｔｉａｎｌｅ２，ＬＩＡＮＧ　Ｇｕａｎｇｗｅｉ　１
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｉｊｉｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｉｊｉｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　５５１７００；２．Ｂｏｚｈｏｕ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ
ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｏｚｈｏｕ，Ａｎｈｕｉ　２３６８００，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｇｕａｒｄ　ｔｈｅ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｆｏｕｒ　ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｓｅｖａｇ，ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＣＡ），ｐａｐａｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｓｅｖａｇ
ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｅｒｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｏｓｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｐａｐａｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｉｎｇ：ｅｎｚｙｍｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　４％，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　５５℃，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｉｍｅ　３．０ｈ，ｐＨ　６．０．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ　７７．９７％，ｔｈｅ　ｌｏｓｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｗａｓ　１９．３１％．
Ｔｈｉｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗａｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｌｏｗ　ｃｏｓｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｚａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍＤ．ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ　ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
　　红托竹荪（Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ　ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ）是一种
担子菌，隶属真菌门（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）、担子菌亚门（Ｂａ－
ｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、腹菌纲（Ｇａｓｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、鬼笔目
（Ｐｈａｌａｌｅｓ）、鬼笔科（Ｐｈａｌａｃｅａｅ）、竹荪属（Ｄｉｃｔｙｏ－
ｐｈｏｒａ），是名贵的大型食用菌之一，野生红托竹荪主
要分布在我国贵州中（西）部、云南、四川和浙江等
省，多生长于竹林下的腐殖土上［１］。红托竹荪是竹
荪家族的珍品，含有丰富的氨基酸、维生素、无机盐
和多糖，其中多糖是红托竹荪子实体中重要组成成
分之一，连宾等［２］研究发现，红托竹荪多糖的单糖组
成为半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖。食用菌生物多
糖是一种非特异性免疫增强剂和免疫激活剂，广泛
用于医药和保健食品，被称为生物应答调节剂［３］。
红托竹荪多糖的分离纯化及其药理活性的前期研究
发现，红托竹荪多糖具有体外抗氧化活性［４］。植物
多糖中常常混有较多的蛋白质，蛋白质的存在不仅
会影响多糖的生理活性和多糖的结构，还会导致多
糖的药理活性发生变化［５］。为保证多糖的药理活
性，笔者研究比较几种红托竹荪的多糖脱蛋白工艺，
以期为红托竹荪资源的开发利用提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料
试验材料：红托竹荪子实体购于贵州省毕节市
织金县，于５０℃干燥至恒重，粉碎，过４０目筛，备
用。
试剂：葡萄糖标准品（中国药品生物制品鉴定所
１１０８３３－２００９０１），考马斯亮蓝 Ｇ－２５０（Ａｍｒｅｓｃｏ公
司），牛血清蛋白（Ａｍｒｅｓｃｏ公司），其余试剂均为国
产分析纯，试验用水为蒸馏水。
仪器：ＧＬ－２０Ｇ－Ｃ台式高速离心机（长沙迈佳森
仪器设备有限公司），ＴＧ１６台式高速离心机（长沙
迈佳森仪器设备有限公司），Ｖ－５８００可见分光光度
计（上海元析仪器有限公司），ＳＺ－９７Ａ自动三重纯水
蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），旋转蒸发器 ＲＥ－
２００８Ｂ（上海亚荣生化仪器厂），电热干燥箱２０２－３
（金坛市精达仪器制造厂）。
１．２ 多糖的提取
多糖的提取参照文献［６］的方法进行。红托竹
荪粉末→脱脂（７５％乙醇浸泡４８ｈ）→热水浸提→
　贵州农业科学　２０１６，４４（５）：１３１～１３５
　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
离心取上清液→减压浓缩→醇沉（３倍体积的９５％
乙醇，置于４℃冰箱静置过夜）→沉淀→洗涤（无水
乙醇、丙酮、无水乙醚）→干燥（６０℃电热干燥箱）→
红托竹荪粗多糖。
１．３ 多糖含量的测定
采用苯酚－硫酸法［７］测定多糖含量，以葡萄糖为
标准品，在４９０ｎｍ条件下测定吸光度，得回归方程
ｙ＝０．０２０　７ｘ＋０．０８９　７。式中，ｘ 为葡萄糖含量
（μｇ／ｍＬ），ｙ为吸光度，Ｒ
２＝０．９９９　１。
多糖损失率＝［（脱蛋白前多糖含量—脱蛋白后
多糖含量）／脱蛋白前多糖含量］×１００％。
１．４ 蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝法［８］测定蛋白质含量，以牛血
清蛋白质为标准品，在５９５ｎｍ条件下测定吸光度，
得回归方程ｙ＝０．１００　４ｘ＋０．７１１。式中，ｘ为蛋白
含量（μｇ／ｍＬ），ｙ为吸光度，Ｒ
２＝０．９９９　０。
蛋白脱除率＝［（脱蛋白前蛋白含量—脱蛋白后
蛋白含量）／脱蛋白前蛋白含量］×１００％。
１．５ 脱蛋白方法的考察
１．５．１ Ｓｅｖａｇ法
１）脱蛋白次数的确定［９］。取５０ｍＬ浓度为
２ｍｇ／ｍＬ的粗多糖溶液，加入１／３倍体积的Ｓｅｖａｇ
试剂（氯仿∶正丁醇＝４∶１），震荡３０ｍｉｎ，静置
３０ｍｉｎ待分层稳定，除去水相与有机相间的蛋白质；
取上清液在３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，然后继续加
入Ｓｅｖａｇ试剂，５次重复，取上清液，测定蛋白质脱
出率和多糖损失率。
２）氯仿与正丁醇体积比的确定［１０］。取浓度为
２ｍｇ／ｍＬ的粗多糖溶液５份，各５０ｍＬ，分别加入
１／３倍体积的Ｓｅｖａｇ试剂，Ｓｅｖａｇ试剂中氯仿与正丁
醇的体积比分别为１∶１，２∶１，３∶１，４∶１，５∶１，震
荡３０ｍｉｎ，静置３０ｍｉｎ待分层稳定，除去水相与有
机相间的蛋白质；３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清
液，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。
３）粗多糖溶液与Ｓｅｖａｇ试剂体积比的确定［１１］。
取浓度为２ｍｇ／ｍＬ的粗多糖溶液５份，各５０ｍＬ，
多糖溶液与Ｓｅｖａｇ试剂（氯仿∶正丁醇＝４∶１）的体
积比分别为１∶１，２∶１，３∶１，４∶１，５∶１，震荡
３０ｍｉｎ，静置３０ｍｉｎ待分层稳定，除去水相与有机
相间的蛋白质；３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液，
测定蛋白质脱出率和多糖损失率。
１．５．２ 木瓜蛋白酶法 参照文献［１－１２］的方法进
行考察。
１）酶浓度。取１０ｍＬ　ｐＨ 值已调为６．０的
２ｍｇ／ｍＬ红托竹荪粗多糖溶液５份，分别加入终浓
度为１％、２％、３％、４％和５％的木瓜蛋白酶，摇匀后
于５５℃酶解２．５ｈ，结束后于沸水浴１０ｍｉｎ灭酶，
测定蛋白质脱出率和多糖损失率。
２）酶解温度。取１０ｍＬ　ｐＨ 已调为６．０的
２ｍｇ／ｍＬ红托竹荪粗多糖溶液５份，分别加入４％
的木瓜蛋白酶，于４５℃、５０℃、５５℃、６０℃和６５℃酶
解２．５ｈ，结束后于沸水浴１０ｍｉｎ灭酶，测定蛋白质
脱出率和多糖损失率。
３）酶解时间。取 １０ ｍＬ 已调 ｐＨ　６．０ 的
２ｍｇ／ｍＬ红托竹荪粗多糖溶液５份，分别加入４％
的木瓜蛋白酶，于５５℃下分别酶解１．０ｈ、１．５ｈ、
２．０ｈ、２．５ｈ和３．０ｈ，结束后于沸水浴１０ｍｉｎ灭
酶，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。
４）酶液ｐＨ。取浓度为２ｍｇ／ｍＬ红托竹荪粗
多糖溶液５份，各１０ｍＬ，当木瓜蛋白酶用量为
４％，酶解温度为５５℃时，分别在ｐＨ 为５．５，６．０，
６．５，７．０，７．５条件下保温酶解２．５ｈ，结束后于沸水
浴１０ｍｉｎ灭酶，测定蛋白质脱出率和多糖损失率。
５）正交试验。在单因素试验的基础上，以蛋白
脱除率和多糖保留率的综合评分为指标，选取酶用
量、酶解温度、酶解时间和酶液ｐＨ作为考察因素进
行Ｌ９（３４）正交试验，因素和水平见表１，以优化木瓜
蛋白酶脱蛋白的试验条件。
表１ 酶法脱蛋白的正交试验因素及水平
Ｔａｂｌｅ　１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
水平
Ｌｅｖｅｌ
酶浓度（Ａ）／％
Ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
酶解温度（Ｂ）／℃
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
酶解时间（Ｃ）／ｈ
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｉｍｅ
酶液ｐＨ（Ｄ）
ｐＨ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｑｕｉｄ
１　 ３　 ５０　 ２．０　 ６．０
２　 ４　 ５５　 ２．５　 ６．５
３　 ５　 ６０　 ３．０　 ７．０
１．５．３ 三氯乙酸（ＴＣＡ）法 参照文献［５］的方法
进行。取浓度为２ｍｇ／ｍＬ的粗多糖溶液５份，各
１０ｍＬ，分别加入５％、６％、７％、８％和９％等体积的
三氯乙酸水溶液，震荡３０ｍｉｎ，静置１ｈ，３　５００ｒ／
ｍｉｎ条件下离心１５ｍｉｎ，取上清液，测定蛋白质脱出
率和多糖损失率。
１．５．４ 酶－Ｓｅｖａｇ法脱蛋白 参照文献［１３］的方法
进行。取浓度为２ｍｇ／ｍＬ的粗多糖溶液５０ｍＬ，加
入４％的木瓜蛋白酶，调节ｐＨ　６．０，５５℃水浴中酶
解２．５ｈ，沸水浴１０ｍｉｎ灭酶，冷却后向粗多糖溶液
中加入１／３体积 Ｓｅｖａｇ试剂（氯仿∶正丁醇＝
４∶１），震荡３０ｍｉｎ，３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，去除
沉淀，然后继续加入Ｓｅｖａｇ试剂，重复处理５次，取
上清液，测定蛋白质脱除率和多糖损失率。
２ 结果与分析
２．１ Ｓｅｖａｇ法
从图１可知，Ｓｅｖａｇ法脱蛋白３次后，蛋白脱出
率没有明显升高，而多糖损失率却迅速上升，经过５
次脱蛋白后，蛋白脱出率达５７．６４％，多糖损失率达
·２３１·
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵 州 农 业 科 学
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
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蛋白质脱出率 多糖损失率
脱蛋白次数
Deproteinization times
氯仿∶正丁醇
Ratio of chloroform to n-butanol
多糖溶液:sevag 试剂
Ratio of polysaccharide to sevag
1 2 3 4 5 1∶1 2∶1 3∶1 4∶1 5∶1 1∶1 2∶1 3∶1 4∶1 5∶1
图１ 不同影响因素红托竹荪多糖的蛋白脱出率和多糖损失率
　　　　　　Ｆｉｇ．１　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｌｏｓｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｄ．ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　ｐｏｌｙｓａｏｃｈａｒｉｄｅ　ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ
５０．３３％。因此，Ｓｅｖａｇ法脱蛋白３次为最佳，此时
蛋白脱出率为６２．０４％，多糖损失率为３１．３４％。当
氯仿与正丁醇比例为４∶１时，蛋白脱出率最高达
６６．６１％，多糖损失率为１０．４５％。因此，氯仿与正
丁醇的最适比例为４∶１。粗多糖溶液与Ｓｅｖａｇ试
剂按３∶１和４∶１混合后，蛋白脱出率分别为
６９．２４％和６８．１９％，二者间没有明显差异，多糖损
失率分别为１２．３５％和１４．２５％，３∶１时的多糖损
失率低于４∶１，因此粗多糖溶液与Ｓｅｖａｇ试剂的最
适体积比为３∶１。
试验结果表明，氯仿与正丁醇体积比对蛋白质
脱出率和多糖损失率有影响，粗多糖溶液的体积过
多或过少，都会影响蛋白质的脱出率，Ｓｅｖａｇ试剂处
理次数越多，多糖损失率越高。综上所述，对Ｓｅｖａｇ
法脱蛋白条件进行验证，即粗多糖溶液中加入１／３
倍体积的Ｓｅｖａｇ试剂（氯仿∶正丁醇＝４∶１），脱蛋
白３次，测得蛋白质脱出率为６４．０３％，多糖损失率
为３０．０７％。
２．２ 酶法
２．２．１ 不同因素对酶法脱蛋白效果的影响 由图
２可知，随着木瓜蛋白酶浓度的升高，蛋白脱除率逐
渐增加，在酶浓度达４％时趋于平稳，此时蛋白脱出
率为７６．９８％，多糖损失率为２８．４９％；随酶解温度
的升高，蛋白脱除率呈先上升后降低趋势，在５５℃
时，酶活性最强，蛋白脱出率为７０．１２％，多糖损失
率为２５．６４％；随着酶解时间的增加，蛋白质的脱除
率明显增加，在酶解时间达２．５ｈ后蛋白脱除率变
化不明显，多糖损失率随时间延长而升高；随着ｐＨ
的增加蛋白质脱出率呈先上升后下降的趋势，在
ｐＨ　６．５时达最高，为７１．５３％，多糖损失率随着ｐＨ
的增高而降低，降低幅度不大。
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蛋白质脱出率 多糖损失率
酶浓度/%
Enzyme concentration
酶解温度/℃
Enzymolysis temperature
酶解时间/h
Enzymolysis time
酶液 pH
Enzymolysis solution of pH
5.5 6 6.5 7 7.51 1.5 2 2.5 345 50 55 60 651 2 3 4 5
图２ 不同酶浓度、酶解温度、酶解时间和酶液ｐＨ红托竹荪多糖的蛋白脱出率和多糖损失率
　　　Ｆｉｇ．２　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｌｏｓｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｄ．ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　ｐｏｌｙｓａｏｃｈａｒｉｄｅ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｐＨ
２．２．２ 酶法脱蛋白正交试验结果 采用综合加权
评分法［１１］，权重系数均为０．５，分别把蛋白脱出率和
多糖保留率中最大的指标定为１００分，其他各项综
合评分＝（每次脱蛋白率／每组最高脱蛋白率）×
０．５×１００＋（每次多糖保留率／每组最高多糖保留
率）×０．５×１００，计算结果见表２。对表２中正交试
验结果的综合评分进行极差分析（表３）可知，４个因
素对综合评分的影响程度不同，由高到低依次为 Ａ
（酶浓度）＞Ｃ（酶解时间）＞Ｄ（酶液ｐＨ）＞Ｂ（酶解
温度），以Ｄ（酶液ｐＨ）作为误差项进行方差分析可
知，Ａ（酶浓度）的Ｆ值为２８．１０３＞Ｆ临界值（１９．００），
对综合评分有显著性影响，其他因素均无显著性影
响。随着酶浓度的增加，酶与底物接触的机会也增
加，蛋白质脱除效果增大，温度升高可以加速酶促反
·３３１·
　叶　敏 等　不同方法对红托竹荪多糖的脱蛋白效果
　ＹＥ　Ｍｉｎ　ｅｔ　ａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ　ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｂｙ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
表２ 红托竹荪多糖酶法脱蛋白正交试验的综合评分
　　　　　Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｓｃｏｒｅ　ｏｆ　Ｄ．ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　ｐｏｌｙｓａｏｃｈａｒｉｄｅ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｉｃ
ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
试验号
Ｎｏ．
酶浓度（Ａ）／％
Ｅｎｚｙｍｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
酶解温度（Ｂ）／℃
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
酶解时间（Ｃ）／ｈ
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ
ｔｉｍｅ
酶液ｐＨ（Ｄ）
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｐＨ
蛋白质脱出率／％
Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ
多糖保留率／％
Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
综合评分／％
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ
ｓｃｏｒｅ
１　 ３　 ５０．０　 ２．０　 ６．０　 ６７．８４　 ７８．１６　 ９０．９０
２　 ３　 ５５．０　 ２．５　 ６．５　 ６７．４８　 ７４．３６　 ８８．３８
３　 ３　 ６０．０　 ３．０　 ７．０　 ６３．６２　 ７９．１１　 ８８．７５
４　 ４　 ５０．０　 ２．５　 ７．０　 ６９．２４　 ８１．９６　 ９４．６７
５　 ４　 ５５．０　 ３．０　 ６．０　 ７７．５０　 ８２．９１　 ９９．４３
６　 ４　 ６０．０　 ２．０　 ６．５　 ７６．６２　 ７５．３１　 ９４．８５
７　 ５　 ５０．０　 ３．０　 ６．５　 ７３．２８　 ７０．５６　 ８９．８３
８　 ５　 ５５．０　 ２．０　 ７．０　 ６６．６１　 ７４．３６　 ８７．８１
９　 ５　 ６０．０　 ２．５　 ６．０　 ６８．１９　 ７２．４６　 ８７．６９
表３ 红托竹荪多糖酶法脱蛋白正交试验各因素水平综合得分的均值与极差
　　　　Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ａｎｄ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｓｃｏｒｅ　ｏｆ　Ｄ．ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　ｐｏｌｙｓａｏｃｈａｒｉｄｅ　ｏｆ　ｖａｒｉｏｕｓ
ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｎ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
均值
Ｍｅａｎ　ｖａｌｕｅ
酶浓度（Ａ）／％
Ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
酶解温度（Ｂ）／℃
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
酶解时间（Ｃ）／ｈ
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｉｍｅ
酶液ｐＨ （Ｄ）
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｐＨ
ｋ１ ８９．３４３　 ９１．８００　 ９１．１８７　 ９２．６７３
ｋ２ ９６．３１７　 ９１．８７３　 ９０．２４７　 ９１．０２０
ｋ３ ８８．４４３　 ９０．４３０　 ９２．６７０　 ９０．４１０
Ｒ　 ７．８７４　 １．４４３　 ２．４２３　 ２．２６３
应速度，同时也会加速酶蛋白变性而失去活性，酶的
活性在一定ｐＨ条件下表现最大的活力，适当延长
酶解时间可增加酶促反应速度。因此，酶法脱蛋白
的最佳条件为 Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ１，即酶浓度４％、酶解温度
５５℃、酶解时间３ｈ，酶液ｐＨ　６．０。
２．２．３ 验证试验 根据正交试验的最佳条件，取
粗多糖溶液１０ｍＬ，共３份，按最佳条件重复３次试
验，计算平均蛋白脱出率为７７．９７％，平均多糖损失
率为１９．３１％。
２．３ 三氯乙酸（ＴＣＡ）法
由图３可知，随着ＴＣＡ浓度的增加，粗多糖溶
液中蛋白脱出率逐渐增加，但多糖损失率也逐渐上
升。ＴＣＡ是酸性物质，能使蛋白质带正电荷从而与
蛋
白
脱
出
率
及
多
糖
损
失
率
/%
Pr
ot
ei
n
re
m
ov
al
ra
te
,P
ol
ys
ac
ch
ar
id
e
lo
ss
ra
te
0
10
20
30
40
50
60
70
80 蛋白质脱出率
多糖损失率
5 6 7 8 9
TCA 浓度/%
Concentration of TCA
　　图３ 不同浓度ＴＣＡ红托竹荪多糖的蛋白脱出率和
多糖损失率
　　Ｆｉｇ．３　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｌｏｓｓ
ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｄ．ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　ｐｏｌｙｓａｏｃｈａｒｉｄｅ　ｗｉｔｈ
ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＴＣＡ
0
10
20蛋
白
脱
出
率
及
多
糖
损
失
率
/%
Pr
ot
ei
n
re
m
ov
al
ra
te
,P
ol
ys
ac
ch
ar
id
e
lo
ss
ra
te
30
40
50
60
70
蛋白质脱出率 多糖损失率
脱蛋白次数
Deproteinization times
1 2 3 4 5
图４ 红托竹荪多糖酶－Ｓｅｖａｇ法的蛋白脱出率和多糖损失率
　Ｆｉｇ．４　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｌｏｓｓ　ｒａｔｅ
ｏｆ　Ｄ．ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　ｐｏｌｙｓａｏｃｈａｒｉｄｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ
ｅｎｚｙｍｅ－Ｓｅｖａｇ　ｍｅｔｈｏｄ
酸根负离子结合成不溶性的盐类，并伴随蛋白质分
子变性，但 ＴＣＡ 同样会对多糖产生破坏［１３］。当
ＴＣＡ浓度为６％时，蛋白脱出率为６６．９６％，多糖损
失率为１８．９９％；当ＴＣＡ浓度大于６％时，蛋白脱出
率缓慢增加，而多糖损失率快速上升，达４１．７９％。
因此，ＴＣＡ浓度为６％时，脱蛋白效果最好。
２．４ 酶－Ｓｅｖａｇ法
由图４可以看出，酶解后的粗多糖溶液，随着
Ｓｅｖａｇ法脱蛋白次数的增加，蛋白脱出率逐渐增加，
当脱蛋白３次后，蛋白脱出率上升幅度不大，此时蛋
白脱出率为６３．６２％；多糖的损失率也随着Ｓｅｖａｇ
法脱蛋白次数的增加而上升，经过５次处理后，多糖
损失率达到４０．８４％。
·４３１·
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵 州 农 业 科 学
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
３ 结论
植物多糖的纯度常受到自身所含植物蛋白的影
响，其药理研究结果往往出现较大差异，因此多糖脱
蛋白是多糖纯化的关键［１４］。试验比较了Ｓｅｖａｇ法、
ＴＣＡ法、木瓜蛋白酶法和酶－Ｓｅｖａｇ法４种方法对红
托竹荪多糖脱蛋白效果的影响。４种方法均不能使
蛋白质完全脱除，还有残留，可能是因为有部分蛋白
质与多糖紧密结合形成糖蛋白而不容易除去。
Ｓｅｖａｇ法在脱出游离蛋白质的同时可能会除去与蛋
白质结合的多糖，因此，用Ｓｅｖａｇ试剂处理的次数越
多，多糖的损失率也就越高，Ｓｅｖａｇ法需要消耗大量
有毒有机溶剂，有机溶剂容易造成多糖活性下降和
溶剂残留［１４］，因此，红托竹荪粗多糖溶液中加入１／３
倍体积的Ｓｅｖａｇ试剂（氯仿∶正丁醇＝４∶１），３次
重复的脱蛋白效果最好；ＴＣＡ溶液的浓度对脱蛋白
的效果有较大影响，当ＴＣＡ浓度为６％时，脱蛋白
效果最好，多糖损失率最低；酶－Ｓｅｖａｇ法联用没有
提高蛋白脱出率，可能是因为有机层的包裹使多糖
损失率增加［１５］；酶法是多糖除蛋白方法中较温和且
高效的一种，不引入有机试剂，可以避免总多糖大量
降解［１５］。因此，酶法对红托竹荪多糖脱蛋白效果最
好。然而，不论是采用单一的方法还是采用酶－
Ｓｅｖａｇ法，多糖溶液中仍会有部分蛋白质与多糖牢
固结合形成的糖蛋白存在，如需获得更纯的多糖制
品，还需要经过其他一系列的精制分离纯化工
艺［１６］，对多糖中蛋白质的除去方法的选择对多糖的
降解程度和多糖药理活性以及结构等的影响，还有
待进一步的研究。
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（责任编辑：孙小岚
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（责任编辑：孙小岚）
·５３１·
　叶　敏 等　不同方法对红托竹荪多糖的脱蛋白效果
　ＹＥ　Ｍｉｎ　ｅｔ　ａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ　ｒｕｂｒｏｖａｌｖａｔａ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｂｙ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ