全 文 ：收稿日期:2013-12-03 接受日期:2014-02-25
基金项目:福建省公益类科研院所项目(2011Ｒ1024-4);福建省科
技重点项目(2012Y1003);福建省财政专项项目(2011-
975)
* 通讯作者 E-mail:xinjianlin@ 163． net;hongduanlq@ 163． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:475-479
文章编号:1001-6880(2014)4-0475-05
棘托竹荪菌盖蛋白提取及分析
曹 萌1，2，林陈强2，林戎斌2，陈济琛2，邱宏端1
*
，林新坚2
*
1福州大学生物科学与工程学院，福州 350008;2 福建省农业科学院土壤肥料研究所，福州 350001
摘 要:首次以棘托竹荪菌盖为原料，通过单因素试验和正交试验，研究菌盖蛋白最佳提取工艺;用 SDS-PAGE
测定所提取蛋白的分子量分布。结果表明:提取时间和 pH 是影响竹荪菌盖蛋白提取的主要因数，最佳提取条
件为 pH8． 0，提取时间 2． 5 h，提取温度 55 ℃，提取率达 64． 07%，提取的竹荪菌盖主要蛋白分子量为 16 kDa和
38 kDa。棘托竹荪菌盖作为蛋白提取原料是可行的，以其为原料开发蛋白相关产品具有巨大的潜力和广阔的市
场前景。
关键词:竹荪菌盖;蛋白;提取
中图分类号:Q946． 1;Ｒ285 文献标识码:A
Study on Extraction and Analysis of Protein from Dictyophora echinovolvata Pileus
CAO Meng1，2，LIN Chen-qiang2，LIN Ｒong-bin2，CHEN Ji-chen2，QIU Hong-duan1* ，LIN Xin-jian2*
1College of Biological Science and Technology，Fu Zhou University，Fuzhou Fujian 350008，China;
2The Soil and Fertilizer Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou Fujian 350001，China
Abstract:Using Dictyophora echinovolvata pileus as the raw material，the optimal extraction process of protein was stud-
ied by single factor and orthogonal experiments． The molecular weight distribution of extracted protein was analyzed by
SDS-PAGE． The results indicated that the pH and extraction time were the most important factors to the extraction
process． The highest extraction yield of 64． 07% was obtained at pH 8． 5，55 ℃ with 2． 5 h of extraction． The major mo-
lecular weights of extracted protein were 16 kDa and 38 kDa． In conclusion，D． echinovolvata pileus is a suitable raw ma-
terial for extracting proteins with great economic potential and market prospect．
Key words:Dictyophora echinovolvata pileus;protein;extraction
竹荪是一种营养丰富的食用菌，研究发现它具
有抗氧化、抗菌及抗肿瘤等多种功效［1］。竹荪中蛋
白含量高，氨基酸种类齐全。华阳林等对国内不同
地区的竹荪子实体进行测定，发现蛋白占竹荪子实
体干重均值的 17%左右［2］。屠六邦等通过实验测
定竹荪子实体中含有 21 种氨基酸，是食用菌中氨基
酸种类最多的一种［3］。竹荪子实体分为菌盖、菌
群、菌柄、菌托四部分［3］。菌盖鲜重占整个子实体
20%左右，菌盖上附着有竹荪孢子。研究表明菌盖
所含蛋白含量超过竹荪子实体，Jonathan SG 等测定
发现竹荪菌盖干品中粗蛋白含量为 25． 56%［4］。然
而，目前竹荪菌盖在竹荪采摘过程中被直接丢弃，未
加以利用，造成了资源浪费和环境污染。本文通过
对竹荪菌盖蛋白提取工艺研究，为提高竹荪资源综
合利用，研发新的健康产品，减少环境污染和竹荪深
加工及延伸其产业链提供技术依据。
1 材料与仪器
1． 1 主要试剂
NaOH、(NH4)2SO4、HCl，均分析纯，购于国药。
蛋白 Marker(10 ～ 200kDa)，由 Thermo Scientific 提
供。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、N，N-亚
甲基双丙烯酰胺、N，N，N，N-四甲基乙二胺
(TEMED)、过硫酸铵、SDS、甘氨酸均由上海生工提
供。
1． 2 主要仪器
320-S pH计［梅特勒-托利多仪器(上海)有限
公司］;Sigma 3-18K 离心机(德国 Sigma公司);鼓风
干燥箱(瑞士 Salvis LAB);小型垂直电泳系统，凝胶
成像系统(美国 Bio-Ｒad 公司);KDN-103F 自动凯
式定氮仪(上海纤检仪器有限公司)。
DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.04.007
1． 3 实验材料
棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata)，源自福建
省顺昌县。
2 实验方法
2． 1 实验材料预处理
新鲜竹荪采摘菌盖，利用去离子水洗去菌盖上
附着的孢子。洗去孢子的菌盖于通风处沥去水分后
粉碎，作为蛋白提取材料。后文中出现的菌盖均指
洗去孢子粉碎的棘托竹荪菌盖。
2． 2 菌盖含水率测定
菌盖水分测定参考国标［5］，并略作改进。取菌
盖 50． 000 g，放入干燥已称重的表面皿，置烘箱 105
℃烘至恒重。三次重复取平均值，计算菌盖含水率。
2． 3 菌盖蛋白提取单因素试验
2． 3． 1 料液比
250 mL锥形瓶加入 100 mL 去离子水，分别按
料液比(w /v)1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15 加入竹荪菌盖。
用 0． 1 mol /L NaOH溶液调节 pH至 8． 0，在 55 ℃提
取 1h，6000 rpm离心 10 min 取上清液，测定蛋白含
量，计算蛋白提取率。
2． 3． 2 pH
250 mL锥形瓶加入 100 mL 去离子水，以料液
比 1∶ 5 加入竹荪菌盖，用 0． 1 mol /L NaOH溶液分别
调节 pH至 7． 0、8． 0、9． 0、10． 0，55 ℃提取 1 h。6000
rpm离心 10 min取上清液，测定蛋白含量，计算蛋白
提取率。
2． 3． 3 提取时间
250 mL锥形瓶加入 100 mL 去离子水，以料液
比 1∶ 5 加入竹荪菌盖，用 0． 1 mol /L NaOH溶液调节
pH至 9． 0，于 55 ℃分别提取 0． 5、1、2、4 h。6000
rpm离心 10 min取上清液，测定蛋白含量，计算蛋白
提取率。
2． 3． 4 温度
250 mL锥形瓶加入 100 mL 去离子水，以料液
比 1∶ 5 加入竹荪菌盖，用 0． 1 mol /L NaOH溶液调节
pH至 9． 0，分别于 35、45、55、65 ℃提取 2 h。6000
rpm离心 10 min取上清液，计算蛋白提取率。
2． 4 菌盖蛋白提取条件优化
在单因素试验基础上，考虑 pH 值、时间、温度
三个因素，采用 3 因素 3 水平 L9(3
4)正交试验确定
最佳提取工艺条件，因素水平见表 1。
表 1 菌盖蛋白提取正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments
水平
Level
因素 Factors
(A)pH值
pH value
(B)时间
Time (h)
(C)温度
Temperature(℃)
1 8． 0 1． 5 45
2 8． 5 2． 0 50
3 9． 0 2． 5 55
2． 5 蛋白测定及提取蛋白分子量分析
2． 5． 1 菌盖粗蛋白测定及提取液中蛋白含量测定
蛋白测定参照国标［6］，略作改进。菌盖粗蛋白
测定为:1 g 烘干菌盖粉末，加入定氮管中，加入 20
mL浓硫酸，6 g 催化剂(K2SO4 ∶ CuSO4·5H2O∶ Se =
100∶ 10∶ 1)。消化完全后消化液定容至 100 mL，取
10 mL定容后的消化液用自动凯式定氮仪测定蛋白
含量。提取液中蛋白测定:取 20 mL 提取液，加入
20 mL浓硫酸，6 g催化剂(K2SO4 ∶ CuSO4·5H2O∶ Se
=100∶ 10∶ 1)。消化后消化液定容至 100 mL，取 10 mL
定容后的消化液用自动凯式定氮仪测定蛋白含量。
蛋白提取率计算公式如下:
ω1(%)=
(V1 － V2)× C × 0． 014
m1 ×
V3
V4
× F × 100
m2 =
(V1 － V2)× C × 0． 014
m1 ×
V3
V4
×
V5
V6
× F
Ｒ(%)=
m2
m3 × ω1 ×(1 － ω2)
× 100
ω1 为竹荪菌盖干品中粗蛋白所占比率，g 粗蛋
白 /100 g干菌盖;V1 为滴定菌盖消化液消耗盐酸标
准溶液体积，mL;V2 为滴定空白时消耗盐酸标准溶
液体积，mL;C 为盐酸标准溶液浓度，mol /L;0． 014
为氮的毫克当量数;F为氮换算成粗蛋白的系数;m1
为消化时加入的干菌盖质量，g;V3 为蒸馏时所取菌
盖消化液体积，mL;V4 为菌盖消化液总体积，mL;m2
为提取液中粗蛋白总质量，g;V1为滴定蛋白提取液
消化液消耗盐酸标准溶液体积，mL;V3为蒸馏时所
取蛋白提取液消化液体积，mL;V4为蛋白提取液消
化液总体积，mL;V5 为消化时加入的蛋白提取液体
积，mL;V6 为蛋白提取液总体积，mL;Ｒ 为竹荪菌盖
蛋白提取率;m3 为蛋白提取时所加入的菌盖质量，
g;ω2 为菌盖含水率。
674 天然产物研究与开发 Vol. 26
2． 5． 2 菌盖提取蛋白分子量分析
菌盖蛋白提取液用硫酸铵沉淀，6000 rpm，离心
10 min 搜集沉淀，用 PBS 缓冲液将沉淀溶解后，透
析。透析操作参照王家郑的方法［7］。透析后采用
真空冷冻干燥，获得蛋白粉。利用 SDS-PAGE 测定
菌盖蛋白分子量，电泳参照辛普生的方法［8］。
2． 6 统计分析
所有提取及分析过程重复三次，利用 DPS
v7. 05 软件对实验数据进行处理，作图采用 Ori-
gin90SＲ2 软件。
3 结果与分析
3． 1 菌盖蛋白提取单因素分析
3． 1． 1 料液比
由图 1A 可以看出，料液比较高时，蛋白质的提
取率较低。随着料液比的降低，蛋白提取率增加。
这与固液传质理论相符合，料液比越小固体物质与
液体接触面积越大，有利于物质溶出。但是，料液比
的减少造成加入溶剂量增加，对于溶液后续的浓缩
和干燥不利。在 1∶ 5 的料液比时，粗蛋白的提取率
是 52． 14%，当料液比减少至 1∶ 15 时蛋白提取率为
56． 22%。溶剂量增加两倍，粗蛋白提取率仅增加
4． 08%。这使得在后期蛋白分离和干燥上耗费大量
的人力物力，在经济上得不偿失。所以在后面的试
验中料液比选择 1∶ 5。
3． 1． 2 pH值
由图 1B 可以看出，随着 pH 上升，蛋白质的提
取率上升，当 pH升至 9． 0 时，蛋白质提取率最大达
58． 02%，随后 pH 上升蛋白提取率反而下降，这可
能是由于竹荪中大部分氨基酸为酸性氨基酸，在碱
性条件下容易溶解。但是碱性较强时破坏了蛋白质
的性质，使维持蛋白质空间结构的氢键等非共价键
遭受破坏，疏水基团暴露，使蛋白质变性，影响蛋白
溶出，从而使粗蛋白提取率下降。而且常规的强碱
法提取蛋白，容易造成氨基酸特别是赖氨酸的损失，
产生一些有毒副产物，增加美拉德反应，这对蛋白的
提取率有影响［9］。所以在后面单因素试验中 pH 确
定为 9． 0，正交试验因素水平选用 pH8． 0 ～ 9． 0。
3． 1． 3 提取时间
由图 1C可以看出，在 2 h 内随着时间的延长，
蛋白提取率明显上升，2 h 达最大，2 h 后蛋白提取
率基本保持不变。当提取时间小于 2 h 时，随着提
取时间的增加，竹荪细胞内部温度不断升高，水分汽
化产生的压力使细胞膜及细胞壁破碎，有利于溶剂
进入细胞，使蛋白容易溶出。当提取时间超过 2 h
时，大部分蛋白已经溶出，提取率基本稳定。所以在
后面单因素试验中提取时间确定为 2 h，正交试验因
素水平选用 1． 5 ～ 2． 5 h。
3． 1． 4 温度
由图 1D可以看出，35 ～ 45 ℃之间蛋白的提取
率增加显著，从 45 ℃开始，随着温度的升高，蛋白的
提取率增幅明显趋缓。大多数蛋白质的溶解度在 0
～ 40 ℃范围内随着温度的上升而升高，竹荪菌盖蛋
白在 35 ～ 45 ℃之间的溶解度变化也符合上诉理论。
随着温度上升，由于高温使疏水基团暴露，从而使蛋
白质发生变性［10］。蛋白质变性往往失去溶解度，因
此在 45 ℃之后蛋白提取率基本稳定。正交试验因
素水平选用 45 ～ 55 ℃。
57
56
55
54
53
52
58
56
54
52
50
62
60
58
56
54
60
58
56
54
52
0% 1% 2% 3% 4 35%40%45%50%55%60%65
7% 8% 9 101:5 1:8 1:10 1:15
料液比（W/V）
Solid-l;iquid%ratio
pH值
pH%value
时间（h）
Time
温度（℃）
Temperature
蛋
白
提
取
率（
%
）
Ex
tra
ct
io
n%
yi
el
d
蛋
白
提
取
率（
%
）
Ex
tra
ct
io
n%
yi
el
d
蛋
白
提
取
率（
%
）
Ex
tra
ct
io
n%
yi
el
d
蛋
白
提
取
率（
%
）
Ex
tra
ct
io
n%
yi
el
d
A B
C D
图 1 料液比(A)、pH(B)、时间(C)及温度(D)对竹荪菌
盖蛋白提取率的影响
Fig. 1 Effect of solid-liquid ratio (A)，pH (B) ，time (C)
and temperature (D)on extraction yield of protein
3． 2 菌盖蛋白提取正交试验分析
由单因素试验得出料液比虽然影响竹荪菌盖蛋
白的提取率，但是从实验溶剂及实验费用的消耗等
考虑，料液比宜控制在相对较大的范围。为此在正
交试验中料液比固定为 1∶ 5，未对料液比进行研究。
正交试验结果见表 2，由极差分析可得，3 个因
数的极差大小顺序为 ＲB ＞ ＲA ＞ ＲC，影响菌盖提取
工艺的主要因数是提取时间，其次是 pH，温度对其
影响最小。方差分析结果表明提取时间对菌盖蛋白
提取影响极显著(P ＜ 0． 01)，pH对菌盖蛋白提取影
响显著(P ＜ 0． 05)，温度对菌盖蛋白提取影响不显
著。最优提取条件为 A2B3C3，即:pH8． 5，提取时间
774Vol. 26 曹 萌等:棘托竹荪菌盖蛋白提取及分析
2． 5 h，提取温度 55 ℃。经实验验证，该条件下提取率达到 64． 07%。
表 2 竹荪菌盖蛋白提取正交试验结果
Table 2 The result of orthogonal test of extraction techniques
实验编号
No．
因素 Factors
(A)pH值
pH value
(B)时间
Time (h)
(C)温度
Temperature (℃)
提取率
Extraction
yield(%)
1 1 1 1 53． 26
2 1 2 2 59． 12
3 1 3 3 61． 32
4 2 1 2 57． 88
5 2 2 3 61． 75
6 2 3 1 63． 12
7 3 1 3 56． 61
8 3 2 1 58． 64
9 3 3 2 62． 64
K1 173． 70 167． 75 175． 02
K2 182． 75 178． 51 179． 64
K3 177． 89 187． 08 179． 68
k1 57． 90 55． 92 58． 34
k2 60． 92 59． 84 59． 88 T = 534． 34
k3 59． 30 62． 36 59． 89
Ｒ 3． 02 6． 44 1． 55
F 49． 31 228． 05 17． 25
P 0． 0199* 0． 0044＊＊ 0． 0548
注:* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01。
Note:* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01．
3． 3 菌盖蛋白分子量测定
样品蛋白浓度 10 mg /mL，用 15%的分离胶，采
用银染方案对凝胶进行染色。利用 Bio-Ｒad 凝胶成
像仪分析竹荪菌盖蛋白的分子量，结果见图 2。主
100
85
70
60
50
40
30
25
20
15
10
1 2 3
90
70
38
32
23
16
12
图 2 竹荪菌盖蛋白 SDS-PAGE分析
Fig. 2 The polypeptide profiles based on SDS-PAGE analysis
注:1:Marker;2、3:样品蛋白条带。
Note:1:protein weight standard marker;2，3:protein of D． echino-
volvata pileus．
要蛋白分子量为 16 和 38 kDa，分子量为 12、23、32、
70、90 kDa的蛋白含量相对较少。在 23 ～ 32 kDa、
38 ～ 70 kDa 之间还有一些非常暗的条带，由于条带
不明显，无法判断其分子量。
4 结论
本实验通过单因数试验和正交试验对竹荪菌盖
蛋白的提取工艺进行探索和优化，确定了竹荪菌盖
总蛋白最佳提取条件为:pH8． 5，提取时间 2． 5 h、温
度 55 ℃，菌盖蛋白提取率 64． 07%。提取的蛋白经
SDS-PAGE测定，发现菌盖蛋白分子量分布为 12 ～
90 kDa，其中 16 kDa和 38 kDa 的蛋白为主要蛋白，
其他分子量蛋白含量相对较少。
本文首次以棘托竹荪菌盖为原料研究了蛋白提
取工艺，证明了棘托竹荪菌盖用于提取蛋白的可行
性。通过 SDS-PAGE 测定了菌盖蛋白分子量，初步
了解菌盖蛋白的组成，为竹荪资源合理利用、竹荪新
产品开发及提高农产品附加值提供了依据。棘托竹
874 天然产物研究与开发 Vol. 26
荪菌盖蛋白的结构分析，生理生化性质正在进一步
的研究之中。
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