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超临界CO_2萃取法提取棘托竹荪中的活性物质及其抑菌效果研究



全 文 :天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2015,27:832-836,858
文章编号:1001-6880(2015)5-0832-06
收稿日期:2014-06-23 接受日期:2014-11-19
基金项目:上海市教育委员会科研创新项目(11YZ159) ;上海市
2015 年科技兴农重点攻关项目(2015-4-12) ;上海海洋
大学科技发展专项基金(A2-0209-15-200061)
* 通讯作者 E-mail:xhsun@ shou. edu. cn
超临界 CO2 萃取法提取棘托竹荪中的
活性物质及其抑菌效果研究
蓝蔚青,曹 奕,陈 燕,潘迎捷,孙晓红*
上海海洋大学食品学院 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306
摘 要:本文研究了超临界 CO2 萃取法的不同提取条件对棘托竹荪中活性物质的抑菌效果影响。通过 L16(4
3)
正交实验,选取萃取压力、萃取温度与萃取时间为主要影响因素,采用超临界 CO2 萃取法,以活性物质对单增李
斯特菌和副溶血性弧菌的最小抑菌浓度(MIC)与抑菌率作为提取效果指标,设计棘托竹荪抑菌活性物质的最佳
提取条件。由不同提取条件对两种菌抑菌效果的影响程度与显著性分析得出:萃取时间 >萃取温度 >萃取压
力。棘托竹荪活性物质提取的最佳条件为:萃取压力为 20 MPa,萃取温度 35 ℃,萃取时间 120 min,所得活性物
质对单增李斯特菌与副溶血性弧菌的 MIC均为 15. 0 mg /mL。当抑菌活性物质浓度为 MIC时,处理 24 h后其对
单增李斯特菌与副溶血性弧菌的最佳抑制率分别为 85. 7%与 98. 2%。
关键词:超临界 CO2 萃取;棘托竹荪;最小抑菌浓度;抑菌活性
中图分类号:Q93-33 文献标识码:A DOI:10. 16333 / j. 1001-6880. 2015. 05. 015
Supercritical CO2 Extraction and Antibacterial Effects of
Active Substances from Dictyophora echinovolvata
LAN Wei-qing,CAO Yi,CHEN Yan,PAN Ying-jie,SUN Xiao-hong*
College of Food Science and Technology Shanghai Ocean University,Shanghai
Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation,Shanghai 201306,China
Abstract:In this paper,the antibacterial effects of active substances from Dictyophora echinovolvata prepared by super-
critical CO2 extraction with different extraction conditions were studied. The orthogonal experiment L16(4
3)was designed
for the optimization of extraction conditions of active substances. Extraction pressure (EP) ,extraction temperature
(ET1)and extraction time (ET2)were used as the main factors in supercritical CO2 extraction. The antibacterial effects
of active substances of D. echinovolvata against Listeria monocytogenes and Vibrio parahaemolyticus were measured by
minimal inhibitory concentration (MIC)and inhibitory rate. From the antibacterial effects of active substances and sig-
nificance analysis for different extraction conditions,the results showed that:ET2 > EP > ET1. The optimal extraction
conditions were 20 MPa,35 ℃ and 120 min. The MICs of active substances against L. monocytogenes and V. parahaemo-
lyticus were both 15. 0 mg /mL after 24 h incubation. When the concentrations of active substances were at MIC,the in-
hibitory rates against L. monocytogenes and V. parahaemolyticus were 85. 7% and 98. 2%,respectively.
Key words:supercritical CO2 extraction;Dictyophora echinovolvata;minimal inhibitory concentration;inhibitory effect
棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata)为担子菌
亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属的一类药食两
用真菌[1],主要分布于云南、贵州、四川、湖南等地,
其中以四川绵阳出产的棘托竹荪质量最好。竹荪首
次见于历史文献记载是唐代孟诜撰写的《食疗本
草》,当时被称为“蓐”。同时代的笔记小说《酉阳杂
俎》在其编录的植物卷中,首次对其子实体形态作
了具体描述。棘托竹荪营养丰富、滋味鲜美、香味浓
郁,长期以来作为我国的珍贵特产之一,价等黄金,
其子实体所含的粗蛋白比例达 17. 67%,人体所必
需氨基酸总量达 5. 4 mg /100 g,约占氨基酸总量的
1 /3,且具有抗氧化、抗菌及抗肿瘤等多种功效[2]。
此外,棘托竹荪中还富含多种维生素与微量元素,营
养价值远远高于日常所食用的蔬菜[3]。
近年来,国内相关科研工作者对棘托竹荪中活
性物质的提取与抑菌活性开展了部分研究工作。檀
东飞等[4-6]通过石油醚、乙酸乙酯与正己烷对棘托竹
荪子实体浸提,采用水蒸气蒸馏法对棘托竹荪挥发
油进行提取,用牛津杯法测定其抑菌活性,并分析了
多种提取物的化学成分。梁鸣等[7]在研究棘托竹
荪丙酮提取物化学组成的同时,还比较了丙酮、乙醇
与蒸馏水等溶剂获得提取物的抑菌活性。卢惠妮
等[8]采用水提法获得棘托竹荪的抑菌物质,并通过
琼脂平板打孔法测定其抑菌活性。结果得出,棘托
竹荪提取物在中性至偏碱性条件下能保持其抑菌活
性,且热稳定性好。国外在棘托竹荪中活性物质的
提取与抑菌研究方面还鲜有研究。
目前,国内主要采用溶剂萃取与水蒸气蒸馏法
提取竹荪中的抑菌物质。通常情况下,溶剂提取法
所得提取物抑菌效果不佳,水蒸气蒸馏法所得的挥
发油抑菌效果虽好,但萃取时间过长,且得率偏低。
超临界 CO2 萃取技术作为一种新型提取技术,相对
于传统提取工艺,其具有萃取工艺简单易行,且有大
工业生产的设备,生产周期短等优点,现已被证明能
提取出多种植物中的抑菌物质[9,10],但用于提取竹
荪中抑菌物质的研究还未有文献报道。本文通过
L16(4
3)正交实验,选取萃取压力、萃取温度与萃取
时间为主要影响因素,通过超临界 CO2 萃取法,以
活性物质对单增李斯特菌和副溶血性弧菌的最小抑
菌浓度(MIC)与抑菌率作为提取效果指标,设计棘
托竹荪抑菌活性物质的最佳提取条件,为今后开展
竹荪等天然产物提取与利用研究提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 实验原料
棘托竹荪子实体,购自四川绵阳食用菌所,保存
于干燥避光处;单增李斯特菌(Listeria monocyto-
genes,菌株编号:ATCC19115) ,副溶血性弧菌(Vibrio
parahaemolyticus,菌株编号:ATCC33847)均购自中
国普通微生物菌种保藏管理中心。
1. 2 实验试剂
胰蛋白胨大豆琼脂(TSA) ,胰蛋白胨大豆肉汤
(TSB) ,NaCl等均购自北京陆桥有限责任公司。
1. 3 主要仪器设备
SB-02 多功能粉碎机(上海市普恒信息科技有
限公司) ,超临界 CO2 萃取装置(美国 FOSS 公司) ,
Bio-Tek酶标仪(美国伯腾仪器有限公司) ,QB9006
微孔板快速振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂) ,
ESCO超净工作台(美国 Airstream公司) ,3799 型 96
微孔板(美国康宁公司)。
1. 4 实验方法
1. 4. 1 超临界 CO2 提取抑菌物质的正交实验设计
将供试棘托竹荪子实体烘干(37 ℃烘箱中静置
20 min) ,用多功能粉碎机粉碎 2 min,将粉碎后的竹
荪过 40 目筛,装入萃取釜内,等待萃取。通过预实
验,设计三因素四水平 L16(4
3)的正交实验,以萃取
压力、萃取温度和萃取时间等因素对所得物质的抑
菌效果进行研究,正交实验因素水平表见表 1。
表 1 正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments
水平
Levels
因素 Factors
A B C
1 15 30 60
2 20 35 90
3 25 40 120
4 30 45 150
注:A:萃取压力 /MPa;B:萃取温度 / ℃;C:萃取时间 /min。
Note:A:Extraction pressure /MPa,B:Extraction temperature / ℃,C:Ex-
traction time /min.
1. 4. 2 棘托竹荪活性物质的提取工艺
开启机器,安放装有 50. 0 g 竹荪的萃取釜,外
加密封圈。打开加热开关、设定所需的萃取温度,打
开进气阀,使 CO2 压进萃取釜内。开启高压泵,设
定所需的萃取压力,进行静态萃取过程 60 min。随
后动态萃取,并将收集管放在馏出口收集萃取物质。
到达所需萃取时间后,取下收集管,调节高压泵,使
萃取装置中的压力降低,关闭进气阀,打开出气阀。
取下萃取釜清洗,并关闭机器,最终获得棘托竹荪活
性物质。
1. 4. 3 棘托竹荪提取物对两种菌的 MIC
取甘油管保藏的两种菌株,其中分别用灭菌后
的 TSB进行两种菌的活化(副溶血性弧菌用含 3%
NaCl 的 TSB)。取 10 μL菌液加入 10 mL TSB 中稀
释(副溶血性弧菌用含 3% NaCl的 TSB) ,使菌液浓
度达 106CFU /mL,作为供试菌液备用。该过程与活
性物质提取实验同步进行。采用微量孔板法,通过
倍比稀释法用无菌水对棘托竹荪提取物依次进行梯
度稀释。其中
实验组:100μL 106CFU /mL 菌液 + 100μL 倍比
稀释提取液
对照组 1:100μL 倍比稀释的提取液 + 100μL
TSB
对照组 2:100μL 106CFU /mL菌液 + 100μL TSB
338Vol. 27 蓝蔚青等:超临界 CO2 萃取法提取棘托竹荪中的活性物质及其抑菌效果研究
阴性对照组:200μL TSB
加样前先涂布平板确认两种菌的初始菌液浓
度,加样后于微孔板振荡器 37 ℃培养 24h,取出观
察浊度变化,判定其 MIC 值,继而进行平板计数实
验验证结果精确性。每个处理样 2 个平行,每次实
验重复 3 次。当活菌数在 106CFU /mL,细菌生长受
到明显抑制的棘托竹荪提取物最低浓度为其 MIC
值。
1. 4. 4 微孔板法测定棘托竹荪对两种菌的抑菌率
向 96 微孔板中每孔加入 100 μL 制备的菌液,
将所得各组提取物质用 0. 1% Tween-20 增溶稀释,
将其浓度稀释至两种菌的 MIC。取 100 μL 加入孔
中与菌液充分混合,将加有单增李斯特菌和副溶血
性弧菌菌液的微孔板置于 37 ℃微孔板振荡器中培
养 12 h后,放入酶标仪测定其 OD600,由公式 1
[11]得
其抑菌率。
抑菌率(%)=
ODR - OD
ODR - ODB
(1)
式中:ODR 为对照孔吸光值;OD 为样品孔吸光
值;ODB 为空白孔吸光值
1. 5 数据处理
实验数据均为 3 次重复实验的均值,数据用
Excel2010 进行处理,使用 Origin 8. 0 进行绘图,均
值间的差异显著性通过统计软件 SPSS17. 0 进行检
验。
2 结果与讨论
2. 1 超临界 CO2 萃取法所得棘托竹荪提取物对两
种菌的 MIC
由微量孔板法结合平板计数法得到棘托竹荪提
取物对单增李斯特菌与副溶血性弧菌的最小抑菌浓
度为 15. 0 mg /mL。卢惠妮等[8]采用琼脂平板打孔
法进行长裙竹荪子实体的抑菌活性研究,得到棘托
竹荪浸提液对单增李斯特菌的 MIC 为 25. 0 mg /
mL,对副溶血性弧菌的 MIC 为 12. 5 mg /mL。罗胜
莲等[12]对棘托竹荪乙酸乙酯浸膏水溶液采用滤纸
片扩散法进行了抑菌作用研究,得出棘托竹荪提取
物对细菌的抑制作用效果明显,其对各类细菌的
MIC在 50 ~ 100 mg /mL。杨威等[13]研究了不同辅
助手段获得棘托竹荪菌丝体提取物对 6 种常见食品
腐败菌的效果,结果发现酶解水提法效果最佳,其对
大肠杆菌与金黄色葡萄球菌等的 MIC 为 3. 125 mg /
mL。
由此可见,虽然对棘托竹荪提取物 MIC 的测定
方法不同,但其对同类细菌的 MIC 值基本相近。然
而,棘托竹荪的提取部位与提取方法不同,其对不同
种类细菌的抑制效果也存在着一定差异。
2. 2 不同提取条件下棘托竹荪提取物抑菌正交实
验结果
采用超临界 CO2 萃取法,通过改变不同提取条
件获得棘托竹荪子实体提取物,并对提取物浓度在
MIC时对单增李斯特菌和副溶血性弧菌的抑制效果
进行分析。同时,还进行不同组别样品在 37 ℃ 24
h条件下作微孔振荡培养处理,由平板计数加以验
证,结果如表 2 所示。
根据对上表结果的综合分析,得出对单增李斯
特菌与副溶血性弧菌抑菌效果的最优组合均为
A2B2C3,各影响因子的强弱依次为是 RC > RB >
RA。即得提取因素对两种菌抑菌效果的影响程度
顺序依次为:萃取时间 >萃取温度 >萃取压力。范
巧宁等[14]通过响应面法优化了热水浸提法提取棘
表 2 不同提取条件下所得棘托竹荪提取物对单增李斯特菌与副溶血性弧菌的抑菌率
Table 2 Inhibitory rates of different D. echinovolvata extracts on L. monocytogenes and V. parahaemolyticus
序号
No. A B C
抑菌率 Inhibitory rates(%)
L. monocytogenes V. parahaemolyticus
1 1 1 1 75. 0 82. 3
2 1 2 2 78. 2 84. 7
3 1 3 3 82. 4 91. 2
4 1 4 4 81. 3 89. 1
5 2 1 2 82. 5 90. 1
6 2 2 3 85. 7 98. 2
7 2 3 4 79. 8 87. 5
438 天然产物研究与开发 Vol. 27
8 2 4 1 78. 3 86. 0
9 3 1 3 78. 5 82. 6
10 3 2 4 84. 6 95. 7
11 3 3 1 76. 7 85. 4
12 3 4 2 77. 8 88. 5
13 4 1 4 78. 1 86. 7
14 4 2 1 75. 6 85. 0
15 4 3 2 82. 5 90. 8
16 4 4 3 84. 8 93. 2
K1 0. 792 0. 785 0. 764
K2 0. 815 0. 810 0. 804
K3 0. 794 0. 803 0. 829
K4 0. 802 0. 805 0. 809
R1 0. 023 0. 025 0. 065
k1 0. 868 0. 854 0. 846
k2 0. 905 0. 910 0. 885
k3 0. 880 0. 887 0. 913
k4 0. 890 0. 892 0. 898
R2 0. 037 0. 056 0. 067
托竹荪菌盖多糖的提取工艺,结果得出因素的显著
性影响排序为:料液比 >提取次数 >提取时间 >提
取温度。田甜[15]采用响应面法优化了棘托竹荪的
菌盖多糖分离制备工艺,结果发现料液比、提取次数
与提取时间均达到极显著,提取温度为显著。在对
菌盖多糖的生物活性研究中,发现棘托竹荪多糖具
有良好的还原能力和自由基清除能力,对细菌、酵母
菌与霉菌具有一定的抑制作用。可见,棘托竹荪多
糖提取率的高低对提取物的抑菌效果好坏有直接影
响。本次研究结果的显著性分析与上述结论基本相
似,萃取时间与萃取温度对棘托竹荪提取物抑菌率
的影响高于萃取压力。
2. 3 不同提取条件对所得物质抑菌效果的比较分析
通过对所得数据的方差分析,以抑菌率为单因
变量,以工艺参数为多因素。方差分析结果如表 3
与表 4 所示。
表 3 活性物质对单增李斯特菌抑菌率的方差分析
Table 3 Analysis of variance with the results of inhibitory rates on L. monocytogenes
变异来源
Variation Sources
平方和
SS
自由度
df
均方
MS F
显著性
Sig.
重复 Repeat 0. 001 1 0. 001 1. 480 0. 326
A 0. 001 3 0. 000 0. 528 0. 679
B 0. 001 3 0. 000 0. 550 0. 666
C 0. 008 3 0. 003 3. 361 0. 096
表 4 活性物质对副溶血性弧菌抑菌率的方差分析
Table 4 Analysis of variance with the results of inhibitory rates on V. parahaemolyticus
变异来源
Variation Sources
平方和
SS
自由度
df
均方
MS F
显著性
Sig.
重复 Repeat 0. 001 1 0. 000 1. 069 0. 486
538Vol. 27 蓝蔚青等:超临界 CO2 萃取法提取棘托竹荪中的活性物质及其抑菌效果研究
A 0. 001 3 0. 000 0. 479 0. 709
B 0. 001 3 0. 000 1. 080 0. 426
C 0. 008 3 0. 003 4. 471 0. 057
结果表明:棘托竹荪提取物对单增李斯特菌与
副溶血性弧菌抑菌率的重复数据无显著性差异。A
因素(萃取压力)与 B 因素(萃取温度)间的差异不
显著,说明其对单增李斯特菌的抑菌率影响虽不明
显,但其重要程度要高于 C 因素(萃取时间) ,萃取
时间才是决定对两种菌抑菌率高低的关键因素。该
结果与极差法所得结论保持一致。
2. 4 最佳提取条件的筛选
通过对数据多因素多水平的比较分析,获得竹
荪提取物对单增李斯特菌与副溶血性弧菌抑菌率的
边际均值图(图 1a与图 1b)。通过对边际均值的多
重比较,可衡量不同组合对两种菌的抑菌率高低。
从图 1a可以看出,A2 与 C3 对单增李斯特菌的抑菌
效果好,而 B2 至 B4 的边际均值较为相近。通过在
A2B3C3 和 A2B4C3 工艺参数下进行提取实验,结果
测得两种条件的提取率分别为 83. 8%与 84. 7%,均
低于正交实验所得的最优组合 A2B2C3 的 85. 7%,
故确定 A2B2C3 为最优组合。从图 1b 中可看出
A2B2C3 为最优组合,抑菌率为 98. 2%。因此,超临
界 CO2 萃取法提取棘托竹荪活性物质的最优提取
工艺参数为:20MPa,35 ℃,120min。
0.84
0.83
0.82
0.81
0.80
0.79
0.78
0.77
0.76
0.94
0.93
0.92
0.91
0.90
0.89
0.88
0.87
0.86
0.85
0.84








K1% K2% K3% K4
水平
A萃取压力
B萃取温度
C萃取时间
A萃取压力
B萃取温度
C萃取时间
K1% K2% K3% K4
水平
a b
图 1 棘托竹荪提取物抑菌率的多重比较图
Fig. 1 Multiple comparisons with the results of inhibitory rates for active substances from D. echinovolvata
注:a.单增李斯特菌;b.副溶血性弧菌
Note:a. L. monocytogenes;b. V. parahaemolyticus
3 结论
本文尝试应用超临界 CO2 萃取技术提取棘托
竹荪中的抑菌物质,根据抑菌率高低衡量其提取效
果,并优化了提取工艺参数。结果得出:超临界 CO2
萃取法所得的棘托竹荪提取物对单增李斯特菌和副
溶血性弧菌均具较好的抑制作用。抑菌物质提取的
最佳工艺参数为:萃取压力 20 MPa,萃取温度 35
℃,萃取时间 120 min。棘托竹荪活性物质对两种菌
的最小抑菌浓度(MIC)均为 15. 0 mg /mL。处理后
24 h后,其对单增李斯特菌与副溶血性弧菌的最佳
抑菌率分别为 85. 7%和 98. 2%。
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(上接第 836 页)
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