全 文 ：收稿日期:1999-11-12初稿;2000-02-28修改稿
福建省教委资助项目
　食用菌学报　2001.8(1):15～ 18
　Acta Edulis Fungi
棘托竹荪子实体水溶性多糖 DE2-2的
分离纯化和鉴定
林玉满1　余　萍2　刘艳如2
(1福建师范大学实验中心 ,福州　350007;2福建师范大学高分子研究所 ,福州　350007)
摘　要　棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata Zang , Zheng et Hu)子实体干品经热水抽提 , 乙醇
沉淀 ,蛋白酶法和 Sevag 法去蛋白后得粗多糖 DE。 DE 经乙醇分级沉淀得到三个级分 DE1 、DE2 和
DE3。DE2 经 DEAE-Sephadex A-25 柱进一步纯化得到棘托竹荪多糖纯品 DE2-2。 DE2-2 经
高效液相色谱法测定为均一物质。红外扫描表明 ,其具有典型的多糖吸收峰。纸层析和气相色谱
分析结果表明 , DE2-2 的单糖组成为:D-葡萄糖 、D-甘露糖 、D-半乳糖和 L-岩藻糖 , 其摩尔比
为 8.68∶1.00∶1.85∶0.74 ,分子量约为 84000。经测定 , DE2-2 具有一定的抑瘤活性 , 其抑瘤率为
38.93%。
关键词　多糖;竹荪;纯化;抑瘤;真菌
多糖是一类非特异性免疫增强剂 ,具有复杂的 、多方面的生物活性 ,对肿瘤 、心血管疾病有
一定疗效 。随着云芝多糖 、香菇多糖等真菌多糖在临床上的广泛应用 ,人们对真菌多糖的研究
日益重视 。
人工栽培的棘托竹荪子实体不仅味道鲜美 ,营养丰富 ,而且长期服用可降低血压 ,减少血
液中的胆固醇含量 ,并具有减肥等功效〔1〕 。本文将报道棘托竹荪子实体水溶性多糖 DE2-2
的分离纯化和分析。
1　材料和方法
1.1　材料和试剂
棘托竹荪子实体干品系福建古田人工栽培。
T 系列标准分子量 Dextran(T -2000 ～ T -20)、DEAE-Sephadex A-25为 Pharmasia公
司产品 ,D-葡萄糖 、L-岩藻糖为 Serva公司产品 ,其余试剂均为国产分析纯试剂。
昆明种小白鼠购自福建医科大学。
1.2　主要仪器
气相色谱仪为岛津 GC-RIA , OV -225填充柱。红外光谱仪为岛津 IR-408型 。紫外
光谱仪为 UV -300型 。LKB 柱层析系统。高效液相色谱仪为岛津 LC -6A 型 ,色谱柱为
Bio-Gel TSK-40 , TSK-50。
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2001.01.004
1.3　方法
1.3.1　多糖的分离和纯化
棘托竹荪子实体干品洗净剪碎后 ,用 98 ～ 100℃蒸馏水提取 2次 ,每次 5h ,离心去残渣 。
上清液浓缩后 ,先用蛋白酶法去蛋白〔2〕 ,再用 Sevag 法去蛋白〔3〕 ,透析后用 3倍体积的 95%乙
醇沉淀 ,沉淀物经冷冻干燥后得到粗多糖DE 。将粗多糖DE溶于适量的蒸馏水 ,加 40%、60%
和80%乙醇分级沉淀 ,得到相应多糖的三个级分为 DE1 、DE2和 DE3。将收率较大的多糖
DE2用 DEAE-Sephadex A -25 柱纯化。上样后 , 先用 0.1mol/L NaCl 溶液洗脱 , 再用
3.9mol/ L NaCl对 0.1mol/L NaCl进行直线梯度洗脱 。以苯酚-硫酸法〔4〕隔管检测洗脱液 ,
得到二个级分 DE2-1和 DE2-2。DE2-2经蒸馏水透析 ,减压浓缩 ,乙醇沉淀 ,冷冻干燥即
得纯化多糖。
1.3.2　多糖纯度及分子量的测定
采用高效液相色谱法测定多糖的纯度和分子量〔5〕 。多糖分子量 M 与分配系数 Kav 、洗脱
体积 Ve的关系为:Kav=K1-K2lgM , Kav=(Ve-Vo)/(V t-Vo)(其中 K1 ,K2为常数 ,Ve为
洗脱体积 ,Vo 为柱的空体积 ,Vt为柱的总体积)。标准品和样品均配成浓度为 1.0%(W/V)
的溶液 ,由注射器相继进样 ,进样量为 20μL ,洗脱液为 2.0×10-2mol/ L 、pH6.0 磷酸缓冲液 ,
流速为 0.7mL/min 。用标准分子量的 Dextran T -2000和葡萄糖分别测定所用 TSK柱的 Vo
和V t ,由标准分子量的 Dextran T -110 、T -70 、T -40 、T -20的洗脱体积 Ve ,结合 V t和 Vo
计算得到 Kav 。Kav 与 lgM 存在线性关系 ,在半对数坐标纸上画出Kav对 lgM 的标准曲线 ,由
样品的 Ve值计算 Kav ,从标准曲线上查找对应的 lgM ,最后得到样品多糖 DE2-2的分子量。
1.3.3　多糖组成的测定
多糖含量分析用苯酚─硫酸法 。多糖完全酸水解:取多糖 DE2-2 10mg ,加 2N H2SO4
3mL ,封管 ,100℃水解 6h ,用 BaCO3 中和水解液 ,过滤 ,浓缩 ,作纸层析。层析纸采用新华中速
层析滤纸 ,分别采用醋酸乙酯∶吡啶∶水(10∶4∶3)和正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶5)为展开剂 ,显色剂
为苯胺-邻苯二甲酸 ,显色后于 105℃加热 10min ,观察结果。
DE2-2完全酸水解液加入 3 ～ 5mg 钠硼氢(NaHB4)还原后 ,减压浓缩至干 ,加入甲醇溶
解残留物 ,抽干后 ,加入醋酸∶吡啶(1∶1)2mL ,将其制成还原乙酰化衍生物 ,进行气相色谱分
析 ,并与标准单糖对照 ,确定组成单糖种类 ,计算单糖组成的摩尔比。
1.3.4　多糖的光谱分析
红外光谱测定时取 2mg 多糖 ,与 KBr压片 ,用岛津 IR-408扫描;紫外光谱测定时 ,将多
糖浓度配成 500μg/mL ,采用 UV-300紫外光谱仪扫描。根据红外光谱和紫外光谱的测定结
果进行分析。
1.3.5　多糖的抑瘤实验
取传代后 7d的 S-180的小鼠腹水瘤 ,用生理盐水洗涤 ,离心 ,上清液以生理盐水稀释至
每毫升1.0×107 个细胞 ,雌雄各半的昆明种小鼠腹下接种0.2mL ,接种肿瘤 24h后 ,开始腹腔
注射多糖 DE2-2水溶液 ,剂量为 20mg/kg ,每天一次 ,连续给药 7d ,接种后生长 14d ,然后杀
死小鼠 ,称瘤重 ,与对照组比较 ,计算抑瘤率。实验中无一小鼠死亡。
抑瘤率=对照组平均瘤重 —实验组平均瘤重对照组平均瘤重 ×100%
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2　结果
棘托竹荪子实体干品经热水抽提 ,去蛋白 ,乙醇分级分离得三个组分 DE1 、DE2和 DE3 。
DE2上 DEAE-Sephadex A-25柱进一此纯化 。上样后 ,先用 0.1mol/L NaCl溶液洗脱 ,以苯
酚-硫酸法隔管检测洗脱液 ,得到一个洗脱峰 DE2-1;层析柱再用 3.9mol/L NaCl溶液对
0.1mol/ L NaCl溶液进行直线梯度洗脱 ,得到另外一个洗脱峰 DE2-2。DE2-2经蒸馏水透
析 ,减压浓缩 ,乙醇沉淀 ,冷冻干燥即得纯化多糖。
DE2-2经高效液相色谱法测定得到一个单一的对称峰 ,表明 DE2-2是均一的纯多糖。
DE2-2经完全水解后纸层析 ,醋酸乙酯∶吡啶∶水(10∶4∶3)为展开剂 ,与相应的标准品对
照 ,发现多糖的单糖组成为 D-葡萄糖 、D-甘露糖 、D-半乳糖和 L -岩藻糖 。若以 D-甘露
糖的 Rf值为 1 ,则它们相对 Rf值之比为:D-葡萄糖∶D-甘露糖∶D-半乳糖∶L -岩藻糖=
0.85∶1.00∶0.62∶1.60;用正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶5)为展开剂 ,获同样结果 ,若以 D-甘露糖的
Rf值为 1 ,则它们的相对 Rf值之比为:D-葡萄糖∶D-甘露糖∶D-半乳糖∶L-岩藻糖=0.70
∶1.00∶0.74∶1.32。DE2-2 水解后制成的乙酰化衍生物 ,经气相色谱分析表明含有 4种单
糖 ,D-葡萄糖 、D-甘露糖 、D-半乳糖和 L -岩藻糖 ,其摩尔比为 8.68∶1.00∶1.85∶0.74 。
DE2-2纯品经苯酚─硫酸法测定 ,糖含量为 99.1%,经高效液相色谱法测定 ,其分子量为
84000。
多糖 DE2-2与茚三酮反应为阴性 ,紫外光谱在 260nm 和 280nm 处无吸收峰 ,表明该多
糖不含核酸和蛋白质;红外光谱测定结果表现出该多糖的特征吸收峰分别为 3375cm-1 、
2930cm-1 、1730cm-1 、1635cm-1 、1410cm-1 、1250cm-1和 800cm-1 。800cm-1的吸收峰表明存
在着甘露糖。
多糖 DE2-2对小鼠肉瘤 S-180具有一定的抑制作用 ,其平均抑制率为 38.93%。
表　多糖 DE2-2的抗肿瘤活性
Table　Antitumor activity of polysaccharide DE2-2
多　　糖
Polysaccharide
剂　　量
Dose
(mg·kg -1·d-1×7)
小 鼠数
Nos.of mouse
平均瘤重
Average w eight
of tumor (g)X±SD
抑 瘤率
Ant itumor ratio
P　　值
P value
20 10 0.91±0.45 30.53% <0.05
DE2-2 20 10 0.84±0.37 35.88% <0.01
20 10 0.65±0.28 50.38% <0.01
对　照 Cont rol 20 1.31±0.43
3　讨论
对竹荪子实体多糖的研究国内外已有报道 ,但为数尚少 。Ukai S 等从长裙竹荪子实体中
分离出多糖 T-2-HN〔6〕和 T -5-N〔7〕 ,Hara C等从长裙竹荪中分离出多糖 T-3-M〔8〕和 T
-4N〔9〕 ,这些多糖对 S-180肉瘤都有不同程度的抑制作用 ,但它们的单糖组成都不同于 DE2
-2。由于多糖的抗肿瘤活性受到多糖给药途径 、动物品种 、多糖剂量和多糖化学修饰等因素
的影响 ,因此 ,多糖 DE2-2有无实用价值 ,还需进一步深入研究 ,才能得出更有意义的结论。
171 期　　　　　　　　林玉满等:棘托竹荪子实体水溶性多糖 DE2-2 的分离纯化和鉴定
参　考　文　献
1　胡宁拙.竹荪人工栽培技术.中国食用菌 , 1986 ,(3):25 ～ 26.
2　张惟杰主编.复合多糖生化研究技术.上海:上海科技出版社 , 1987.213.
3　Staub AN et al.Removal of pro teins from poly saccharides.Methods in Carbohydr.Chem , 1956 , 5～ 6.
4　Michel D et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substance.Anal.Chem., 1956 ,
(28):350 ～ 357.
5　张惟杰主编.糖复合物生化研究技术(第二版).杭州:浙江大学出版社 , 1999.117.
6　Ukai S et al.Po lysaccharides in fung i.V.I solation and characterization of a mannose from aqueous ethanol ex-
tract of Dictyophora indusiata Fish.Chem.Pharm.Bull., 1980 , 28(9):2547 ～ 2652.
7　Ukai S et al.Poly saccharides in fungi.IX.A β -D-g lucan from alkaline ex tract of Dictyophora indusiata
Fish.Chem.Pharm.Bull., 1982 , 80(6):2147～ 2154.
8　Har C et al.A(1※3)-α-D-mannan from a water ex tract of Dictyophora indusiata Fish.Carbohydr.Res.,
1988 , 73:332～ 338.
9　Hara C et al.A branched(1※3)-β-D-glucan from a sodium carbonate ex tract of Dictyophora indusiata
Fish.Carbohydr.Res., 1983 , 117:201～ 213.
Isolation , Purification and Identification of
Water-Soluble Polysaccharide DE2-2 from
Fruitbodies of Dictyophora echinovolvata
Lin Yuman
1　Yu Ping2　Liu Yanru2
(1 Experiment Center , Fujian Normal University , Fuzhou　350007)
(2 I nstitute of Polymer Science , Fujian Normal University , Fuzhou　350007)
Abstract　The crude polysaccharide DE was ex tracted from dried fruitbodies of Dictyophora echinovolvata by
hot w ater ex traction , ethanol precipitation and depro teinization with protease method and Sevag method.Then three
f ractions DE1 , DE2 and DE3 w ere obtained by fractional precipitation of DE with ethanol.While pure DE2-2 w as
obtained by fur ther purification of DE2 with DEAE-Sephadex A-25 and its homogeneity was verified by HPLC.
And typical abso rption peaks of poly saccharide were found with IR-scan.It w as proved that DE2-2 was com-
po sed of D-glucose , D-mannose , D-galactose and L-fucose with a molar ratio of 8.68∶1.00∶1.85∶0.74 by paper and
gas-phase chromato graphy.The molecular weight of DE2-2 was estimated to be 84000 w ith an inhibition rate of
38.93% to Sarcoma-180 implanted in mice.
Key words　Poly saccharide;Dictyophora echinovolvata;Purification;Sarcoma-180-inhibition;Fungus
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