全 文 ：湖北农学院学报 3 1 (3 ):9 1 8一 9 13 , 1 9 9 3
J以 r 曰 J Hu七日 招油川陀少创 O目栩 e
玉蜀黍黑粉菌担饱子萌发及侵染过程的研究
张 修 军
湖北农学院 , 江陵 4 3 4 1 0 3 )
R ihc
a
dr M Q洲阵 r
`见汤。 分 矿洲城乒目 况沁跳艺 , 艺如帐物妙 了 刀如必, 以尤 2
摘 要 从担艳子的体外有发 , 人工接种方法 、 萌发 、 任染和扩展过程的扫描电镜及
乳盼 油组织进明法现察几个方面研究了相互亲和的基因型的玉 菊泰黑粉菌担艳子培养物 。
结果表明 ( l) 担艳子体外环境水份的连续蒸发和丧失可能是担抱子菊发的决定性因素 ; (2 )
玉 蜀事黑粉 菌的质取及 双核菌丝体 的形成雷要在寄主组织内的特珠环垅下 才能完成 , (3 )
注射接种是用担艳子诱发玉 来苗发病的最有效的方法 , 其扶术关健是让 惫浮液自苗基郊注
入沿 未展开的叶束上升到顶娜苗心滋出 ; (4 ) 担艳子的翁发及俊入完成于接种后 3一 24 场
(匀 接种后 4一 6 d 左右 , 寄主肺瘩出现前 , 受俊染组织 内已充满网状的双核菌丝体 。
关键词 。目脚扣 门盯 d肠 担艳于 ; 萌发 ; 怪染 , 电镜现察
中图法分类号 5 4 5 2 . 4 ; 5 513
玉蜀黍黑粉菌 了肠 ,了构卯 二 a尹 d括 )为局部侵染的黑粉菌 , 在寄主受害部位形成肿瘤 。 越
冬冬抱子为其侵染来源 〔 ’ 〕 。 冬抱子萌发形成两对相互亲和的四种基因型的担抱子 (朋劝助
碱 )。 担抱子以芽殖方式形成次生担抱子 , 在人工培养基上表现为细菌状的菌落 。 + 、 一 两
种相互亲和的不同基因型的担抱子同时侵染寄主才能发病 。 尽管早期在担抱子的萌发及侵染
方面 已有许多研究 , 但对其萌发的决定因子 、 质配发生的时间和部位 、 能否人工诱发 、 人
工接种的合适方法 、 以及萌发和侵染过程的超微研究等方面均有不同见解 、 疑问及研究空白
〔 ’ 一 ” 〕 。 本文旨在探求其中的部分问题 。
材料和方法
1
.
1 材料来源
四种基因型的担抱子 5 18 ( A刀 ) 、 5 1 9 ( A b ) 、 5 2 0 ( aB ) 、 5 2 1 ( ab ) 均由英国伯明翰大学 J
A 。~ 教授提供
, 以冷冻干操法长期保存 。 使用前培养于琼脂完全培养基上 。 四种担抱子
中 5 18 与 52 1 、 5 19 与 5 2 0 分别为相互配合的担抱子基因型 。 本试验选用的是 5 1 8 、 5 2 1 基因
组合 。 所谓担抱子皆为人工培养的次生担抱子 。
1
.
2 担抱子的液体培养及制备方法
培养用液体完全培养基 。 完全培养基主要配方为 (以 lL 培养基计 ) :
收稿 日期 : 19 93 一 0 5 一 0 7
湖 北 农 学 院 学 报 3 1卷
蔗糖 1 59 , 盐溶液 6 2 . sml , 微量元素溶液 sml 。 其中 : 盐溶液的组成为 (以 lL 盐液计 ) :
醉母浸膏 49 , 叭叽 1 6 9 , Na Zso4 4 9 , M的q · 7乓 0 4 9 , 。 a : · 6姚 0 1 9 , K C I 89 ; 微量元素溶液的组成为 (以 lL 微量元素溶液计 ) , 妈 B场 .0 69 , 冈 3 · 6妈 0 .0 19 , 。 巧。 4 · 5瑰 O
0
·
4 9 , N aM叭 · 2乓 0 0 · 0 4 9 。 2 5 oC 下振荡培养 ( 2 0 0mr/ in ) 12 h ; 2 0 0 0mr/ ln 离心 s m in ; 用等量燕馏水悬浮 , 其浓度约为 1 x 10 7 担抱子 m/ l 。
` 3 体外萌发试验
将两种类型的担抱子按上述方法液体培养 找 h , 另取苗龄为两周 的玉米苗 (品种
aE面 g ) 5 0 0 9 , 加少量 PH 7 的磷酸缓冲液研钵内榨汁 。 按 5 18 , 5 1 8 + 玉米苗汁 , 5 2 1, 5 2 1 +
玉米苗汁 , 5 18 x 5 2 1 , 51 8 x 5 2 1 + 玉米苗汁 6 个处理 , 各取抱子培养液或抱子混含液 s ml 于
灭菌试管内, 加玉米苗汁或蒸馏水 2 而 , 使总体积达 10 ml 。 充分混合均匀后 , 各取 l ml 于
无菌培养皿内铺成一薄层 , 置 25 o C下培养 。 试验重复两次 , 每 理 h 或 2 4 h 取样在显微镜下
镜检 , 观察担抱子形态结构的变化 。
` 4 玉米苗接种方法的比较
按 1. 2 所述方法制备的担抱子悬浮液 5 18 、 5 12 等量混合, 用叶片接种 、 叶心接种和苗基
部注射接种三种方法在沮室内接种苗龄为 2 周的玉米苗 (品种 aE ir in g 》 。 叶片接种为将直径约
s m m 的脱脂棉球浸透棍合抱子悬浮液 , 撕成一薄层铺盖于接种叶片的正反两面 , 外用聚乙烯
塑料袋套住植株保湿 Z d 。 苗心接种为向玉米苗心灌注抱子悬浮液 , 另加浸有担抱子液的脱脂
棉球于其上 , 套袋保湿 Z d 。 注射接种为自苗茎部离地约 2 。 处用注射器将抱子悬浮液注入
至抱子悬浮液沿未伸展的幼叶上升由苗心顶部溢出时为止 。 三种接种法各接种 10 株 , 共 30
株 。 接种苗每周不定期观察发病情况 , 直至植株成熟 。 此外 , 在不同时期 , 还注射接种了大
量不同苗龄的玉米植株 。
` 5 萌发和侵染的电镜观察
选取苗龄为 l 周的玉米苗 (品种 arE iln g ) , 分 3 h , s h , 12 h , 及 2 4 h 4 组 , 每组分 3 个处理 , 分别用 5 18 , 5 21 , 及 5 1 8 x 5 21 进行注射接种 , 置 25 o C下培养 , 接种植株准时自基部剪
回 , 将接种处至叶束剖开 , 剪成 0 . 5 cm x 0 . s cm 大小 , 采用常规的生物材料固定及临界点干
操法制片 , 扫描电镜观察 。
` 6 侵染和扩展过程的乳珊油透明观察
用 5 1 8 、 5 2 1 及 5 1 8 x 5 2 1 注射接种苗龄为一周的玉米苗 , 分 2 4 h , 3 d , 4 d , 6 d 剪取 ,
投入 0 . 1% 棉兰乳酚油中 , 加热至沸腾 , 取出放入无色乳酚油中透明 , 剪成小段剖开制片 ,
显微观察 。
2 结果和分析
2
·
1 体外萌发试验
如表 l , 在 2 5℃的培养条件下 , 48 h 内 , 随着水分的蒸发 , 各处理培养皿内的次生担抱
子萌发菌体不断地伸长 , 转向菌丝体形态 , 到水份蒸于时 , 表现为细长的单核无色透明菌丝 。
这些菌丝为单核菌丝 。 但继续留在试管内振荡培养的各处理担抱子液 , 48 h 内体积无明显变
3 期 张修军等 :玉肠黍黑粉菌担饱子萌发及俊染过程 的研究
化 , 镜检除观察到少数担抱子形态变长外 , 未观察到任何类似于菌丝的结构 。 加新鲜玉米苗
汁处理与未加者萌发情况一样 。 这显示担抱子向菌丝形态的转化与水份有密切关系 , 而与培
养液的寄主成份其它化学因子无关 。 5 21 x s ls 的振荡培养未观察到次生担抱子的相互配合及
菌丝的形成 , 而其培养皿萌发试验与单一的 5 21 和 5 18 的萌发 、 转化无异 , 表明 5 21 、 5 18 及
其单核菌丝在上述情况下不能进行质配形成双核菌丝体 。
表 1 玉米黑粉病菌次生担抱子的体外萌发
处 理 培养皿薄层法 试管振荡培养法
5 1 8
5 1 8 + 玉米苗汁
5 2 1
5 2 1 + 玉米苗汁
5 1 8 X 5 2 1
5 I 8 X 5 2 1 + 玉米苗汁
+
十
注 : + 表示 48 h 内次生担抱子转化成单核菌丝体 ; 一 表示 48 h 内未见菌丝体形成 。
2
.
2 接种方法的比较
3 种接种方法的试验发现 , 注射接种的 10 株玉米苗株株发病 。 接种后一周 , 在接种
部位以上生长出的茎 、 叶中即可观察到略为肿大的组织 , 其后不断膨大 , 形成肿瘤 。 在
另外的注射接种苗中 , 作者发现 , 若苗龄过小 , 肿瘤一般发生于未伸展的茎状叶原基和
叶束上 , 植株无法抽出新叶片 , 易过早死亡 。 若苗龄在 3 周以上 , 接种部位高 , 则肿瘤
一般出现于伸长出的叶片上 。 此外 , 当注射接种不当 , 抱子悬浮液未能自苗基部沿叶束
上升至顶部由苗心溢出时 , 接种成功率明显降低 。 因此 , 使抱子悬浮液自苗基部沿叶束
上升至苗心溢出是注射接种成功的关键 。 叶片接种和苗心接种 20 株植株 , 一直观察到
植株成熟 , 始终未见肿瘤组织出现 , 未见发病 。
2
.
3 次生担抱子在玉米上萌发的电镜观察
扫描电镜观察发现 , 5 2 1 , 5 18 与 5 2 l x 引 8 处理萌发过程中无明显差异 。 3 h 内, 担
抱子萌动 , 此期仍观察到正在芽殖的担抱子 。 接种后 s h , 绝大多数担抱子萌发 , 形成
芽管 。 接种后 12 h , 形成大量菌丝 , 担抱子原形仍清晰可辨 。 2 4 h , 菌丝在植株表面铺
展开来 , 担抱子原体消亡 。 3 种处理均形成同一类型的单核菌丝 , 表明菌丝来源于单一
的担抱子 , 5 18 与 5 2 1在体外未能发生质配 。
2
.
4 侵染和扩展的乳酚油透明观察
2 h4
, 5 18 x 5 21 接种处理中 , 在幼嫩组织的边缘 , 观察到发丝状的菌丝 , 相应部位的
寄主组织内亦可发现相对粗的菌丝 。 5 18 和 5 21 处理虽然可观察到发丝状的菌丝 , 但寄主
组织内无菌丝 。 5 8I x 5 2 1 接种后 3 d , 某些细胞染色加深 , 其内有大量的菌丝存在 。 接种
后 4 d , 组织无明显肿大 , 但组织内已有交织成网状的菌丝体出现 , 接种后 6 d , 植株有明
显肿瘤出现 , 菌丝体遍布肿瘤组织内 。 这一结果可解释为侵入组织内的 5 18 和 5 ” 的芽管
(或称单核菌丝 ) 成功地完成了质配 , 发展成了双核菌丝 , 导致肿瘤即病害的发生 。
湖 北 农 学 院 学 报 1 3 卷
3 讨论与结论
( l) 担抱子萌发的决定性因素可能是环境基质水份的逐渐蒸发和丧失过程 , 而不是寄主
成份及其它因素 。 玉蜀黍黑粉菌要成功地导致寄主发病 , 需要两种相互亲和的基因型的担抱
子同时存在 。 担抱子在体外及侵入前的萌发是否依赖于彼此的共同存在及寄主方面的因素 ,
一直不清楚以 弓〕 。 试验表明 , 担抱子向菌丝形态转化的决定因素是水份 , 即在环境变干 , 水
份逐渐丧失的过程中转变为菌丝形态 。 这一现象是否与氧气的富 、 缺有关 , 有待进一步的研
究 。 在自然状态下 , 植株表面的雨水 、 露水等会逐渐燕发 , 担抱子随环境水份的蒸发和丧失
而萌发 , 可以认为是在长期的进化过程中形成的对环境的一种适应 。 加入玉米苗汁对萌发无
影响 , 表明萌发可能与寄主因素无关 。
( 2) 相互配合的基因型的担抱子及其萌发的单核菌丝在体外或侵入寄主前不能相互交配
形成双核菌丝 , 玉蜀黍黑粉菌的交配及双核菌丝体的形成需要寄主组织内的特殊环境 。 成功
的发病取决于组织内形成一种具有两个来源于相互亲和的担抱子细胞核的双核菌丝体 。 体外
萌发试验及注射接种后的电镜观察 , 除单核菌丝外 , 未发现担抱子及单核菌丝间交配形成的
双核菌丝 。 而注射接种后 别 h 的乳酚油透明观察到 5 18 X 5 2 1 处理的寄主组织内的菌丝明显
粗于寄主组织外的单核菌丝 , 且几天后寄主组织内形成典型的网状双核菌丝体 。 同时 , 体外
加玉米苗汁无法诱发担抱子的萌发 、 交配及双核菌丝体的形成 , 可认为是因为缺乏活的寄主
组织内的特殊环境 , 即交配只发生于活的寄主组织内一 发生于担抱子萌发后侵入寄主组织内的单核菌丝之间 。 这一结果不同于有关玉蜀黍黑粉菌的交配能够发生于体外的观点〔5 〕 。
《3) 已伸长出的叶片不会受到担抱子的侵染 , 注射接种是诱发玉蜀黍黑粉菌侵染玉米的
最有效的方法 , 其技术关键是让抱子悬浮液沿未展开的叶束上升至顶部由苗心溢出 。 一般认
为 , 玉蜀黍黑粉菌在自然状态下是自植株上的幼嫩组织和器管侵入的 , 已伸展出的叶片较为
成熟 , 因此叶片接种失致 。 苗心接种因为抱子悬浮液不易到达叶原基及生长点等幼嫩组织和
器官 , 所以同样失败 。 往射接种易成功是因为抱子悬浮液直接与叶原基及未伸展的幼叶等幼
嫩组织接触 , 便于直接俊入 。 另外注射造成伤口 , 病菌更易直接从伤口侵入 。
( 4) 担抱子的萌寒及侵入完成于接种后 3一 24 h 内 。 担抱子的萌发始于接种后 , h
左右 , . 2 4 h 左右全部转化为单核菌丝 , 担抱子原体消亡 。 同时此期寄主组织内的相应部位已
有大量菌丝出现 。 寄主组织肿瘤形成之前 , 即接种后 4 一 6 d 左右 , 寄主组织内已有密集的网
状双核菌丝体出现 。
致 谢 作者感谢英国伯 斯大学生物 系作物保护研究室全体成员的热忱关怀和带助性
参 考 文 献
1 U r e c h P A
.
nI
v e t iga it on
s
on 山。 corn
s m u t c a u 鱿刁 by L加感哲 . 四峨户d 冰 · 外尹。声 th ol 2, 1 9 7 2, 7 3 ,
1 e 2 6
Z A印陷池 G N · P肠 n t aP ht d q 升 . 3dI 助 . A ca d恤 ie P” 比` 1 9 8 8 · 4 7 5 一 4 7 8
3 。血~ J J
,
C沁川 翻u t ca l翻川 勿 之翻内卯 忍峨脚公 心 A m hP yt O I. 山川 S 兀 M O劝叹乒, 1 9 6 3 , 2 , l 一 4 1
4 F阮 h er G W , H o lot n C 5 . 川d 峨井 an d con 栩目 Of ht e 二讯 fu心 · N e 娜 Y , U R O们口 dl P荡 19 57 ·
5 方中达 . ,普通植物 病理学 (上 ) . 北 京 : 农业 出版社 , 197 .8 6 8 一 6 ,
3期 张修军等 : 玉蜀黍黑粉菌担抱子萌发及侵染过程的研究 1 9 3
S灿加S 以】白即m如旧tk 抓 A旧 幻住兄位拍 of ofCa n r 3m Ut F场嘟
h Z
a n g X i咖n
`勿饭叨 了 产殆盯了乃叻诚舒 , 石白吞 , 心 7元似出心留 d洲啥扮 ,声砚娜哲 4 34 103 夕
R ich
a
dr M O为pe r
乙见汤。才 of 局晒娜对 演绒幻心 , 动协明砂 of 石切办 洒百功 丑留尸 加厂 U · 式夕
A b s t r ac t tS u d ies w e r e m a d e o n t h e ge
r m i n a t i o n a n d t h e in f eC ti
o n P
ocesr
o f t h e
co m aP it bl e ge n ot yp巴 of b as i d l仍 P o r eS cu lt uer of 乙勃蜘卯 双砚尸面 iw ht ht e g~ in a d o n in vi t or
田七断创谧】 in ~ aI
t io n m e ht od
, 。 h 记
var
ti o sn on ht
e
ge mr in
a d o n
,
in 介团o n an d ht e 稗 ht 哪笋 n
d eV o 】o Pm en t in h OtS t加u e 勿 ~
n in g el etC or
n m icr a 鱿D ep or 】a CP h en ol t eC h n i q u e of 奴 ue
atr
n s钾 r e n cy · T h e r es u】st i n d ica et t h a t : t h e rP
~
Of ve a P 0 r a it o n a n d th e IOeS of
w a et r
oc
u r e d a r o u n d th e b a s i d ios op esr m
a y b e a c r i t ica l fa c ot r to t h e g e r m i n a t io n o f t h e
b as id iOS P 0 r瑞 ht e ytC 叩 k . m a m a tin g of 乙施砂刀 刀砚矛沥 an d ht e for m at io n of ht e ib n ud ea et
m yeC liu m de m
a n d t h e s lx 幼 if e en 访omr en
t i n t he h以 t触川代 ht e i心狱 io n in ocu lat io n on ht e
b口 eS of ht e se 曰 l il n g 15 ht e m OtS ef fe c it , m e th do ot in d cue ht
e
~
sm ut d i se a se
, 山 e k e y
t eC h n iq , 七 ot let ht e s us pe isn o n ot 对 eS fr o m ht e b掀犯 ot h e a d al on g ht e nU o pe n de Iae f
拍 u a n d t o o v e r fl ;ow t h e g e mr i n a d o n o f ht e baS id i伪 op r es a n d t h e i n v aS ion omr 1Pet d
u ir n g
th e 拌 d记 a our n d 3 ot 2 4 h ou sr a f r e r rh e i n~ la tio n ; th e in f eC t de h o t t泌 u e w a s fu l lfl llde
诫 ht ht e n e towr ks of ht
e ib n du ae et m yeC li
u m a b o u t 4 ot 6 d ays
a f t e r th e in o c u la tion b
e of er
t
~ ou
r a P侧, r e d .
K留 W o r d s 乙饥勺口 劝砂汤 ; b as i d l仍 op r e ; g e mr i n t ion ; in f 。改ion : S EM
(审稿 : 阮华芳 ; 编辑 : 王清译 )
第一作者简介 : 张修军 , 男 , 3 0 岁 , 硕士 , 曾留学英国 , 现为湖北农学院讲师 。