全 文 :收稿日期:2012-11-21 接受日期:2013-03-20
基金项目:福建省公益类科研院所项目(2011R1024-4) ;福建省财
政专项;福州市科技计划项目(2011G93)
* 通讯作者 E-mail:hongduanlq@ 163. com;xinjianliu@ 163. net
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2013,25:1576-1581
文章编号:1001-6880(2013)11-1576-06
棘托竹荪孢子粉抗氧化活性研究
王彦辉1,2,林陈强2,邱宏端1* ,陈济琛2,林新坚2*
1 福州大学生物科学与工程学院,福州 350008;2福建省农科院土壤与肥料研究所,福州 350001
摘 要:采用水提与醇提两种方法,通过 DPPH自由基、羟基自由基、还原力、超氧自由基和对 Fe2 +的螯合力五
种评价模型研究破壁与未破壁竹荪孢子粉的抗氧化活性。结果表明:不同的提取方法抗氧化效果不同,水提与
醇提 DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和还原力较强,尤其超氧阴离子自由基清除率最高,可达
88. 10%;在羟基自由基清除率和对 Fe2 +的螯合力中,醇提比水提的抗氧化效果明显;破壁孢子粉相比未破壁的
抗氧化活性强;不同极性有机溶剂对破壁竹荪孢子粉的抗氧化活性有影响;破壁竹荪孢子粗多糖有较好的 DP-
PH自由基清除效果;初步测定了孢子粉的粗多糖、总黄酮和总多酚的含量,为开发竹荪孢子粉提供基础依据。
关键词:竹荪;破壁孢子粉;抗氧化活性
中图分类号:Q946;R285 文献标识码:A
Studies on Antioxidant Activities of Dictyophora echinovolvata spore
WANG Yan-hui1,2,LIN Chen-qiang2,QIU Hong-duan1* ,CHEN Ji-chen2,LIN Xin-jian2*
1College of Biological Science and Technology,Fu Zhou University,Fuzhou Fujian 350008,China;
2The Soil and Fertilizer Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou Fujian 350001,China
Abstract:The aim of this study was to study the antioxidant activity of water-extract and ethanol-extract of the broken
Dictyophora echinovolvata spore and unbroken spore using five appraisal models including DPPH radical,hydroxyl radi-
cal,reducing power,superoxide radicals and Fe2 + chelating power. The results showed that different extraction methods
exhibited different antioxidant activity,water-extract and ethanol-extract had better activities on DPPH radical,superox-
ide radical and reducing power,especially on superoxide radical the scavenging rate was up to 88. 10%;Regarding hy-
droxyl radical and Fe2 + chelating power,the antioxidant activity of the ethanol-extract was obviously better;The broken
D. echinovolvata spore had different antioxidant activity with different solvents,and the DPPH radical scavenging effect of
its crude polysaccharide was better;The broken D. echinovolvata spore had higher antioxidant activity than unbroken
spore. In addition,the content of crude polysaccharide,total flavonoids and total polyphenol of the spores were deter-
mined in this study. The results provided a basis for future study of D. echinovolvata spore.
Key words:Dictyophora echinovolvata;broken spore;antioxidant activity
竹荪是一种名贵的食用真菌,其营养丰富,香味
浓郁,滋味鲜美,历史上列为“宫廷贡品”、“菌中皇
后”。现代医学研究证明,竹荪具有滋补强壮、益气
补脑、宁神健脑之功效,且含有能抑制肿瘤的成分。
竹荪子实体主要可分为三大部分:菌盖、菌体和菌
托。菌盖上着生的孢体,约占竹荪子实体干重的
12%。竹荪具有抗氧化活性,对其活性成分的研究
主要集中在竹荪菌体抗氧化活性。Yang-Lin Hua 通
过水提、凝胶过滤纯化竹荪多糖,发现其具有较强的
体内抗氧化活性[1]。Jeng-Leun Mau 等研究了包括
竹荪在内的四种特殊食用菌的抗氧化活性,发现竹
荪甲醇提取物抗氧化活性最高[2]。庄永亮等发现
红托竹荪菌盖多糖具有较强的还原能力和抑制羟基
自由基的能力,且随浓度升高抑制羟基自由基的能
力相应提高[3]。李波等发现七种云南产食用菌中
竹荪的甲醇提取物抗氧化活性较突出,其总酚含量
为 15. 44 mg /g[4]。江玉姬等对 26 种食用菌子实体
水提和醇提液进行了总还原能力、羟自由基、超氧阴
离子自由基和 DPPH自由基的清除能力测定发现竹
荪的综合抗氧化活性较高,且水提活性相比醇提
高[5]。然而,对于竹荪孢子抗氧化的作用至今未见
报道,本文拟通过其抗氧化的作用研究,提高竹荪资
源利用率,研发新产品。
1 材料与仪器
1. 1 材料
棘托竹荪(Dictyophora echino-volvata Zane) ,
2012 年 6 ~ 9 月源于福建省顺昌县。
1. 2 仪器与设备
紫外可见分光光度计[UV-2800AH 型,尤尼柯
(上海)仪器有限公司];电子分析天平(AR1530,美
国) ;超低细菌型超纯水器(SPW-10TJ 型,上海赛鸽
电子科技有限公司) ;低速大容量离心机(DL-5 型,
上海安亭科学仪器厂) ;旋转蒸发器(R209 型,上海
申生科技有限公司) ;循环水多用式真空泵(SHB-
B95 型,郑州长城科工贸有限公司) ;低温冷却液循
环泵(DL1030 型,上海申生科技有限公司)。实验
所用有机试剂购于国药集团。
2 实验方法
2. 1 竹荪孢子收集与破壁竹荪孢子制备
2. 1. 1 竹荪孢子收集
采集新鲜的竹荪,将菌盖剥离,用纯水洗涤,过
滤,5000 rpm离心 5 min,将获得孢子烘干,过筛;竹
荪破壁孢子粉,由福建省仙芝楼生物公司破壁,破壁
率达 90%以上。
2. 1. 2 孢子粉水提液制备
分别精确称取破壁与未破壁竹荪孢子粉 1 g 于
50 mL锥形瓶,料液比 1 ∶ 30 加入超纯水,室温条件
下超声震荡 10 min后于 90 ℃水浴中浸提 3 h,5000
rpm离心 5 min,上清转移至 50 mL 容量瓶中,沉淀
按上述步骤再次浸提,离心,合并浓缩,定容至 50
mL。
2. 1. 3 孢子粉醇提液制备
分别精确称取破壁与未破壁的竹荪孢子粉 1 g
于 50 mL锥形瓶,80%乙醇,料液比 1∶ 30,室温条件
下超声震荡 10 min后于 80 ℃水浴中回流提取 3 h,
5000 rpm离心 5 min 上清转移至 50 mL 容量瓶中,
沉淀按上述步骤再次浸提,离心,合并浓缩,定容至
50 mL。
2. 2 抗氧化活性测定
2. 2. 1 DPPH自由基清除能力测定
参照 Vattem等的方法[6,7]进行。吸取竹荪孢子
粉的水提液和醇提液 2 mL(初提液稀释 10 倍)于
20 mL比色管中,加入 2 mL 60 μmol /L DPPH溶液,
摇匀,室温避光放置 30 min,于 517 nm 测吸光度
(As) ,空白对照为 2 mL 水或醇加 2 mL 60 μmol /L
DPPH溶液(Ao) ,以 2 mL 样品加入 2 mL 双蒸水或
醇作为样品对照(Ax) ,消除样品颜色的干扰,阳性
对照为抗坏血酸(Vc)。每个样品重复三次取平均
值。清除率 R按下式计算:
R =[1-(As-Ax)/Ao]× 100%
2. 2. 2 羟基自由基清除能力测定
参照陈留勇的水杨酸法[8],并略作改动。反应
体系中含 2 mL 6 mmol /L H2O2,2 mL 6 mmol /L
FeS04,2 mL 6 mmol /L水杨酸-乙醇溶液,待测溶液 2
mL,H2O2 最后加入启动反应。36 ~ 37 ℃水浴反应
30 min后,12000 rpm离心 6 min,以水为参比在 510
nm下测定吸光度,重复三次取平均值(Ax)。空白
对照(Ao)为 2 mL 双蒸水或醇代替待测溶液。以 2
mL 6 mmol /L FeS04,2 mL 6 mmol /L水杨酸-乙醇,2
mL待测溶液和 2 mL双蒸水或醇作为样品对照消除
样品颜色的干扰(Axo)。阳性对照为抗坏血酸
(Vc)。清除率 R计算公式为:
R =(Ao-(Ax-Axo) )/ Ao × 100%
其中 Ao 为空白对照吸光度,Ax 为加入待测溶
液后的吸光度,Axo为待测溶液的本底吸收值。
2. 2. 3 总还原力测定
总还原力测定参考 Oyaizu(1988)法[9,10],并略
作改进。取样品溶液 0. 2 mL,加 2 mL 0. 2 mol /L、
pH 6. 6 磷酸缓冲溶液和 2 mL 1%铁氰化钾(K3Fe
(CN)6)溶液于 1. 5 mL 离心管中混匀。50 ℃水浴
20 min,加 2 mL 0. 4 mol /L 三氯乙酸溶液,5000 r /
min离心 10 min,取上清液 2 mL 加 2 mL 蒸馏水和
0. 4 mL 0. 02%三氯化铁(FeC13)溶液,混合均匀,室
温下反应 10 min,700 nm下检测吸光度。三次重复
取平均值,阳性对照为抗坏血酸(Vc)。
2. 2. 4 超氧阴离子自由基清除能力测定
根据张志军的方法[11],3 mL pH 8. 2 Tris-HCl
缓冲液和 1 mL待测样品,25 ℃水浴 20 min 后加入
3 mL 7 mmol /L 的邻苯三酚,反应 4 min 后加 10
mol /L HCl终止反应,以 Tris-HCl 缓冲液作参比,在
420 nm处测吸光度,三次重复取平均值,对照组
(Ao)以蒸馏水或醇代替,空白组(Axo)为不加邻苯
三酚,阳性对照为抗坏血酸(Vc)。
清除率 R =(Ao-(Ax-Axo) )/ Ao × 100%
其中 Ao 为空白对照吸光度,Ax 为加入待测溶
液后的吸光度,Axo为待测溶液的本底吸收值。
7751Vol. 25 王彦辉等:棘托竹荪孢子粉抗氧化活性研究
2. 2. 5 对 Fe2 +的螯合能力测定
参考 Decker等的方法[12,13]并作适当修改,移取
1 mL样品,加 2. 5 mL提取溶剂混匀,各加 0. 1 mL 2
mmol /L FeCl2 溶液充分混匀,加 0. 2 mL 5 mmol /L
Ferrozine溶液混匀反应 10 min,在波长 562 nm处测
定其吸光度,重复三次取平均值,以 1mL 双蒸水或
醇代替样品作为对照组(Ao) ,空白组(Axo)不加
FeCl2,EDTA-Na2 为阳性对照。
螯合力 R = (Ao-(Ax-Axo) )/ Ao × 100%
其中 Ao 为空白对照吸光度,Ax 为加入待测溶
液后的吸光度,Axo为待测溶液的本底吸收值。
2. 3 粗多糖含量测定
参考 NY /T1676-2008 食用菌中粗多糖含量的
测定。
2. 4 总多酚含量测定[14]
分别移取没食子酸标准液(20、40、60、80、100
μg /mL)、水、待测提取液各 1 mL 于 20 mL 比色管
中,在每个试管中内分别加入 5. 0 mL 10%福林酚试
剂,摇匀,反应 5 ~ 8 min,加入 4. 0 mL 7. 5% Na2CO3
溶液,加水定容至刻度,摇匀,室温下放置 60 min,
765 nm下测定吸光度。以没食子酸标准液浓度为
横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2. 5 总黄酮含量测定
分别吸取 0、2、4、6、8、10 mL 芦丁标准液(0. 1
mg /mL)及 10 mL待测提取液于 25 mL容量瓶中,加
水至 10 mL,加入 5%亚硝酸钠 1 mL 摇匀后静置 6
min,加入 10%硝酸铝溶液 1 mL,摇匀后静置 6 min,
再加入 1 mol /L NaOH溶液 10 mL,用 60%的乙醇溶
液定容至 25 mL,静置 12 min 后,在 510 nm 处测定
其吸光度。以芦丁浓度为横坐标,吸光度(A)为纵
坐标绘制标准曲线。
2. 6 不同萃取溶剂对破壁竹荪孢子粉提取物抗氧
化活性影响
竹荪孢子粉水提液分别用石油醚、正丁醇、氯仿
和甲醇萃取,合并减压浓缩定容至 50 mL,DPPH 法
检测抗氧化活性。
2. 7 破壁竹荪孢子粉粗多糖的提取及抗氧化活性
测定
称取破壁竹荪孢子粉,料液比 1∶ 30,90 ℃水浴
浸提 3 h,5000 rpm离心 5 min,沉淀再次浸提,合并
减压浓缩后加入三倍体积的 95%乙醇溶液,4 ℃过
夜,5000 rpm离心 5 min取沉淀,真空冷冻干燥至恒
重即为竹荪孢子粗多糖。配制不同浓度的粗多糖溶
液,DPPH法检测抗氧化活性。
3 结果与分析
3. 1 竹荪孢子粉抗氧化能力
3. 1. 1 竹荪孢子粉提取物对 DPPH 自由基清除能
力
竹荪孢子粉提取物稀释 10 倍,对 DPPH自由基
清除力见图 1。由图可知,DPPH 的清除能力破壁-
醇提(PC)>破壁-水提(PH)>未破壁-醇提(WH)
>未破壁-水提(WC) ,对数据进行多重比较(P <
0. 05) ,结果表明,竹荪孢子粉乙醇提取物对 DPPH
自由基清除能力与水提物之间无显著性差异,破壁
处理后的提取物(PC、PH)与未破壁处理(WH、WC)
有显著性差异,其中破壁-醇提(PC)清除能力可达
75. 56%,抗坏血酸(VC)当量为 583. 3 μg /g。未破
壁醇提提物 DPPH自由基清除效果相比水提物有显
著性差异,说明破壁处理的竹荪孢子粉更有利于
DPPH抗氧化活性物质的提取,且竹荪孢子粉水溶
性和脂溶性的活性物质都具有较强的 DPPH自由基
清除效果。
3. 1. 2 羟基自由基清除能力
如图 2 所示,竹荪孢子粉对羟基自由基的清除
力:破壁-醇提(PC)>未破壁-醇提(WC)>破壁-水
提(PH)>未破壁-水提(WH) ,破壁-醇提(PC)的清
8751 天然产物研究与开发 Vol. 25
除率可达 54. 36%,抗坏血酸(VC)当量为 11. 87
mg /g。可见,无论是醇提还是水提,破壁竹荪孢子
粉羟基自由基清除效果显著高于未破壁样品,醇提
效果明显高于水提,表明孢子粉中脂溶性的活性物
质对羟基自由基的清除效果更强。
3. 1. 3 总还原力
采用铁氰化钾法测定竹荪孢子粉提取物还原力
结果如图 3 所示,竹荪孢子粉粗提液的总还原力:破
壁-水提(PH)> 破壁-醇提(PC)> 未破壁-水提
(WH)>未破壁-醇提(WC) ,可以看出,竹荪孢子粉
提取液的总还原力水提液比醇提液高,可能是水提
液有还原糖的存在,破壁-水提(PH)的总还原力为
1. 090,抗坏血酸(VC)当量为 2. 701 mg /g。破壁孢
子粉与未破壁孢子粉相比具有较强的还原力。
3. 1. 4 超氧阴离子自由基清除能力
竹荪孢子粉提取物对超氧阴离子的清除能力如
图 4 所示。清除力依次为破壁-水提(PH)>破壁-
醇提(PC)> 未破壁-水提(WH)> 未破壁-醇提
(WC) ,由图看出,破壁孢子粉水提和醇提对超氧阴
离子自由基的清除率都可以达到 80%以上,其中破
壁-水提(PH)清除率为 88. 10%,VC 当量为 23. 43
mg /g。竹荪孢子粉的多糖等水溶性成分对超氧自
由基清除率与醇提脂溶性物质对超氧阴离子自由基
清除能力都较强,水提相比醇提有显著性差异;破壁
与未破壁的相比,破壁竹荪孢子粉无论醇提还是水
提对超氧自由基的清除效果都显著高于未破壁孢子
粉,可能由于破壁样品有利于竹荪孢子超氧阴离子
清除物质的提取。
3. 1. 5 Fe2 +的螯合力
如图 5 所示,Fe2 +的螯合力大小依次为破壁-醇
提(PC)>未破壁-醇提(WC)>破壁-水提(PH)>
未破壁-水提(WH) ,水提液对 Fe2 +的螯合力较低,
醇提液的效果较好,其中破壁-醇提(PC)螯合力为
68. 10%,EDTA-Na2 当量为 2. 105 mg /g。可见竹荪
孢子粉脂溶性成分更容易与 Fe2 +螯合阻止 Fenton
反应的发生。
3. 2 竹荪孢子粉粗多糖含量
竹荪孢子抗氧化活性物质除小分子物质外,粗
多糖也具有抗氧化活性。采用国标的方法测定竹荪
孢子粗多糖含量,结果表明,破壁竹荪孢子粉的多糖
含量为 8. 61 g /100 g,未破壁竹荪孢子的粗多糖含量为
5. 66 g /100 g,破壁竹荪孢子能提高粗多糖含量。
3. 3 竹荪孢子粉总多酚含量
以没食子酸为阳性对照,得回归方程 y =
0. 0047x + 0. 0141(r = 0. 9991) ,说明没食子酸浓度
在 20 ~ 100 μg /mL 时线性关系良好。根据标曲换
算样品多酚含量,由表 1 可知,通过福林酚的方法测
定,不同的处理不同的提取方法,多酚的含量也不相
同,其多酚含量破壁-水提(PH)> 未破壁-水提
(WH)>破壁-醇提(PC)>未破壁-醇提(WC) ,其中
破壁-水提(PH)总多酚含量为 5. 531 mg /g为最高。
3. 4 竹荪孢子粉总黄酮含量测定
本实验采用芦丁为对照品,以芦丁浓度为横坐
标,510 nm 处吸光值为纵坐标,得回归方程 y =
0. 5257x + 0. 0041(r = 0. 9997) ,根据回归方程计算
样品总黄酮含量。由表 1 可以看出,竹荪孢子粉的
黄酮含量破壁-水提(PH)>破壁-醇提(PC)>未破
壁-水提(WH)> 未破壁-醇提(WC) ,其中水提
(PH)优于醇提(PC) ,破壁高于未破壁,破壁-水提
9751Vol. 25 王彦辉等:棘托竹荪孢子粉抗氧化活性研究
表 1 竹荪孢子粉总多酚与总黄酮含量
Table 1 Total polyphenols and flavonoids of D. echinovolvata spore
不同处理
Different treatment
总多酚含量
Total polyphenol content(mg /g)
总黄酮含量
Total flavonoids content(mg /g)
破壁-水提(PH)broken spore-water extract 5. 531 3. 271
破壁-醇提(PC)broken spore-ethanol extract 3. 914 1. 911
未破壁-水提(WH)unbroken spore-water extract 4. 127 1. 378
未破壁-醇提(WC)unbroken spore-ethanol extract 3. 000 0. 998
黄酮含量为 3. 271 mg /g。
3. 5 不同萃取溶剂对破壁竹荪孢子粉提取物抗氧
化活性的影响
分别用石油醚、正丁醇、氯仿和甲醇对水提浸膏
进行萃取,DPPH自由基清除率检测抗氧化活性,结
果发现,如图 6 所示,四种有机溶剂萃取中甲醇萃取
对 DPPH自由基清除率最大,为 63. 10%,其次为正
丁醇、氯仿,石油醚 DPPH 清除率为 1. 59%。与水
提相比,甲醇萃取液的抗氧化活性下降 15%,说明
破壁竹荪孢子粉水提液中可能存在抗氧化活性多糖
等一些水溶性活性物质。相同浓度条件下,不同极
性有机溶剂萃取中正丁醇相抗氧化活性相对较强,
可作为竹荪孢子粉小分子抗氧化活性物质分离纯化
的萃取溶剂。
3. 6 破壁竹荪孢子粉粗多糖抗氧化活性
通过水提醇提的方法得到竹荪孢子粉粗多糖,
分别配制 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5 mg /mL 粗多糖溶
液进行 DPPH自由基清除力抗氧化活性检测,发现
如图 7 所示,粗多糖 0. 1 mg /mL 时对 DPPH 自由基
清除力为 30. 86%,随着竹荪孢子粉粗多糖浓度的
增大,DPPH自由基清除力也逐渐增大,0. 5 mg /mL
时 DPPH自由基清除力可达 83. 66%,说明竹荪孢
子粉粗多糖具有较好的 DPPH清除效果。
4 结论
本研究采用 DPPH 自由基清除率、羟基自由基
清除率、还原力、超氧自由基清除率和对 Fe2 +的螯
合力对竹荪孢子粉的抗氧化效果进行评价。实验结
果发现,五种模型对不同处理不同提取方法的评价
效果不同。通过统计分析,除 DPPH自由基外,破壁
样品水提和醇提对超氧自由基清除率、羟基自由基
清除率、Fe2 +的螯合力及还原力有显著差异,破壁处
理后的竹荪孢子粉与未破壁的竹荪孢子粉相比具有
较显著的抗氧化活性,说明破壁竹荪孢子粉更有利
于活性物质的提取。针对竹荪孢子粉的抗氧化活
性,初步检测了与抗氧化可能有关的活性成分,其中
破壁-水提样品粗多糖含量可达 8. 61 g /100 g,总多
酚含量 5. 531 mg /g,总黄酮含量 3. 271 mg /g。
采用不同极性的有机溶剂对破壁竹荪水提液进
行浸提发现,甲醇的 DPPH自由基清除效果最好,但
相对水提液的 DPPH 自由基清除率下降 15%,据此
推断竹荪孢子粉还存在其他水溶性的抗氧化活性物
质,并通过竹荪孢子粉粗多糖的提取及 DPPH 自由
基清除率的测定,发现竹荪孢子粉粗多糖确实有较
强的抗氧化活性,且随着竹荪孢子粗多糖浓度的增
大,其 DPPH自由基清除率也相应增大。相同浓度
0851 天然产物研究与开发 Vol. 25
条件下,不同极性有机溶剂萃取液中正丁醇对竹荪
孢子粉水提浸膏萃取效率最高。
本论文初步研究了竹荪孢子粉的抗氧化活性,
为竹荪资源合理利用、竹荪新产品开发及提高农产
品附加值提供依据。
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