全 文 ：山西大学学报（自然科学版）３９（１）：１３３－１３９，２０１６
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
　
　　 ＤＯＩ：１０．１３４５１／ｊ．ｃｎｋｉ．ｓｈａｎｘｉ．ｕｎｉｖ（ｎａｔ．ｓｃｉ．）．２０１６．０１．０２３
莜麦Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的重组表达及抗尖孢镰刀菌活性分析
焦慧娟，刘健，石亚伟＊
（山西大学 生物技术研究所教育部化学生物学与分子工程重点实验室，山西 太原０３０００６）
摘　要：病程相关蛋白（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＲＰｓ）是植物在受到病原菌侵染或者非生物胁迫时大量分泌
的一种参与协同防御的蛋白。将莜麦病程相关蛋白ｐｅｒｍａｔｉｎ基因克隆到原核表达载体ｐＥＴ３２Ｌ，构建ｐＥＴ３２Ｌ－
ｐｅｒｍａｔｉｎ重组子，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株表达，经 Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ离子柱、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－
２００凝胶柱纯化获得分子量大小为８２ｋＤａ的电泳纯的ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ。通过滤纸片法及荧光显微镜分析重组蛋白
对尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）的影响，结果表明：Ｐｅｒｍａｔｉｎ能够显著抑制Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ菌丝生长，导致Ｆ．
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ菌丝体形态异常。此外，ＤＣＦＨ－ＤＡ荧光探针检测显示，Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白作用尖孢镰刀菌的初期引起菌丝
体活性氧含量的升高。这些结果表明Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白不仅能抑制尖孢镰刀菌生长，还能引起菌体形态变化和细胞体
内活性氧水平的升高。
关键词：ｐｅｒｍａｔｉｎ；纯化；活性氧；抗真菌性
中图分类号：Ｑ５９１　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：０２５３－２３９５（２０１６）０１－０１３３－０７
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｎａｋｅｄ　Ｏａｔ（Ａｖｅｎａ　ｎｕｄａ）
ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
ＪＩＡＯ　Ｈｕｉｊｕａｎ，ＬＩＵ　Ｊｉａｎ，ＳＨＩ　Ｙａｗｅｉ
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｈａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）ａｒｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｈｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ
ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ａｎｄ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ．ｐｅｒｍａｔｉｎｇｅｎｅ　ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ　ｔｏ　ＰＲＰｓ　ｆｒｏｍＡｖｅｎａ　ｎｕｄａ　ｗａｓ　ｉｎ－
ｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＥＴ３２Ｌｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ３２Ｌ－ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ
ｓｔｒａｉｎ　ＢＬ２１（ＤＥ３），ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ＩＰＴＧ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ＮｕｓＡ－ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　８２ｋＤａ　ｗａｓ　ｅｆ－
ｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ　ａｎｄ　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｐｅｒ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ
ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｏｒｔ
ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ｏｆ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｗａｓ　ａｃｃｕｍｕｌａ－
ｔｅｄ　ｂｙ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＮｕｓＡ－ｐｅｒｍａｔｉｎ，ｗｈｉｃｈ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｂｅ　ＤＣＦＨ－ＤＡ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇ－
ｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎｓ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｄａｍａｇｅ　ｉｔｓ　ｍｅｍ－
ｂｒａｎｅ　ｏｒ　ｒａｉｓｅ　ＲＯＳ　ｉｎ　ｍｙｃｅｌｉａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｅｒｍａｔｉｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲＯＳ；ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ
病程相关蛋白（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＲＰｓ）是植物受到病原菌侵染或者非生物胁迫时大量分
收稿日期：２０１５－０８－１２；修回日期：２０１５－１１－０６
基金项目：国家自然科学基金（３１１７０７４８）；太原市明星专项（１１０１４９０８）
作者简介：焦慧娟（１９８８－），女，山西太原人，硕士研究生，研究方向生物化学与分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｋ０７１ｊｉａｏｈｕｉｊｕａｎ＠
１２６．ｃｏｍ；＊通信作者：石亚伟，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｗｅｉｓｈｉ＠ｓｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
泌的一种参与协同防御的蛋白。根据其氨基酸序列、血清学关系以及酶学特征等，ＰＲＰｓ被分为１７个亚类
（ＰＲ１－ＰＲ１７）［１－２］，其中第５类蛋白因其氨基酸序列与非洲植物西非竹竽（Ｔｈａｕｍａ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｎｉｅｌｌｉ）的甜蛋
白（Ｔｈａｕｍａｔｉｎ）高度同源，故称为类甜蛋白（Ｔｈａｕｍａｔｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＴＬＰｓ）。但类甜蛋白不具有甜味，而大
多具有抗真菌活性。Ｉｒｓｈａｄ等从罗勒种子中分离到的类甜蛋白，对酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、毕
赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）及白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）的生长有抑制作用［３］；香蕉（ｂａｓｒａｉ　ｂａｎａｎａ）中的
类甜蛋白对尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ），黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ），烟曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａ－
ｔｕ）和绿色木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）有明显的抑制作用［４］。此外，ＴＬＰｓ还具有抗冻、抗渗透压力，淀粉
酶抑制剂等多种生物学活性，参与植物系统性获得性反应（ＳＡＲ）和超敏反应（ＨＲ）［５］。
ＴＬＰｓ含有２０１～２０９个氨基酸残基，其３维结构由３个结构域组成，结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间有１个明
显的“Ｖ”字型裂缝，被认为与ＰＲ－５类蛋白广谱的抗真菌活性有着密切的关联。莜麦Ｐｅｒｍａｔｉｎ属于类甜蛋
白，分子量为２３．５ｋＤａ，氨基酸序列中含有１６个半胱氨酸残基，可以形成８对二硫键，丰富的二硫键维持了
该蛋白空间结构的稳定。Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白具有广谱的抗真菌活性，可以明显抑制白腐菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐ．
ＳＱ０１），毛壳菌（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｓｐ．Ｒ０１）和木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）［６］。利用Ｂｌａｓｔ　Ｘ把Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白序列在
蛋白质数据库进行序列比对及同源性分析，结果表明该蛋白与禾本科植物小麦族中大麦、小麦、燕麦的
ＴＬＰｓ相似度达８０％以上，而与玉米Ｚｅａｍａｔｉｎ蛋白相似度仅为５５．６％；进一步分析，莜麦类甜蛋白Ｐｅｒｍａｔｉｎ
与燕麦Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ和大麦ＴＬＰｓ同属进化树一个分枝，但Ｐｅｒｍａｔｉｎ与大麦ＴＬＰｓ系统进化关系更
为接近［７］。
尖孢镰刀菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）隶属子囊菌门（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、从梗孢目（Ｍｏｎｉｌｉａｌｅｓ）、瘤座孢科（Ｔｕｂｅｒｃｕ－
ｌａｒｉａｃｅａｅ）、镰刀菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）的农作物有害病菌，该致病菌主要是通过植物创伤及新生根幼嫩组织进行
侵染，使得植物的生长减缓、黄化、子叶过早脱落进而引起植物的褐化、根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等病
害最终导致整株死亡［８］。研究表明桂林栗（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）［９］，皇帝蕉（ｅｍｐｅｒｏｒ　ｂａｎａｎａ）［１０］中类甜蛋
白对Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ菌丝生长及孢子萌发有明显的抑制作用。
天然植物来源的蛋白样品提取过程复杂、耗时长、收率低，往往极大地限制了这类Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的研究
及应用，因此，获得高纯度、可溶性重组蛋白对蛋白质的生物学功能研究显得尤为重要。为了大量获取莜麦
来源的Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白，我们将莜麦中一种编码类甜蛋白的ｐｅｒｍａｔｉｎ基因，在原核中进行了可溶性重组表
达，进一步纯化了重组蛋白ＮｕｓＡ－ｐｅｒｍａｔｉｎ，并分析了其抑制尖孢镰刀菌的活性。
１　材料和方法
１．１　材料
１．１．１　质粒和菌株
ｐＥＴ３２Ｌ质粒，克隆菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＸＬ１０，表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３），均为本实验室保存，供试病原菌尖
孢镰刀菌分离自西藏墨竹工卡县的米拉山口大花红景天（Ｒｈｏｄｉｏｌａ　ｃｒｅｎｕｌａｔａ），山西大学应用化学所崔金龙
副教授惠赠。天然Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白为电泳纯，由本实验室制备［６］。
１．１．２　酶和相关试剂
ＥｃｏＲ Ⅰ和ＢａｍＨ Ⅰ限制性内切酶均购自ＴＡＫＡＲＡ公司；Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产
品；Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ、Ｃｙｃｌｅ－Ｐｕｒｅ　Ｋｉｔ、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ均购自 ＯＭＥＧＡ 公司；Ｔ４ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ、ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ均为ＴｒａｎｓＧｅｎ公司产品；氨苄青霉素（Ａｍｐ）、异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）、胰蛋
白胨、酵母提取物为上海生工生物工程股份有限公司产品；Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００购
自ＧＥ公司；其他试剂均为化学分析纯。ＦＭ１－４３（Ｎ－（３－ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｒｏｐｙｌ）－４－（４－（ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）ｓｔｙｒ－
ｙｌ）（Ｎ－（３－乙基铵丙基）４－（４－（二丁基氨基）苯乙烯基），ＤＣＦＨ－ＤＡ（２′，７′－二氯荧光黄双乙酸盐）等购自阿拉
丁试剂公司。
１．２　重组质粒的构建
以莜麦ｐｅｒｍａｔｉｎ基因为模板，利用正反向引物（表１）进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应条件：９４℃５ｍｉｎ；９４℃
３０ｓ，５３℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，共３０个循环，７２℃１０ｍｉｎ；利用限制性内切酶ＢａｍＨ Ⅰ、ＥｃｏＲⅠ对ＰＣＲ产物进
４３１ 山西大学学报（自然科学版）　　　　　　　 　　　　　　　　３９（１）　２０１６　
行酶切，连接到经相同酶切割的表达载体质粒ｐＥＴ３２Ｌ，构建重组质粒ｐＥＴ３２Ｌ－ｐｅｒｍａｔｉｎ，然后将重组子转
入Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｘ１０感受态细胞中，进行菌落ＰＣＲ筛选，阳性克隆经测序分析确定。
表１　扩增ｐｅｒｍａｔｉｎ的引物序列
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｅｒｍａｔｉｎ
Ｐｒｉｍｅｒ　ｎａｍｅ　 Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
Ｆｏｒｗａｒｄ　 ＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　 ＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧ
１．３　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ融合蛋白的表达与纯化
将构建好的重组质粒ｐＥＴ３２Ｌ－ｐｅｒｍａｔｉｎ转入宿主菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３），在ＬＢ固体平板培养基（含
１００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素）上３７℃倒置培养约１５ｈ，挑取单菌落于５ｍＬ　ＬＢ（含１００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素）液体
培养基中，３７℃振荡培养１２ｈ后将培养液转入５００ｍＬ含相同浓度抗生素的ＬＢ液体培养基中扩大培养至
ＯＤ６００＝０．６时，加入ＩＰＴＧ使其终浓度达到０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，１６℃诱导表达１４ｈ，离心收获菌体。
用２０ｍＬ含２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ　ｐＨ　８．０缓冲液重悬菌体，冰上超声裂解菌体，
１３　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，收集上清并上样至经相同缓冲液平衡的 Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ离子柱，梯
度盐浓度（０．１ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）进行洗脱，收集活性峰，将样品浓缩至２ｍＬ后，再次上样至相同缓冲
液平衡的Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００凝胶柱进一步纯化，收集目的蛋白，超滤浓缩至２ｍＬ，过滤除菌后保存于－８０℃
备用。
１．４　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白对尖孢镰刀菌的生长抑制的测定
１．４．１　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白对尖孢镰刀菌的生长抑制分析
采用带毒滤纸片检测Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白对尖孢镰刀菌的生长抑制性［１１］。取保存良好的尖孢镰刀菌点种于
ＰＤＡ培养基的中心区域，于３０℃条件下培养２～３ｄ，当其菌落直径长至１～２ｃｍ时在菌落的外围放置经过
灭菌处理的直径为５ｍｍ的滤纸片。分别取２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液、２０μｍｏｌ／Ｌ天然Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白溶
液、２０μｍｏｌ／Ｌ重组ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白溶液（均经０．２２μｍ滤膜过滤除菌）各２０μＬ加到滤纸片上，４℃放
置１２ｈ充分扩散后将ＰＤＡ平板放入３０℃恒温培养箱继续培养，观察并记录菌丝生长状况。
１．４．２　膜染料ＦＭ１－４３染色法观察ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ对尖孢镰刀菌菌丝体形态的影响
取３０℃培养尖孢镰刀菌生长良好的ＰＤＡ培养板，加入５ｍＬ无菌水后用移液枪沿菌落边缘吹打菌丝
体，将悬浮起的菌丝体平均收集到４个１．５ｍＬ离心管中，５　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ收集菌丝体。分别用２０
ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液、２０μｍｏｌ／Ｌ天然Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白溶液、２０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ蛋白溶液、２０μｍｏｌ／Ｌ　Ｎｕ－
ｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白溶液各１００μＬ将菌丝体悬起，３０℃恒温培养箱孵１２ｈ后，加入终浓度为１μｇ／ｍＬ细胞膜
染料ＦＭ１－４３，３７℃恒温培养箱孵育染色１０ｍｉｎ，加入５００μＬ　ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，分别取５０μＬ菌丝体悬
浮液制片。Ｄｅｌｔａ　Ｖｉｓｉｏｎ显微镜下观察尖孢镰刀菌菌丝形态变化。
１．４．３　尖孢镰刀菌细胞活性氧水平的检测
分别用２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｉｒｓ－ＨＣｌ缓冲液、１０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ蛋白溶液和１０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白溶
液各２００μＬ，将尖孢镰刀菌菌丝悬起，３０℃孵育５ｈ后，加入终浓度１０μｍｏｌ／Ｌ的ＤＣＦＨ－ＤＡ（２′，７′－二氯荧
光黄双乙酸盐）ＰＢＳ缓冲液，３７℃培养箱避光２０ｍｉｎ，加入ＰＢＳ缓冲液洗涤菌丝体３次，去除未进入细胞内
的ＤＣＦＨ－ＤＡ。分别用５０μＬ　ＰＢＳ缓冲液重新悬浮菌体，取２０μＬ压片，荧光显微镜下观察。同时将其余３０
μＬ菌体悬浮液丝体稀释至３ｍＬ，在荧光分光光度计上检测荧光值
［１２］。设置仪器参数为：温度为室温，激发
波长为４８８ｎｍ，扫描范围为４９０～６００ｎｍ，激发狭缝宽的度为５ｎｍ，发射狭缝宽度为５ｎｍ，发射波长在５２０
ｎｍ处有最大吸收。
２　研究结果
２．１　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的表达和纯化
将重组质粒ｐＥＴ３２Ｌ－ｐｅｒｍａｔｉｎ在工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１菌株中诱导表达后进行超声破碎，将其全菌、上
清样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果表明：重组蛋白ＮｕｓＡ－ｐｅｒｍａｔｉｎ在大肠杆菌中可溶性表达，其分子量约
５３１　　　　　　　　 　　　　　焦慧娟等：莜麦Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的重组表达及抗尖孢镰刀菌活性分析
为８２ｋＤａ，与计算结果相符。经过Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ离子柱和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００凝胶柱纯化，获得
电泳纯ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ（图１）。
１Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ，２Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ，３Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ，
４Ｓａｍｐｌｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ，５Ｓａｍｐｌｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００
Ｆｉｇ．１　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ
１．蛋白 Ｍａｒｋｅｒ，２．ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ表达菌全菌样品，３．ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ表达菌上清液样品，
４．Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ穿透样品，５．Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００纯化样品
图１　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ融合蛋白纯化结果
２．２　重组蛋白ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ对尖孢镰刀菌抗性分析
２．２．１　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白对尖孢镰刀菌的生长抑制的表型分析
尖孢镰刀菌点种在ＰＤＡ培养基中心，菌丝体会向四周呈辐射状延伸生长，常形成圆形菌落。当Ｆ．ｏｘ－
ｙｓｐｏｒｕｍ菌丝体生长至滤纸片区域时，与缓冲液对照相比，含有２０μｍｏｌ／Ｌ天然Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白溶液和重组
ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白溶液的滤纸片边缘出现了明显的月牙形生长抑制圈，表明ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ具有与天然
Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白相同的对尖孢镰刀菌生长的抑制作用（图２）。
（Ａ）２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ，（Ｂ）２０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓａｍｐｌｅｓ，
（Ｃ）２０μｍｏｌ／Ｌ　ｎａｔｉｖｅ　Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓａｍｐｌｅｓ
Ｆｉｇ．２　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｔｏｗａｒｄｓ　Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
（Ａ）２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，（Ｂ）２０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白样品，（Ｃ）２０μｍｏｌ／Ｌ天然Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白样品
图２　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制性分析
６３１ 山西大学学报（自然科学版）　　　　　　　 　　　　　　　　３９（１）　２０１６　
２．２．２　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ引起尖孢镰刀菌的形态变化
ＦＭ１－４３是一种水溶性的膜探针，其本身没有荧光，当与膜结合后就会发出强烈的荧光。用ＦＭ１－４３标
记Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白处理８ｈ后的尖孢镰刀菌菌丝体，在Ｄｅｌｔａ　Ｖｉｓｉｏｎ荧光显微镜下观察发现，相比对照组，重
组ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白导致尖孢镰刀菌菌丝体形态异常；菌丝体扭曲褶皱，尖孢镰刀菌细胞膜呈现虚化、菌
丝横隔不再明显等（图３）。
Ｆｉｇ．３　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｇｒｏｗｎ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ
ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ａｔ　３０℃ｆｏｒ　１２ｈｕｓｉｎｇ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｍａｒｋｅｒ　ＦＭ１－４３
图３　显微镜下观察ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响
２．２．３　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ对尖孢镰刀菌细胞活性氧水平的影响
多种抗真菌蛋白和抗菌肽可以引起真菌体内的活性氧积聚和爆发［１３－１４］，活性氧在细胞内的失衡和急剧
升高会损坏细胞内的脂质层、蛋白质活性和核酸功能，并且会引起一系列的级联反应导致细胞死亡［１５］。
ＤＣＦＨ－ＤＡ荧光探针本身没有荧光，而且可以自由穿过细胞膜，当探针进入细胞内后，细胞内的酯酶将其水
解生成不能通透细胞膜的ＤＣＦＨ，达到探针被装载到细胞内的效果。ＤＣＦＨ可以被细胞内的活性氧氧化生
成带有绿色荧光的ＤＣＦ。ＤＣＦ的荧光值就可以作为检测细胞内活性氧的水平的一个指标［１６］。ＮｕｓＡ－Ｐｅｒ－
ｍａｔｉｎ处理过的尖孢镰刀菌菌丝体形态异常并且在荧光显微镜下有强烈的绿色荧光，但缓冲液和ＮｕｓＡ蛋
白溶液处理的菌丝体则没有这一现象（图４Ａ）。进一步对菌丝体中的ＲＯＳ含量进行检测，在４８８ｎｍ的激发
波长下，菌丝体溶液的荧光值在５２０ｎｍ处有最大吸收峰（图４Ｂ）。结果表明ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白会导致尖
孢镰刀菌菌丝体细胞体内的活性氧含量急剧升高。
７３１　　　　　　　　 　　　　　焦慧娟等：莜麦Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的重组表达及抗尖孢镰刀菌活性分析
Ｆｉｇ．４　ＲＯＳ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｃｅｌｓ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　１０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ
（Ａ）ＲＯＳ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｆｏｒ　５ｈ
ｂｙ　Ｄｅｌｔａ　Ｖｉｓｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ａｓｓａｙ．Ｓｃａｌｅ　ｂａｒｓ，１０μｍ，（Ｂ）ＲＯＳ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｃｅｌｓ
ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１０μｍｏｌ／Ｌ　ＮｕｓＡ－Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｆｏｒ　５ｈｂｙ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
图４　Ｐｅｒｍａｔｉｎ孵育尖孢镰刀菌５ｈ后细胞的活性氧检测
３　讨论
Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白属于病程相关蛋白中的类甜蛋白家族，对白腐菌，毛壳菌，木霉等的生长都有一定抑制性［６］。
莜麦Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白中富含二硫键，原核表达极其容易形成包涵体，即使用盐酸胍或脲变性，复性率也很低，为后
续纯化工艺带来极大困难。为了得到原核可溶表达的Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白，我们尝试不同的方法：与促溶性标签蛋白
（ＧＳＴ、Ｔｒｘ、ＧＢ等）融合表达、与周质表达信号肽ｓｓＤｓｂＡ等融合表达等但均未达到预期目标。Ｓｈｉｈ等研究显示
ＮｕｓＡ标签融合蛋白能够将目的蛋白的可溶性达到６０％［１７］；Ｋｏｒｌ等研究发现低温能够使得诱导的ＮｕｓＡ标签
蛋白有更好的可溶性［１８］。本文通过将ｐｅｒｍａｔｉｎ基因构建到ｐＥＴ３２Ｌ原核表达载体上，利用ＮｕｓＡ标签蛋白实
现了Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的可溶性表达。这为Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的进一步研究及生产奠定了基础。
病原真菌引起的植物真菌病每年都会对一些经济作物诸如谷物类作物带来巨大的经济损失。ＮｕｓＡ－
Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白可以引起尖孢镰刀菌的菌丝形态的改变，菌体生长抑制，这与之前的相关研究结论玉米中ＰＲ－
５类甜蛋白Ｚｅａｍａｔｉｎ［１９］，烟草逆渗透蛋白Ｏｓｍｏｔｉｎ［２０］能够破坏真菌壁膜造成内容物外溢而导致真菌死亡的
机理相是否一致，仍需进一步研究。在Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ的研究中，Ｏｓｍｏｔｉｎ通过激活真菌信号通路中的ＲＡＳ２／
ｃＡＭＰ信号通路抑制了酵母中的抗氧化应激反应，导致活性氧的升高最终导致了酵母的程序性死亡［２１］。本
８３１ 山西大学学报（自然科学版）　　　　　　　 　　　　　　　　３９（１）　２０１６　
文利用ＤＣＦＨ－ＤＡ的活性氧探针，也检测到Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白孵育尖孢镰刀菌，同样会引起菌体内ＲＯＳ水平急
剧升高。但Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白如何与真菌细胞膜结合，以及如何导致真菌细胞内的活性氧升高，进而由氧化损
伤诱导真菌死亡都有待进一步研究。
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Ｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，６（４）：１－１０．ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７７－５９５６－６－４．
［１９］　Ｒｏｂｅｒｔｓ　ＷＫ，Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ　ＣＰ．Ｚｅａｍａｔｉｎ，Ａｎ　Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｍａｉｚｅ　ｗｉｔｈ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ
［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，１３６（９）：１７７１－１７７８．ＤＯＩ：１０．１０９９／００２２１２８７－１３６－９－１７７１．
［２０］　Ｋａｐｔｅｙｎ　Ｊ，Ｈｏｙｅｒ　Ｌ，Ｈｅｃｈｔ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｃｅｌ　Ｗａｌ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　Ｃｅｌｓ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　Ｗａｌ－ｄｅｆｅｃ－
ｔｉｖｅ　Ｍｕｔａｎｔｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，３５（３）：６０１－６１１．ＤＯＩ：１０．１０４６／ｊ．１３６５－２９５８．２０００．０１７２９．ｘ
［２１］　Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ　ＭＬ，Ｃｏｃａ　ＭａＡ，Ｊｉｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｓｍｏｔｉｎ　ｉｓ　ａ　Ｈｏｍｏｌｏｇ　ｏｆ　Ｍｍｍａｌｉａｎ　Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ
Ｙｅａｓｔ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　Ｈｏｍｏｌｏｇ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ，２００５，１７（２）：１７１－１８０．ＤＯＩ：１０．
１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２００４．１１．０５０．
９３１　　　　　　　　 　　　　　焦慧娟等：莜麦Ｐｅｒｍａｔｉｎ蛋白的重组表达及抗尖孢镰刀菌活性分析