全 文 ：中药材 DNA分子标记研究的技术问题
Ⅱ . RAPD实验技术和方法学论述
郭宝林 1 ,戴　波2
⒇
( 1. 北京中医药大学 中药鉴定室 ,北京　 100094;　 2. 云南大学 ,云南 昆明　 650091)
摘　要: 主要根据作者的经验 ,对 RAPD实验技术中的扩增仪及扩增程度、 DN A模板浓度及纯度、引物的种类与浓
度、 Taq酶、缓冲系统、 Mg2+ 、 dN TP的浓度、设立空白对照 、扩增产物鉴定、条带统计和同源性认定、 RAPD反应程
序标准化等问题进行了论述 ,其中降解了的 DN A模板在不同的浓度时会产生不同的扩增式样 ,国产 Taq酶的不同
批次间会产生较大的扩增差异为首次报道 ,并提供了获得清晰条带的电泳策略。 概述了 RAPD的主要特点和适用
范围。
关键词: RAPD技术 ; DN A模板 ; T aq酶
中图分类号: R282. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 02 0178 03
Some technical problems in studies on DNA markers of Chinese materia medica
Ⅱ Discussing on RAPD technology and methodology
GUO Bao-lin1 , DA I Bo2
( 1. Labor ato ry o f Chinese Materia Medica Identification, Beijing Univ er sity o f TCM , Beijing 100094, China;
2. Yunnan Univ ersity, Kunming Yunnan 650091, China )
Key words: RAPD technique; DN A model; Taq enzyme
　　 RAPD是 DN A随机扩增多态性 ( random amplified
polymo rphism DNA)的简称 ,创立于 20世纪 90年代 ,是目
前中药研究者最常使用的 DN A标记技术 ,其原理不再详
述。 RAPD标记的多态性从理论上来源于: ①由于 RAPD产
生的条带的长度范围一般在 200～ 2 000 bp,当一个大的
DN A片段插入两个引物结合位点之间时 ,该段 DNA变得
太长而难以扩增导致条带消失 ;②在一个或两个引物结合位
点产生缺失或插入 ,使得引物结合位点缺失而导致条带消
失 ;③在引物结合位点上一个核苷酸替换也影响引物的退火
而导致多态性片段的得失或改变片段大小 ;④小段 DNA的
插入或缺失使得扩增出的条带长度有所变化。
在实际工作中发现的长度差异极少能观察到 ,条带存在
(位点 A)或缺失 (位点 a) ,作为等位基因 ,在纯合 ( AA)及杂
合 ( Aa )的情况下 ,扩增片段均可见 ,而只有当片段缺失时才
揭示隐在的基因型。即 RAPD一般不能区分纯合 ( AA)与杂
合 ( Aa )基因型 ,故而 RAPD是显性性状。
1　主要技术问题
1. 1　扩增仪及扩增程序: RAPD区别于一般 PCR的特点是
引物较短 ,因此退火温度一般在 35℃～ 40℃ , 40℃以上会
抑制 PCR产物 [1] ,有时为了增加产物的特异性会增至
45℃ ,此时仅有极少量结合力极强的带出现 ,而在 36℃以
下 ,小于 1℃的变化会得到完全不同的扩增式样 [2] ,由于引
物与模板结合力较弱 ,在退火之后 ,一般不可直接置于延伸
温度 70℃～ 72℃下 ,否则引物会失去与模板的结合 ,故而
常用的水浴式 PC R仪不太适于 RAPD研究 ,在逐渐升温的
金属模块 PCR仪中 ,升温速度便成为 PCR仪的重要技术参
数。在实验过程中 ,为得到良好扩增结果 ,调整升温速度也作
为重要的考虑因素 ,同时 ,因使用不同的 PC R仪和不同实验
过程使用不同的升温速度调整值将得到缺乏可比性的结果。
1. 2　 DN A模板浓度及纯度: 基于 PCR的 RAPD技术 ,要求
反应模板尽量少含影响扩增的杂质 ,对于植物材料多糖与多
酚等次生物质必须尽可能去除 [3] ,但一般不必进行氧化铯梯
度离心或使用纯化试剂盒。
一般认为在每个 PCR反应中 , 5～ 500 ng的模板量能提
供完全一样的扩增结果。 低浓度的 DN A(例如 pg水平的
DNA)会影响 RAPD式样 ,浓度很高时很多带会丢失或整个
扩增呈弥散状或完全得不到扩增带 [4] ,一般认为模板终浓度
为 1～ 10 ng /μL的范围内有最佳扩增 [5 ] ,作者发现 0. 2～
1 ng /μL效果较好 ,最佳的模板浓度范围取决于研究类群与
模板纯度 ,在 DN A模板不很纯情况下 ,宁可使用有效浓度
范围内的最低极限 ,使抑制 Taq DN A聚合酶活性因子的影
响降到最小。 另外 ,作者还发现降解了的模板 DNA对模板
浓度很敏感 ,即不同的浓度会出现不同的扩增式样 ,其影响
程度还在研究考察中 ,因此 RAPD技术在研究古老材料 ,或
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⒇ 收稿日期: 2001-08-18
因各种原因 DN A发生降解的材料 (如中药材 )时可能受到
一定限制。
1. 3　引物的种类与浓度: 有极其大量的引物种类可供实验
时选择 , Fritsch等 [6]用了 400号不同的引物研究了植物 3个
亲缘关系较远的属 ,得出的结论是引物的扩增力 (即扩增带
的有无、多少和强弱 )与 DNA来源大体上是无关的 ;汪小全
等 [7]和邹喻苹等 [8]也发现类似的结果 ,用这些结果暗示基因
组 DNA序列相当保守 ,在一个类群能扩增的引物有 70%的
可能在其他类群中能扩增。 作者用上海生工合成的引物
S1～ S400对多种材料进行了扩增 ,统计发现有 50%的引物
在所有类群中可得到扩增 , 17%的引物至少在一种材料中可
得到多态性扩增 ,在多数材料中有良好多态性结果的引物有
16个 ,它们分别是 S4、 S10、 S11、 S12、 S17、 S18、 S27、 S28、
S34、 S42、 S43、 S201、 S224、 S227、 S276。
引物的通常浓度是 0. 1～ 2. 0μmo l /L[9 ] , 这时大多数引
物能产生 6～ 12条扩增带 , 浓度太低不能扩增 , 浓度太高产
生新的扩增带 [4, 10] , 不同实验室有自己习惯使用的浓度 , 但
只要在通常范围内影响不显著 , 如作者实验室使用量
15 ng /25μL(相当于 0. 2μmo l /L )。
1. 4　 Taq酶: 不同厂家、不同商标的 Taq酶的纯度、聚合效
率有差别 ,因而常常会给出不同的 RAPD产物 ,因此一次实
验最好中途不要换酶。 中国医学科学院基础所、中国科学院
遗传所、复旦大学、华美生物工程公司、中国农业大学、上海
生工等许多单位生产的 Taq酶均可使用。 但作者发现同一
公司、同一商标的酶 ,在不同的批次间扩增效果上有差异 ,甚
至有很大的差异 ,这可能是因为国产酶质量相对不稳定 ,国
外未见类拟报道。 Taq酶的品牌是引起 RAPD结果缺乏可
比性的主要原因之一。
在 RAPD中酶的用量大都是每反应 0. 5～ 1 U ( 25μL) ,
用量与酶来源有关 ,有时可达 2. 5 U,用量过多会产生非特
异性扩增。
1. 5　缓冲系统、Mg2+ 、 dN TP的浓度: RAPD实验使用一般
的 PCR反应缓冲体系 ,但对其中的 Mg2+ 浓度敏感 , RAPD
反应需要 Mg2+ 浓度一般较高 ,每次 RAPD实验也需确定扩
增反应的最佳 Mg2+ 浓度 ,常用于 RAPD的 Mg2+ 浓度为
2 mmol /L。
dNT P是 PCR的原料 ,浓度太高产生错误掺入 ,浓度太
低影响产率 , RAPD使用的 dN TP浓度较一般特异性扩增为
高 ,推荐使用 100～ 200 mmol /L。
BSA (牛血清白蛋白 )常用于保护 Taq酶的活性 ,得到更
清晰的条带 ,是药材 RAPD扩增体系中的常用组分 ,参考终
浓度 0. 1 mg /μL。
1. 6　设立空白对照: RAPD实验过程中 ,每次扩增反应设立
不加模板的空白对照十分必要 ,这样可以排除实验操作过程
中空气、实验器皿或是试剂及操作者带来的污染。 在空白中
少量带的出现也很常见 ,原因是 Taq酶来自嗜热水生菌 ,经
生物工程制备并提纯 ,在此过程中难免在酶液中带有少量工
程菌的 DN A,使得在不加反应样本模板的情况下也出现扩
增 ,这样的带在各样中出现时带型统计应予以排除。
1. 7　扩增产物鉴定: 根据 RAPD产物的长度 (一般 100～
2 000 bp) ,使用 1. 4% ～ 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行分离 ,
在恒定电压 (小于 5 V /cm)下泳动 ,使 DN A分子量标准完全
展开后结束电泳。 为了不同重复实验易于比较 ,每次的电泳
泳动距离要相对固定。 溴化乙锭可加入琼脂糖中 ,但由于溴
化乙锭常带正电荷 ,电泳过程中会向负极泳动 ,长时间电泳
之后 ,前排胶孔的样本的小分子量带变得模糊不清 ,可以采
取下列办法解决:①配更长的胶 ,前面部分不上样 ;②在两排
胶孔上样时 ,电泳一半时间后将凝胶从上排胶孔处割开 ,前
后两块交换放置继续电泳 (这时要注意样本顺序 ) ;③采取配
胶时不加溴化乙锭 ,而电泳后再用溴化乙锭稀溶液染色。
1. 8　条带统计和同源性认定: 对 RAPD实验得到的不同样
本的共迁移条带 (即相对应于模板 DNA的相应位点 )可进
行 0或 1的统计 ,有两种策略:一种是有带 (不论强带或弱
带 ) ,证明位点存在记为 1,无带证明位点缺失记为 0;另一种
策略是强带记为 1,弱带和无带记为 0,该方法的缺点是强带
比弱带强多少时才作不同的判别 ,有时难以把握 ,有一些个
人经验。 但无论选择何种方法 ,在整个实验中要固定一个原
则 ,这两种方法在进行多样性分析或亲缘关系探讨时 ,在数
据量大的情况下会得到同样的结果。
RAPD检测的是扩增条带的长度差异 ,作者认为 ,在属
种内和居群内 ,特定大小的 RAPD片段具有序列同源性和
遗传相关性的假设是普遍有效的 ,但事先对于所研究对象的
进化速率及亲缘关系最好有一个估计 ,尽可能避免由于关系
远而致共迁移条带的同源性不好 ,使统计结果出现较大偏
差 ,如果实验需要知道确切同源性 ,可进一步用杂交实验来
实现 [11]。
总之 ,在进行带型统计时 ,无法明确认定弱带或无带 ,或
由于不同样本出现了极为相近迁移率的带型而无法判定为
不同的位点时 ,这样的位点宁可弃之不用 ,以减少统计结果
的噪音。
1. 9　 RAPD反应程序标准化: RAPD对反应条件的敏感性
和不同实验室间结果没有互通性的问题是影响 RAPD方法
声誉的重要原因 ,但由于该方法十分方便实用 ,仍是目前使
用最为广泛的 DN A标记 ,因而有关 RAPD实验程序标准化
的呼吁也越来越强烈。
国际植物遗传资源研究所 ( IPGRI )对许多农作物列出
了标准的、国际上认可的描述实验条件和结果的表格 ,即一
种提供 Genbank的样品数据表 [5, 12 ] ,对 RAPD过程中反应
的化学组成、 PC R热循环仪的生产厂家与型号、热循环的温
度程序、 RAPD-PCR片段的分析、 RAPD结果的展示等项都
有详细的规定。 作者认为有关 RAPD的实验论文也应给出
这些参数的更为详细的值 ,以便其结果有可能被其他实验室
重复以及有利于方法上的推广 ,其中除一般文献提及的数据
外 ,还应给出 DNA检测方法的详细过程、反应体系中 DNA
模板的量 ( ng )和体积 (μL)、 Taq聚合酶的生产厂家和商标
(甚至批号 )、扩增引物的序列、热循环仪退火到延伸之间的
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变温速率等。
作者在进行中药 DNA标记的实验中 ,使用了固定的
DN A模板量、 Taq酶种类和反应各组分浓度、固定的循环程
序、固定的电泳条件及相对固定的引物群 ,在参照 PE公司
的 PE9600热循环仪退火与延伸变温速率为 1. 3℃ /s的情
况下 ,调整国产 PCR仪为相近速率 ,也得到了重现性较好的
结果 ,现已经用这些固定条件对淫羊藿、薯蓣、厚朴、丹参、芍
药、黄芩、牛膝等进行了研究 ,均得到好的结果。 所有从事
RAPD研究的人员都有体会 , RAPD实验条件的摸索是十分
费时的过程 ,当一切条件确定之后 ,工作已经完成了 80% ,
有一种标准化的固定条件 ,研究工作大大简化。
2　特点和适用范围
2. 1　 RAPD可提供的信息量几乎是无限的 ,因为可选择的
随机引物数十分巨大。
2. 2　 RAPD是完全随机扩增 ,不需要知道研究对象的序列
背景。
2. 3　只需要 ng (甚至 pg )级的 DN A模板量 , DNA模板也不
需要氯化铯梯度离心或特殊的纯化试剂盒纯化。
2. 4　技术简单易行 ,根据作者的经验 ,如果材料 DN A提取
顺利 ,对于 40～ 60个样本的 RAPD研究 ,只需 2个月即可完
成 (前提是本实验室已有成熟固定的方法 )。
2. 5　 RAPD是显性遗传标记 ,不能识别纯合子和杂合子 ,使
得等位基因频率无法评估 ,同样在用分离的 F2代构建遗传
图谱时 ,也会失去有价值的信息 ,因而并不是构建遗传图谱
最佳 DN A标记 ,但方法上快速便捷 ,因而应用 RAPD标记
构建遗传图谱已十分普遍。
2. 6　 RAPD方法不同实验室间互通性差 ,影响因素多样化 ,
但在不需要实验室间相互交流的工作中 ,如居群遗传多样性
估计 ,类群间亲缘关系的探讨等 ,在进行大量的位点研究后 ,
其变异比率趋向于饱和 ,即使用不同的引物 ,得到完全不同
的条带 ,经统计其结果应是相同的 (或相似的 ) ,出现偏差应
归于不同的取样原则和 RAPD方法本身的局限 ,而非实验
参数和操作过程。
2. 7　最适合于种下水平遗传型检测 ,包括野生天然居群的
遗传结构分析、种质资源的评估、栽培植物品种的鉴定等。当
RAPD用于研究种间甚至属间等较高群间的系统关系时 ,由
于类群间积累的变异过多 ,对扩增产物不进行同源性分析的
前提下 ,其结果可能与真实的系统关系相左 ,而且采样策略
也面临挑战 ,用一个个体代表一个种或用一个种代表一个属
都可造成结果的极大偏差 ,因此 RAPD技术在探讨种间关
系时也只是适合物种数目不多的属、包括几个近缘种的复合
体、属下物种数不多的组以及与栽培品种密切相关的物种
等 ,在这样的范围内便于居群采样。
2. 8　 RAPD用于评估亲缘关系时 ,由于 RAPD位点本身不
具任何功能意义 ,这些位点的进化速率、选择压力均未知 ,只
能从相似性系数或遗传距离作表证分析 ,得到的树系图不能
反映类群间的系统发育关系。
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