全 文 ：用 • „°⁄方法研究中韩牛膝类药材的遗传关系
郑喜珍 o郭宝林 o阎玉凝
k北京中医药大学 中药学院 o北京 tsstsul
≈摘要  目的 }研究中韩牛膝类药材的相互遗传关系 ∀方法 }采用 • „°⁄技术对 w种 ts个牛膝类样品进行了
遗传关系研究 ∀结果 }扩增产物共记录 tss条谱带 o韩国自产牛膝和怀牛膝间的遗传距离最小 ∀结论 }韩国自产牛
膝在遗传表现上更接近怀牛膝 ∀
≈关键词  • „°⁄技术 ~韩国自产牛膝 ~怀牛膝
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukussulsv2swut2sv
怀牛膝为常用中药 o来源于苋科植物牛膝
Αχηψραντηεσ βιδεντατα …¯ q的干燥根 ∀用于腰膝酸
痛 !筋骨无力 !经闭 瘕 !肝阳眩晕等证 ∀韩国自产
牛膝为同属 Α . ϕαπονιχα的干燥根≈t  ot||{年5韩国
药典6中牛膝来源包括上述两种 o目前在韩国的药材
市场上两种药用 o据有关文献报道≈u ∗ w  o韩国自产牛
膝也含怀牛膝的主要药效成分齐墩果酸苷和脱皮激
素 o在中国 o除怀牛膝外 o同属几种植物称土牛膝 o用
作怀牛膝的代用品≈x  o也包含 Α . ϕαπονιχα ‘¤·¤·≈y ∀
|s年代以来 • „°⁄标记广泛应用于动植物遗
传育种 !基因诊断 !居群遗传学 !生物系统与进化研
究 o且操作简便 !快速≈z o{  ∀因此我们对上述的怀牛
膝 !韩国自产牛膝 !一种常用土牛膝 Α . ασπερ q和
川牛膝 Χψατηυλα οφφιχιναλισ Ž∏¤« w种植物进行了
• „°⁄分析 o探索相互间遗传关系和分类地位 ∀
1 材料 !仪器 !引物和试剂
1 q1 材料 t ov为取自标本的叶 oy oz o{ ots为硅胶
快速干燥叶片 ou ow ox o|为药材根 ∀见表 t ∀
1 q2 仪器和试剂 离心机为 ‹ µ¨¤¨ ∏¶公司生产的
…¬²©∏ª¨ ≥·µ¤·²¶o°≤ • 仪为 °∞公司生产的 Š ±¨¨ „ °³
°≤ • ≥¼¶·¨° |yss o电泳仪为 …Œ’2• „⁄公司生产的
°²º µ¨°„≤ vss ∀ ∞⁄× „k„  • ∞≥≤ ’l oפª酶 !⁄‘„
¤¯§§¨µk华美公司l o§‘×° !随机引物k上海生工生物
制品公司l !ts ≅ • ¤¨¦·¬²± …∏©©¨µo2„¶¦²µ¥¬¦„¦¬§k抗
坏血酸 o∂ ≤lk上海生工生物制品公司l o∞…k≥ŒŠ2
 „l oΒ2巯基乙醇k  ∞• ≤Žl o琼脂糖k≥³¤±¬¶«l o×µ¬¶
≈收稿日期  usst2s|2ts
≈通讯作者  k‹¨¨2¬± ∏±ªl电话 }tvyzts{yuws ∞2 ¤¬¯}¤±ª¬2
¬½«¨ ± ƒ ¼¤«²²q¦²q®µ
碱kŠ¬¥¦²l o°∂ °2ws×k经科试剂l o精密 ³‹ 试纸k上
海试剂三厂l o其他溶剂为分析纯 ∀
表 t 材料来源
编号 药名 学名 来源 部位 采集时期
t 土牛膝 Αχηψραντηεσ ασπερα 广东k栽培l 叶 usss2ts
u 土牛膝 Α . ασπερα 广东k栽培l 根 usss2ts
v 韩国产牛膝 Α .ϕαπονιχα 韩国k野生l 叶 usss2s{
w 韩国产牛膝 Α .ϕαπονιχα 韩国k野生l 根 usss2ts
x 怀牛膝 Α . βιδενταταε 安国k栽培l 根 usss2s|
y 怀牛膝 Α . βιδενταταε 安国k野生l 叶 usss2s{
z 怀牛膝 Α . βιδενταταε 昆明k野生l 叶 t|||2s{
{ 怀牛膝 Α . βιδεντατα 北京k栽培l 叶 usst2sw
| 川牛膝 Χ. οφφιχιναλισ 安国k栽培l 根 usss2s{
ts 川牛膝 Χ. οφφιχιναλισ 昆明k野生l 叶 t|||2s{
2 方法
2 q1 ⁄‘„提取 °∂ °2ws×k约占 us h l粉末与牛膝
材料在液氮环境下共同研磨成细粉状后 o加入 w ε
的提取液ks qux °²¯ #pt ‘¤≤¯os qux °²¯ #p t ×µ¬¶2
‹≤¯oxs °°²¯ #pt ∞⁄× „ o³‹{ qslyss ˏo冰置 ts
°¬±ow ε 离心 ts °¬±o弃去上清液 ∀加入已预热的 u
≅ ≤ × „…ku h巯基乙醇 o用维生素 ≤ 调 ³‹y qs ∗ y qxl
yss ˏo轻微振摇后置水浴锅恒温 t «o期间振摇几
次 o取出放置至室温 o加入氯仿2异戊醇kuwΒtlyss
ˏo混匀 o离心 x °¬±取上清液 o再加氯仿Β异戊醇
kuwΒtlyss ˏo混匀 o离心 x °¬±∀取上清液加 urv
体积的异丙醇 op us ε 冷藏 t «∀t uss µ#°¬±p t离
心 ts °¬±∀弃去上清液 o沉淀用 zs h乙醇洗 t次 o
将沉淀晾干 otss ˏ×∞溶解 o用 s q{ h琼脂糖凝胶
电泳检侧 ⁄‘„分子量 o根据 ∞…荧光强度确定 ⁄‘„
浓度 ∀
2 q2 °≤ • 扩增 ux ˏ反应体系 ∀ ⁄‘„ 模板 x
ˏo反应缓冲ts ≅ • ¤¨¦·¬²±…∏©©¨µu qxˏo§‘×°
#tuw#
第 uz卷第 y期
ussu年 y月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o‘²qy
∏±¨ qoussu
u qx °°²¯#p tu ˏoux °°²¯#p t  ªu n u ˏoפª
酶 s qv ˏo§§‹u’ tu qz ˏo引物 t ˏktx ±ªlus ˏo
°≤ • 扩增程序为预变性 |w ε ots °¬±~扩增循环kwx
¦¼¦¯¨ ¶l|w ε ot °¬±~vy ε ot °¬±~zu ε ou °¬±~延伸
zu ε ots °¬±∀ °≤ • 反应产物在 t qx ε 琼脂糖凝胶
电泳 o紫外检测拍照 ∀
2 q3 数据分析 对电泳图谱中每一条带k⁄‘„ 片
段l均作为一个分子标记 o并代表一个引物结合点 o
根据各分子标记的有无得到所有位点的二元数据 o
有带记为/ t0k强带和弱带同记l o无带记为/ s0 ∀应
用 ‘×≥≠≥软件计算遗传相似性系数k⁄Œ≤∞相似系
数 o公式为 u¤rku¤n ¥n ¦lk两个样本同为 t时为 ¤o
两个样本分别为 s ot的两种情况为 ¥和 ¦l o用 ˜°2
Š  „聚类法计算得出聚类树状图 ∀
3 结果与讨论
从 ≥||2≥v{u 筛选出 uw 个引物 o分别是 ≥|| o
≥tt{ o≥tt| o≥tus o≥tut o≥txu o≥tyz o≥t|t o≥t|| o
≥ust o≥usz o≥us{ o≥utx o≥uut o≥uuu o≥uuz o≥uzy o
≥vss o≥vsw o≥vs| o≥vts o≥vtu o≥vtw o≥v{u ∀共得到
tss条带 o其中引物 ≥vsw 对样本的扩增结果参见图
t o数据分析聚类树图参见图 u ∀ • „°⁄技术显示了
较好的分辨率 ∀依据聚类图共为 w组 o分辨率较好
的分支有 u组 }组 t全部为牛膝属的样本 t ou ov ow o
x oy oz o{k包括怀牛膝 !韩国牛膝和土牛膝l o组 u是
| otsk杯牛膝属的川牛膝l o组 t又分 t ouk土牛膝l和
v ow ox oy oz o{k怀牛膝和韩国牛膝l ov ow ox oy oz o{
k怀牛膝和韩国牛膝l也分 v ow ox oy o{和 zk昆明怀牛
膝l ∀
• „°⁄聚类图很好地区别了不同的属和不同的
种 o不同的属k组 t和组 ul遗传距离较大 o牛膝属 {
个样本中 o土牛膝与其他样本存在明显的遗传距离 o
而韩国牛膝与怀牛膝k野生或栽培l没有明显的遗传
分化 o在5中国植物志6中 oΑ . ϕαπονιχα被处理为怀
牛膝的变种 Α . βιδεντατα √¤µϕαπονιχα本研究支持
这样的划分 o并建议5韩国药典6予以更正 ∀
本实验结果表明韩国自产牛膝在遗传表现上非
常接近于中国怀牛膝 o但本研究也表明中国的野生
牛膝和栽培牛膝在遗传上没有差异 o由于怀牛膝分
布广泛 !变异丰富所以昆明产怀牛膝和其他怀牛膝
在遗传上的有差异但还属于怀牛膝的范围 ∀又因为
怀牛膝栽培历史悠久 o药材形态与野生品差异很大 o
野生品已不用k或也称为土牛膝l o因而韩国自产牛
膝与怀牛膝的质量差异需要进一步的质量评价研
究 ∀
图 t 引物 ≥vsw对样本的扩增图谱
s q空白组  q¤®¨ µ
图 u 聚类树状图
≈参考文献 
≈t  李相泰 q韩国植物检索集 q汉城 }科学出版社 ot||z qtyx q
≈u  ¬‹¼∏± ‹ º¤±ªoŽ¼²±ª≥²²± ¨¨o≥¬± ∏±ª Ž¤±ªo ·¨¤¯ qŒ¶²¯¤·¬±
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¶¬§¨¶©µ²° „¦«¼µ¤±·¶¤³²±¬¦¤ ‘¤®¤¬q大韩药学会春节学术大
会 ot||| qtu{ q
≈w  顾关云 o蒋 昱 q牛膝及其同属植物的化学与药理 q国外医药#
植物药分册 ot||{ otvktl }y q
≈x  刘正恩 o张贵军 o张淑清 o等 q中药牛膝近年研究概况 q中医药
信息 ot||z okvl }tw q
≈y  中华本草编委会 q中华本草 u q上海 }上海科学技术出版社 o
t||| q{uz q
≈z  „§¤°¶ • ° o⁄¨ ° ®¨¨ × o „¥∏¯©¤·¬« ‹ „ q • „°⁄ ⁄‘„ ƒ¬±ª¨µ2
³µ¬±·¶¤±§ × µ¨³¨ ±²¬§¶}≤ ∏¯¨¶·² °¤¶·¬ªµ¤·¬²±¶²© ϑυνιπερασ¬±
„µ¤«¬¤¤±§∞¤¶·„©µ¬¦¤q׫¨ ²µ¨·¬¦¤¯ „³³¯¬¨§ Š ±¨¨ ·ot||v o{zkt ∗
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≈{  刘春林 o官春云 o李木旬 q植物 • „°⁄标记的可靠性研究 q生物
技术通报 ot||t okul }vt q
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第 uz卷第 y期
ussu年 y月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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∏±¨ qoussu
Στυδψ ον τηε Γενετιεψ Ρελατιονσηιπ βετωεεν Χηινεσε ανδ Κορεαν Μεδιχιναλ
Ματεριαλσ οφ Νιυξ βψ ωιτη τηε Μετηοδ οφ Ρ ΑΠ∆
‹∞‘Š ÷¬2½«¨ ± o Š˜’ …¤²2¯¬± o ≠ „‘ ≠∏2±¬±ª
k…¨ ¬­¬±ª ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ ²© × ≤  o …¨ ¬­¬±ª tsstsu o≤«¬±¤l
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¶·∏§¼·«¨ «¨ µ¨§¬·¤µ¼ µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³¥¨·º¨¨ ± ≤«¬±¨ ¶¨ ¤±§Ž²µ¨¤± ° §¨¬¦¬±¤¯ °¤·¨µ¬¤¯¶²© ‘¬∏¬¬¤¦«¼µ¤±2
·«¬¶µ²²·q Μετηοδ : × ±¨ ¶¤°³¯ ¶¨²©©²∏µ®¬±§¶²© ‘¬∏¬¬º¤¶¶·∏§¬¨§ º¬·«·«¨ ° ·¨«²§²© • „°⁄qΡεσυλτ : ∞¬³¤±§¨ §³µ²§∏¦·¶«²º §¨·²2
·¤¯ µ¨¦²µ§²©tss ¶³¨¦·µ∏° ¥¤±§¶o º«¬¦«³µ²√ §¨·«¤··«¨ «¨ µ¨§¬·¤µ¼ ª¤³¥¨·º¨¨ ± Ž²µ¨¤± ¶¨ ©¯2³µ²§∏¦¨§ Α .ϕαπονιχα ¤±§ Α . βιδεντατα
¬¶¶°¤¯¯¨ ¶·qΧονχλυσιον : Ž²µ¨¤± ¶¨ ©¯2³µ²§∏¦¨§ Α .ϕαπονιχᬶ±¨ ¤µ·² „ q≥¬§¨ ±·¤·¤q
[ Κεψ ωορδσ] • „°⁄~Ž²µ¨¤± ≥¨¯©2³µ²§∏¦¨§ Αχηψραντηεσ εαπονιχα ; Αχηψραντηεσ βιδεντατα
≈责任编辑 王康正 
蚯蚓纤溶酶活性影响因子的研究
刘向辉 o戈 峰
k中国科学院 动物研究所 o北京 tsss{sl
≈摘要  目的 }对提取过程中影响蚯蚓纤溶酶活性的 x种因子进行了分析 o以提高纤溶酶的提取活性 ∀方法 }
分别采用 s q| h ‘¤≤¯抽提 !ts h蔗糖抽提 !zx h酒精抽提出粗酶 ∀酶活测定方法采用尿激酶琼脂糖2纤维蛋白平板
法 ∀硒含量的测定方法采用 v ovχ2二氨基联苯胺比色法 ~砷含量的测定方法采用二乙氨基二硫代甲酸银比色法 ∀
结果 }饲养在牛粪饵料中的蚯蚓纤溶酶活性比饲养于生活垃圾中的蚯蚓纤溶酶活性更高 o蚯蚓体内砷的含量与纤
溶酶活性呈正相关 o而蚯蚓体内硒的含量对纤溶酶活性影响不大 ∀在采用 v种不同的蚯蚓纤溶酶的抽提方法中 o
zx h酒精抽提效率最高 os q| h氯化钠次之 ots h蔗糖最低 ~在蚯蚓纤溶酶纯化过程中 o透析比超滤对蚯蚓纤溶酶的
活性影响更小一些 ∀结论 }通过将蚯蚓饲养在适宜的饵料中 o使用合适的提取手段和提纯方法 o可以提高蚯蚓纤溶
酶的提取活性 ∀
≈关键词  蚯蚓纤溶酶活性 ~饵料 ~重金属 ~抽提方法
≈中图分类号  • u{w qu ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukussulsy2swuv2sw
地龙k蚯蚓l o自古为常用中药 ∀近年来 o特别是
发现了它具有纤溶活性后 o对蚯蚓的实验研究和临
床研究愈来愈广泛 !深入≈t ∗ w  ∀
以蚯蚓体内含有 v种溶解血栓的蚓激酶k即纤
维溶解酶 !纤溶酶原激活物和胶原酶l是国家批准的
预防和治疗心脑血管疾病的二类新药≈x  ∀蚯蚓纤溶
酶在临床用于预防和治疗脑血栓 o高血压等都有一
定的疗效 o越来越受到人们的重视 o但由于蚯蚓蚓激
≈收稿日期  usst2tu2us
≈通讯作者  戈 峰 电话 }kstslyuxw{s|v 传真 }kstsl
yuxyxy{| ∞°¤¬¯}ª¨©ƒ ³¤±§¤q¬²½q¤¦q¦±
酶的活性受原料k蚯蚓l的生产过程及提取分离等多
种因素的影响 o其产率较低 ∀要提高其产率 o就必须
研究影响其活性的因子 o而有关这方面的研究报道
极少 ∀本文研究了蚯蚓饵料 !金属元素 !分离提取方
法对蚯蚓纤溶酶活性的影响 o旨在于为提高蚯蚓蚓
激酶的产率提供科学依据 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料
本实验使用的蚯蚓为赤子爱胜蚓 Εισενια φοετι2
δα ≥¤√¬ª±¼ o不同处理的蚯蚓如下 ∀
1 q1 q1 普通蚯蚓 发酵良好的牛粪饲养 ux §的蚯
蚓 ∀
#vuw#
第 uz卷第 y期
ussu年 y月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o‘²qy
∏±¨ qoussu