全 文 ：＊通讯作者
收稿日期:2009-06-18;修回日期:2009-11-30
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中
国农业科学院草原研究所);中国科学院“西部之光”人才培养项目;
国家科技支撑计划项目(2008BADB3B06)资助
作者简介:田青松(1967-),男 , 内蒙古扎鲁特旗人 , 副研究员 ,
主要从事草地资源生态研究 , E-mail:tqingsong@sina.com.
文章编号:1673-5021(2010)01-0018-08
96份雀麦属材料遗传多样性的 ISSR分析
田青松1 , 2 ,韩　冰1 , 3 ,杨　劼1 , ＊ ,于　涛3 ,宋旭红3
(1.内蒙古大学生命科学学院 , 内蒙古　呼和浩特　010021;2.中国农业科学院草原研究所/农业部草原资源与生态重点
开放实验室 ,内蒙古　呼和浩特　010010;3.内蒙古农业大学生物工程学院 , 内蒙古　呼和浩特　010018)
　　摘要:利用 ISS R分子标记技术研究了来自国内外的 96份雀麦属材料的遗传多样性。 19 个 ISSR引物共扩增出
109 条谱带 , 其中 106 条是多态性谱带 ,多态性位点比率为 97.25%。 POPGENE 1.31软件分析结果显示:96 份雀麦
属材料总的基因多样性指数(Nei s)为 0.2756 , Shannon 信息指数为 0.4257 , 遗传多样性水平较高;基因流(N m)为
1.3273 , 各种群间有一定的基因交流。用 S LT NTsy s2.1e软件进行 UPGMA 聚类分析表明 , 96 份材料可分为 6 个
类群 ,与主成分分析结果基本一致。用 Arlequin3.1 软件进行 AMOVA分析表明 ,种间的分子变异比率为 15.85%,
种内的分子变异比率为 84.15%, 种内分子变异较大 , 种内遗传多样性高于种间的遗传多样性。
关键词:雀麦;种质资源;遗传多样性;ISSR
中图分类号:S543.024　　　文献标识码:A
　　雀麦属是禾本科中较大的一个属 ,文献对雀麦
属物种数量的估计从 100到 400不等。雀麦属植物
适于生长在温度适中的地区 ,在世界各地均有分布 。
雀麦属植物不同种差异很大 ,雀麦属植物大部分时
间叶鞘关闭;芒通常生于外稃近尖端;子房附有许多
毛状物;叶和叶鞘有些无毛 ,有些稀少毛 ,有些多毛;
花序松散 , 开放式的圆锥花序通常下垂 , 有时伸
展[ 1] 。一些雀麦品种在防治水土流失上有利用价
值 , 但必须谨慎利用 ,因为它有很强的蔓延能力 ,要
防止它成为入侵的杂草。随着对雀麦研究的不断深
入 ,人们也发现雀麦具有许多利用价值。有些雀麦
由于其优良的品质而被广泛利用[ 2] ,如无芒雀麦
(Bromus inerm is Leyss.)耐寒性很强 ,可作为草皮
材料和干草饲料[ 3] ;河边雀麦(Bromus riparius Re-
hmann.)丛生且适于低温生长 , 主要用作人工草
地[ 4] 。近年还培育出了优良的杂交种雀麦 , 如
S-9073M ,杂交的新品种具有产量增加 、凋谢晚 、再
生能力强 、匍匐根减少和种子产量增高等优良性
状[ 5] 。随着环境的破坏 ,许多物种消失 ,对雀麦种质
资源多样性的研究将有助于其物种的保存[ 6] 。本研
究采用 ISS R分子标记技术分析 96份雀麦属材料
的遗传多样性 ,以期为植物遗传育种和种质资源保
护工作提供基础数据 。
1　材料和方法
1.1　材料
96份雀麦材料来源见表 1。植物样品采自中国
农业科学院草原研究所沙尔沁科学试验站 ,每份材
料采集 10个不同植株的鲜嫩叶片 2片 ,等量混合后
置于-20℃下保存备用 。
1.2　实验方法
采用改进后的 CTA B法从冷冻叶片混合样中
提取植物基因组 DNA [ 9] 。总 DNA 经 RNase 处理
后分别在 260nm 和 280nm 处检测所提取基因组
DNA 的 OD值 ,根据 OD260/OD280的值判断其纯度 ,
然后再用 0.7%的琼脂糖凝胶对其进行电泳 ,在紫
外检测仪上观察其纯度并判断 DNA 分子的大小及
一致性[ 10] 。
1.3　引物筛选与 PCR扩增
试验所用引物均由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成 ,引物序列参照加拿大哥伦比亚大学
所设计的 96个 ISSR 引物序列[ 11] 。抽取 4个材料
的 DNA 样品进行混合 ,用混合后的 DNA 样品在
25μl的反应体系中进行扩增筛选 。从 62个引物中
选取了 19个扩增条带清晰 、重复性好的引物用于全
部样本的分析 。PCR 扩增的总体积为 25μl[ 12 ～ 13] :
包括 10 ～ 30ng DNA 模板;3μl的 10 ×buf fer;4μl
—18—
第 32 卷　第 1 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　2010 年 1 月
　　Vol.32　No.1　　　　　　　　　　Chinese Journa l of G rassland 　　　　　　　　　 Jan.2010　　
表 1　雀麦材料种名与代码
Table 1　Material codes and species names of Bromus L.
种名 Species nam e 材料代码 Material codes 来源 Origin
无芒雀麦 B romus inermis A28 , A29 , A33 , A34 , A37 , A39 , A40 , A44 ,
A49 , A51 , A52 , A59 加拿大
A26 , A32 , A42 , A48 , A58 , A65 , A67 , A68 前苏联
A61 , A63 , A64 美国
A47 , A55 , A56 波兰
A66 内蒙古正镶白旗
A57 , A30 内蒙古
A2 , A4 , A6 , A7 , A8 , A19 , A20 内蒙古东乌珠穆沁旗
A35 , A50 , A60 , A62 , A69 新疆
A31 山西
A1 , A43 , A53 内蒙古锡林郭勒盟
A3 , A16 , A22 内蒙古太仆寺旗
A38 内蒙古兴安盟
A45 甘肃兰州市
A54 内蒙古凉城县
A46 新疆奇台县
A15 内蒙古阿尔山市
A41 江苏
A9 , A13 , A23 内蒙古克什克腾旗
A18 内蒙古多伦县
A25 内蒙古呼和浩特
A10 内蒙古察右中旗
草地雀麦 B.biebersteinii C2 , C5 , C7 加拿大
C6 前苏联
C1 , C4 中国农业大学
C3 美国
缘毛雀麦 B.ci l iatus B8 内蒙古阿尔山市
B10 内蒙古草勘院
B9 内蒙古农业大学
B1 内蒙古东乌珠穆沁旗
B2 , B3 , B4, B5 , B6 , B7 内蒙古克什克腾旗
沙地雀麦 B.i rcu tensi s SD 内蒙古正蓝旗
河边雀麦 B.r ip arius E1 美国
红雀麦 B.rubens F1 美国
大麦状雀麦 B.hord eaceu s G1 美国
密丛雀麦 B.benekeni i H 1 美国
硬雀麦 B.r ig idus K1 美国
杂色雀麦 B.varieg atus I1 美国
疏花雀麦 B.remot i f lorus J1 贵州
雀麦 B.ja ponicus D1 陕西
D2 北京
的 MgCl2 (25mM);1.0μl 引物(10pmo l/mL);2μl
dN TP (2.5mM );0.25μl Taq DNA polymerase
(Cenbio t ～ 5U/μL);最后用无菌双蒸水补充体系到
25μl。PCR扩增程序为:94℃预变性 10m in;94℃、
1min ,48 ～ 50℃、1min , 72℃、2min , 44 个循环;72℃
延伸 10min。
1.4　PCR产物检测
PCR扩增产物在加入绿色荧光染料的 1.5%琼
脂糖凝胶上电泳分离 ,电泳结束后在凝胶成像系统
下拍照 。
1.5　数据处理
按照电泳图谱中同一位置上 DNA 条带的有无
进行统计 ,有带的记为“1” ,无带的记为“0” ,进行数
据分析[ 14 ～ 17] 。应用 POPGENE1.31软件进行遗传
多样性参数分析 , S LT NT sy s2.1e 软件进行 UPG-
MA 聚类分析和主成分(PCA)分析 ,用 A rlequin3.1
软件对种间和种内的遗传变异进行分析 。
—19—
田青松　韩　冰　杨　劼　于　涛　宋旭红　　96 份雀麦属材料遗传多样性的 ISS R分析
2　结果与分析
2.1　96份雀麦材料的遗传多样性分析
96份雀麦材料的 ISSR 产物有丰富的多态性 ,
19条 ISS R引物共扩增出 109 条稳定 、清晰的谱带
(表 2),每个引物产生 1 ～ 10 条带 , 条带从 150 ～
2000bp均有分布 ,其中 106 条为多态性条带 ,多态
性位点占 97.25%。引物 P19在部分材料上的扩增
图谱见图 1。
表 2　雀麦 ISSR扩增反应的引物序列 、退火温度 、扩增条带数 、多态性条带数
Table 2　ISSR primer sequences used for analysis of brome, with primer annealing temperature ,
number of bands amplified, and number of polymorphic bands amplified
序号
No.
引物序列
Primer
Sequen ce
退火温度(℃)
Annealing
temperatu re
(℃)
扩增条带数
No. of
bands
多态性条带数
No.of
polymorphic
bands
序号
No.
引物序列
Prim er
Sequ ence
退火温度(℃)
Annealin g
temperatu re
(℃)
扩增条带数
No.of
bands
多态性条带数
No.of
polymorphic
bands
P1 (AC)8C 55 4 4 P11 (AG)8GT 56 7 7
P2 (GA)8C 53 7 7 P12 (TCC)5AC 60 1 1
P3 (AG)8 T 53 8 8 P13 CAA(TG)7 T 56 4 4
P4 (TC)8C 55 7 7 P14 TCA(TG)7T 53 6 5
P5 (AG)8C 55 6 6 P15 CCA(TG)7T 56 10 10
P6 (CT)8G 55 7 7 P16 AGA(TG)7T 53 6 5
P7 (AG)8GC 56 9 8 P17 TAA(TG)7 T 52 3 3
P8 (CT)8RG 55 4 4 P18 TGT(AC)8GA 58 4 4
P9 (AC)8CT 57 3 3 P19 CC(CA)8CGA 62 9 9
P10 (AC)8CC 56 4 4 总数 109 106
图 1　引物 P19对部分雀麦材料的 ISSR扩增图谱
Fig.1　ISSR finge rprints of some brome materials amplified with P rimer 19
　　96份雀麦材料总的Nei s基因多样性指数(H)
为 0.2756 ,Shannon信息指数(I)为 0.4257 ,虽然二
者估算的遗传多样性程度有所差异 ,但两种方法估
计的各材料平均遗传多样性的变化趋势基本一致 。
12个雀麦种的多态位点百分率在 0 ～ 95.41%之间 ,
平均为 22.63%,最高的是无芒雀麦 ,较低的是疏花
雀麦 、密丛雀麦 、杂色雀麦 、红雀麦 、河边雀麦 、硬雀
麦 、大麦状雀麦和沙地雀麦;12 个种的 Nei s 基因
多样性指数在 0 ～ 0.2550 之间 ,平均为 0.0726 ;12
个种的 Shannon信息指数在 0 ～ 0.3969 之间 ,平均
为 0.1099;Nei s基因多样性指数和 Shannon 信息
指数大小与种群多态位点百分率大小的趋势基本一
致(表 3)。
2.2　12个雀麦种的遗传分化分析
12个雀麦种遗传分化的方差分析(AMOVA)结
果见表 4。在总的遗传变异中有 84.15%的变异发生
在种内 ,15.85%的变异发生在种间 ,表明种内变异是
雀麦遗传多样性的主要来源。12个种间的的遗传分
化系数 Υst差异不大 ,变幅为 0.1339 ～ 0.3655 ,其中
杂色雀麦 、红雀麦 、河边雀麦 、硬雀麦 、密丛雀麦 、大
麦状雀麦 、疏花雀麦 、沙地雀麦的遗传分化系数最高
(Υst =0.3655), 草地雀麦的遗传分化系数最低
(Υst =0.1339)。用 AMOVA 分析得出的 Υs t值近
似基因分化度 FS T[ 18] 值 , 根据公式 Nm =(1 -
FS T)/4FS T 计算种间的基因流 Nm 为 1.3273 ,表明
种间有一定的基因交流 ,但基因交流有限。
—20—
中国草地学报　2010年　第 32 卷　第 1 期
表 3　96 份雀麦属材料的 ISSR 遗传多样性
Table 3　Genetic variability of ISSR marker in 96 brome materials
材料
M aterial s
样本数
Sample
n umbers
Nei s多样性指数
Nei s index
Sh an non s指数
Shannon index
多态位点数
Polym orphism
locus num bers
多态位点百分率(%)
Percent of polym orphism
loci(%)
无芒雀麦 B.inermis 69 0.2550 0.3969 104 95.41
雀麦 B.jap on icus 2 0.1558 0.2275 41 37.61
草地雀麦 B.bieberstein ii 7 0.2395 0.3570 73 66.97
缘毛雀麦 B.ci liatus 10 0.2209 0.3376 78 71.56
疏花雀麦 B.remot i f lorus 1 0 0 0 0
密丛雀麦 B.benekenii 1 0 0 0 0
杂色雀麦 B.variega tus 1 0 0 0 0
红雀麦 B.rubens 1 0 0 0 0
河边雀麦 B.ripar ius 1 0 0 0 0
硬雀麦 B.rig id us 1 0 0 0 0
大麦状雀麦 B.hordeaceus 1 0 0 0 0
沙地雀麦 B.ir cutensis 1 0 0 0 0
平均值 96 0.0726 0.1099 296 22.63
总计 96 0.2756 0.4257 106 97.25
表 4　种间和种内分子变异的 AMOVA分析
Table 4　Analysis of molecular variance(AMOVA)within and among population
变异来源
Source of variat ion
自由度
df
变异组分
Variance component
总变异百分率(%)
Percen tage of total varian ce
Υst P
种间 11 2.64670 15.85 0.1585 <0.001
种内 84 14.05055 84.15 0.8415 <0.001
总计 95 16.69726
　　注:p值表示比观察值变异大的概率 ,这个概率是通过把种群中的样本经过 1023次随机排列改变计算得到。
Note:P values are the probabi liti es of having aⅡ re-ex t reme varian ce component than the observed values alone.Probabilit ies w ere calcu-
l ated by 1023 random permutations of in dividu als acros s popu lation s.
2.3　96份雀麦材料的聚类分析与主成分分析
2.3.1　聚类分析
根据 19个 ISSR引物的PCR扩增条带数据 ,使
用 Dice(1945)[ 19] 相似性系数计算 96份雀麦材料的
遗传相似度矩阵 。其相似度在 0.3889 ～ 0.9143 之
间 ,最高的遗传相似度是 A42和 A45 ,两者亲缘关
系最近;最低的遗传相似度是 SD和 D2 ,两者亲缘关
系最远。根据 Dice(1945)相似度表构建 UPGMA 聚
类关系树状图(图 2),在相似系数 0.608处把 96 份
雀麦材料分为 6个类群:第Ⅰ类群中包括 80份种质
材料 ,96%的无芒雀麦分布于此;此类群在亲缘关系
上较为密切 ,其中红雀麦 F1 、密丛雀麦 H1 、雀麦
D1 、疏花雀麦 J1 、大麦状雀麦 G1也分布在此组 ,有
可能与无芒雀麦关系较近 。此外还有 9个缘毛雀麦
分布于此类群的一个区域 ,包含了缘毛雀麦材料的
90%,在相似系数 0.688处明显地看到有 6个缘毛
雀麦独自聚集在一起 。第 Ⅱ类群包括 11份种质材
料 , 85.7 %的草地雀麦分布于此类;此类群可以认为
是草地雀麦的分组 ,其中还包括河边雀麦 E1 、雀麦
D2 、杂色雀麦 I1 、硬雀麦 K1 、无芒雀麦 A65 ,这 5个
雀麦材料可能与草地雀麦亲缘关系较近。第Ⅲ类群
包括 1份种质材料 ,即无芒雀麦种群 A17 ,可能是一
个比较特别的种群 。第Ⅳ类群包括草地雀麦 C2和
无芒雀麦 A 30。第Ⅴ类群仅有 1份材料 ,即缘毛雀
麦 B1 ,与其他缘毛雀麦亲缘关系较远 。第 Ⅵ 类群仅
有沙地雀麦 SD ,与其它雀麦亲缘关系较远 ,并且它
的形态特征和生长环境都与其它雀麦差异较大 。
—21—
田青松　韩　冰　杨　劼　于　涛　宋旭红　　96 份雀麦属材料遗传多样性的 ISS R分析
图 2　依据 Dice(1945)相似性系数的 96 份雀麦材料 UPGMA 聚类分析树状图
Fig.2　Dendrog ram (UPGMA method)of 96 brome materials based on the simila rity co efficient of Dice(1945)
2.3.2　主成分分析
根据 96份雀麦材料全部特征的 Dice 相似系数
进行主成分分析[ 20 ～ 21] ,前 3个主成分解释的变异分
别为 40.72%、4.83 %和 2.82%。按照前 3 个主成
分三维图的排序(图 3)可将 96份雀麦材料分成 6
类:第 Ⅰ类群有 79 份材料 ,包括 66 个无芒雀麦 、9
个缘毛雀麦 、红雀麦 F1 、密丛雀麦 H1 、雀麦 D1 、疏
花雀麦 J1;从第三主成分方向上分析发现 B2 、B3 、
B4 、B5 、B7 、B8缘毛雀麦聚集在一起 ,其余的多为无
芒雀麦聚集区。第Ⅱ类群有 12份材料 ,是草地雀麦
的主类群 。第Ⅲ类群仅有一个材料无芒雀麦 A31 ,
在第三主成分方向分析 ,与其他类群关系较远 。第
Ⅳ类群包括草地雀麦 C2和无芒雀麦 A30。第Ⅴ类
群仅有缘毛雀麦 B1。第Ⅵ 类群有 1份种质 ,即沙地
雀麦 SD。
比较图 2 、图 3可知 ,对 96份雀麦材料进行系
统聚类分析和主成分分析的结果基本一致。但主成
分分析可以从不同方向 、不同层面更加直观地显示
各材料间的关系[ 13] 。
3　结论与讨论
3.1　利用 ISS R分子标记对 96 份雀麦材料进行了
分析 ,其总的 Nei s基因多样性指数(H)为 0.2756 ,
Shannon信息指数(I)为 0.4257 ,总的遗传多样性水
平较高。由于 Nei s指数估算等位基因频率时忽略
了杂合基因 ,所以计算出的种群内和物种总的基因
多样性要低于 Shannon 信息指数估算数值 。今后
的研究还可以结合其它共显性的分子标记如 SSR
或 RFLP 加以对比 ,互相补充。应继续扩大材料的
收集范围 ,丰富雀麦的材料数 ,以求更广泛和精确的
探究雀麦的遗传多样性 。
3.2　已有研究表明 ,植物种群的遗传结构反映了种
的长期进化史(分布区转移 、生境片断化和种群特
化)、突变 、遗传漂变 、交配系统 、基因流和选择等不
—22—
中国草地学报　2010年　第 32 卷　第 1 期
图 3　96 份雀麦的主成分分析
Fig.3　P rincipal components analy sis o f 96 brome materials
同过程的相互作用 。研究中发现 ,雀麦种群间遗传
变异的产生主要与种群间的基因交流受到限制有
关。可能是它属内的染色体倍性水平存在多样性 ,
且不同倍性染色体的种间杂交成活率十分低导致种
间较低的基因交流 。雀麦遗传变异主要存在于种
内。另外 ,虽然雀麦种间染色体倍性水平差异较大 ,
但许多雀麦被人们广泛的引种栽培 ,他们之间可能
会发生一定的基因交流和混杂 ,一旦存活就必将是
有别于母本的新材料 。这也是雀麦总的遗传多样性
水平较高的原因 。但它的作用远小于种内频繁交流
产生的变异 ,正好吻合本实验中的 AMOVA分析结
论 ,即种内变异大于种间变异 。
3.3　96份雀麦材料聚类分析和主成分分析结果基
本一致 ,都分成 6个类群 。96 份雀麦材料并没有按
照植物分类学意义上所属的种准确分为 12个类群 ,
这可能有以下几个原因:①12个种的材料参差不
齐 ,虽然包括了 12 个种 ,但是每种的材料数差异较
大 ,某些种的材料仅有 1份 ,这可能导致聚类分析与
主成分分析的误差 。 ②不同材料间可能存在混杂 。
③种内变异为主 ,种间交流为辅的长期变化导致亲
缘关系的复杂。
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中国草地学报　2010年　第 32 卷　第 1 期
Genetic Diversity Analysis of 96 Brome Materials
Based on ISSR Markers
TIAN Qing-song1 , 2 , HAN Bing 1 , 3 , YANG Jie1 , YU T ao3 , SONG Xu-hong 3
(1.College of L i fe S cience , Inner Mongolia Universi ty , Hohhot 010021 ,China ;2 .Grassland Research
Insti tute , Chinese Academy of Agricul tural Science/K ey Laboratory o f Grassland
Resources&Ecology , Ministry of A griculture , Hohhot 010010 , China ;3 .B ioengineering
Col lege o f Inner Mongol ia Agricul tural Universi ty , Hohhot 010018 , China)
Abstract:Inter-simple sequence repeat(ISSR)techniques w ere used to ident ify the genetic diversity of
96 brome ge rmplasms from China and abro ad .12 species w ere included:B romus inerm is , B.japonicus ,
B.biebersteinii , B.ci liatus , B .remot i f lorus , B.benekenii , B .variegates , B.rubens , B.riparius , B.
rigidus , B.hordeaceus , B.ircutensis.19 ISSR primers produced a total of 109 bands , of w hich 106 w ere
po lymo rphic bands.The average percentage of polymo rphic bands w as 97.25 %.As analy zed by the sof t-
ware POPEGEN1 .31 , the genet ic div ersity of 96 brome materials w as high w ith Nei s g ene diversi ty of
0.2756 and Shannon s informat ion index of 0 .4257.The gene f low w as 0.5995 , indicating that gene ex-
change among populations w as limited .Using S LT N Tsy s2.1e sof tw are , the 96 brome mate rials w ere
clustered into six g roups in coef ficient =0.608 by UPGMA clustering analy sis , as w ell as six g roups by
principal component analy sis.These tw o results of the analy sis w ere consistent basically .AMOVA analy-
sis of 12 brome species by A rlequin3.1 sof tw are indicated that the mo lecular variation rat io among popula-
tions is 15.85%and w ithin populations is 84.15 %.Molecular variation w ithin populations w as higher than
among populations.
Key words:Brome;Germplasm resources;Genetic dive rsity ;ISSR
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田青松　韩　冰　杨　劼　于　涛　宋旭红　　96 份雀麦属材料遗传多样性的 ISS R分析