全 文 :*通讯作者
收稿日期:2013-11-21;修回日期:2014-03-21
基金项目:农业部牧草种质资源保护项目“牧草温带备份库的维
护与备份繁殖入库(2011-10)”;科技部“国家多年生牧草种质资源
平台项目”
作者简介:张雪(1986- ),女,吉林公主岭人,在读硕士研究生,主要
从事牧草资源与育种研究,E-mail:zhangxue1986212@163.com.
文章编号:1673-5021(2014)03-0104-04
25份无芒雀麦种质资源遗传多样性的ISSR分析
张 雪1,2,刘青松1,2,师文贵1,*,李志勇1,刘 磊1,2
(1.中国农业科学院草原研究所,内蒙古 呼和浩特 010010;
2.中国农业科学院研究生院,北京 100081)
摘要:以提取的无芒雀麦基因组DNA为模板,通过试验筛选出了ISSR-PCR反应体系中最适宜的各组分浓
度,并用POPGENE软件对数据进行分析。结果表明,供试25份无芒雀麦材料总的Nei's基因多样性指数为0.2434,
Shannon信息指数为0.3721;聚类分析研究将供试25份材料分为五大类,第一类为编号1、4、11、14、15、18、19、21、
23和15号材料,第二类为编号2、5、8、9、10、22和24号材料,第三类为编号3、6和17号材料,第四类为20号材料,
第五类为7、12和16号材料。
关键词:无芒雀麦;种质资源;遗传多样性;ISSR
中图分类号:S543 文献标识码:A
无芒雀麦(Bromus inermis Leyss)是一种优
良牧草,原产于欧洲,其野生类型广布于亚洲和北
美洲的温带地区[1]。无芒雀麦耐寒性强,在生态建
设、植被恢复等方面具有重要作用[2~3],有关其生理
生化、种群数量结构、生物量结构以及栽培技术等方
面的研究报道[4~6]较多,而在遗传多样性方面国内
主要对雀麦属牧草进行了研究[7~8],对无芒雀麦遗
传多样性的研究报道仅见宋旭红等[9~10]。为此,本
试验在前人研究的基础上对材料进行扩充,应用
ISSR分子标记技术进行遗传多样性分析,以便进一
步发掘利用无芒雀麦优良品质资源。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试25份无芒雀麦材料及其来源见表1。在
中国农业科学院草原研究所实验室应用恒温培养箱
培养得到25份材料的幼嫩植株,每份材料采集10
个植株的鲜嫩叶片备用。
1.2 试验方法
提取植物基因组总DNA用CTAB法。得到的
总DNA先经RNase处理,在260nm和280nm处检
测所提取基因组 DNA 的 OD 值,根据 OD260/
OD280的值来判断其纯度,然后再用8.5g/L的琼
脂糖凝胶进行电泳,在紫外检测仪上观察并判断
DNA分子的大小及一致性。
1.3 引物筛选与PCR扩增
引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司
负责合成,引物序列参照加拿大哥伦比亚大学所设
计的ISSR引物序列。用混有随机抽取的4份材料
的DNA样品的20μl的反应体系对引物进行扩增筛
选。从45个引物中选出10条比较好的引物用于全
部样品的分析。优化后的PCR扩增体系总体积为
20μl:包括 2.5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.5μl、
10XPCR-buffer 2μl、10mmol/L 的dNTP 0.4μl、
10mmol/L的Mg2+1.2μl、25mmol/L的引物0.4μl、模
板DNA 2.5μl,最后用无菌双蒸水补充体系到
20μl。PCR反应程序为94℃ 预变型4min,94℃变
形40s,52~62℃退火45s,72℃延伸1min50s,72℃
延伸10min,4℃条件保存。
1.4 PCR产物检测
电泳在10g/L琼脂糖凝胶上进行并加入核酸
染料。用凝胶成像系统对电泳后的胶拍照。根据
DL2000Marker对条带大小进行估计。
1.5 数据处理
电泳图谱中DNA条带有时记为1,无带时记为
0。利用NTsys2.1e软件进行如下分析:用SAHN
程序中的 UPGMA 方法进行聚类分析,用 POP-
GENE32软件分析全部材料的遗传参数。
2 结果与分析
2.1 无芒雀麦基因组DNA的检测
—401—
第36卷 第3期
Vol.36 No.3
中 国 草 地 学 报
Chinese Journal of Grassland
2014年5月
May 2014
表1 供试材料及来源
Table 1 Names and source
of Bromus inermis analyzed in this study
代号
No.
种质名称
Germplasm name
拉丁名
Latin name
来源
Source
1 杂交雀麦 Bromus biebersteinni×
B.inermis
加拿大
2 无芒雀麦 B.inermis Leyss 甘肃
3 无芒雀麦 B.inermis Leyss 新疆
4 无芒雀麦 B.inermis Leyss 加拿大
5 无芒雀麦 B.inermis Leyss 额左旗
6 无芒雀麦 B.inermis Leyss 黄土高原
7 无芒雀麦 B.inermis Leyss 美国
8 无芒雀麦 B.inermis Leyss 山西
9 杂交雀麦 Bromus biebersteinni×
B.inermis
加拿大
10 无芒雀麦 B.inermis Leyss 加拿大
11 无芒雀麦 B.inermis Leyss 加拿大
12 无芒雀麦 B.inermis Leyss 美国
13 杂交雀麦 Bromus biebersteinni×
B.inermis
加拿大
14 无芒雀麦 B.inermis Leyss 加拿大
15 无芒雀麦 B.inermis Leyss 锡盟
16 无芒雀麦 B.inermis Leyss 美国
17 无芒雀麦 B.inermis Leyss 新疆谢家沟
18 无芒雀麦 B.inermis Leyss 锡盟
19 无芒雀麦 B.inermis Leyss 加拿大
20 无芒雀麦 B.inermis Leyss 河北
21 无芒雀麦 B.inermis Leyss 呼盟
22 无芒雀麦 B.inermis Leyss 海拉尔
23 无芒雀麦 B.inermis Leyss 锡盟多伦县
24 无芒雀麦 B.inermis Leyss 陕西陇县
25 无芒雀麦 B.inermis Leyss 山西繁峙县
提取高质量的无芒雀麦基因组DNA是ISSR
扩增反应成功与否的关键。本试验用康为世纪试剂
盒提取得到的 DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测的
DNA为一条清晰完整的条带,无明显拖尾,无RNA
条带(图1),表明提取的DNA大小比较一致,纯度
较高,可用于后续反应。
2.2 ISSR引物筛选及无芒雀麦遗传多态性
从45条ISSR引物中筛选出10条能扩增出稳
定性和重复性较好结果的引物(表2),10条引物共
检测出DNA条带79条,其中66条为多态条带,多
态性比例为83.6%,每条引物产生的条带数在4~9
之间,条带大小从500bp到2000bp均有分布,25份
无芒雀麦材料总的 Nei's基因多样性指数(h*)为
0.2434,Shannon信息指数(I*)为0.3721,总的遗
传多样性较高。上述数据表明,无芒雀麦具有丰富
的遗传多样性。其中引物834和引物845对不同无
芒雀麦品种(系)的扩增结果如图2和图3。从电泳
图中可以看出,25份无芒雀麦材料扩增条带清晰,
多态性较好,显示出较高的遗传多样性。
表2 无芒雀麦ISSR扩增反应的引物序列、
扩增条带数、多态性条带数
Table 2 ISSR primer sequences used for analysis of Bromus
inermis,with number of amplified bands,and number of
amplified polymorphic bands
引物
Primer
引物序列
(5'-3')
Primer sequences
(5'-3')
扩增条带数
Name of
amplified
bands
多态性条带数
Number of
amplified
polymorphic
bands
多态性条
带比例
(%)
Percentage of
polymorphic bands
UBC807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 8 6 75.0
UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 5 4 80.0
UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 7 5 71.4
UBC817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 5 5 100.0
UBC823 TCT CTC TCT CTC TCT CC 8 6 75.0
UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 8 8 100.0
UBC831 ATA TATATA TAT ATATYA 7 4 57.1
UBC834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 9 9 100.0
UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GCTC 7 5 71.4
UBC845 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 6 5 83.3
UBC856 ACA CAC ACA CAC ACA CCTA 9 9 100.0
total 79 66 83.6
M为DL2000Marker;电泳图谱上的编号即为表1中无芒雀麦代号,下图同
M is the DL2000Marker;The numbers in fingerprint are corresponding to the numbers of Bromus inermis in Table1,the same as below
图1 无芒雀麦基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Bromus inermis genomic DNA
—501—
张 雪 刘青松 师文贵 李志勇 刘 磊 25份无芒雀麦种质资源遗传多样性的ISSR分析
图2 引物834对25份无芒雀麦的ISSR扩增图谱
Fig.2 ISSR fingerprint with a part of Bromus inermis amplified with primer 834
图3 引物845对25份无芒雀麦的ISSR扩增图谱
Fig.3 ISSR fingerprint with a part of Bromus inermis amplified with primer 845
2.3 供试25份种质材料聚类分析
聚类分析结果(图4)表明,供试25份无芒雀
麦种质材料的遗传相似系数为0.43~1.00,其中
来自山西的8号材料和来自陕西陇县的24号材
料、来自美国的7号材料和16号材料相关系数最
大(接近1),说明这两对材料每对的2个材料遗传
差异最小,亲缘关系最近。此外,来自加拿大的1
号材料和4号材料、来自新疆的3号材料和来自
黄土高原的6号材料之间亲缘关系也较近,相关
系数均高于0.9。在相似系数0.74处,可将供试
25份种质材料分为五大类:第一类包括1号、4
号、11号、14号、15号、18号、19号、21号、23号
图4 依据DICE相似性系数的25份无芒雀麦材料UPGMA聚类分析亲缘关系树状图
Fig.4 Dendrogram(UPGMA method)of 25 Bromus inermis based on the similarity coefficient of Jaccard
—601—
中国草地学报 2014年 第36卷 第3期
和25号共10份材料,其中1、4、11、14和19号材料
起源地均为加拿大,15和18号材料起源地为锡盟,
21号材料起源地为呼盟,23号材料起源地为锡盟多
伦县,25号材料来源于山西繁峙县;第二类包括2
号、5号、8号、9号、10号、22号和24号共8份种材
料,其中9、10、13号材料来源于加拿大,2号材料来
源由于甘肃,5号材料来源于额左旗,8号材料来源
于山西,22号来源于海拉尔,24号材料来源于陕西
陇县;第三类包括3号、6号和17号共3份材料,其
中3号和17号材料来源于新疆,6号材料来自于黄
土高原;第四类仅有来自河北的20号材料;第五类
包括7号、12号和16号材料,均来源于美国。
3 讨论
分子标记从 DNA水平上揭示品种间的差异
性和相关性。目前,关于ISSR技术应用于无芒雀
麦遗传多样性分析方面的研究不多。宋旭红等[9]
通过比较69份无芒雀麦种质资源的遗传多样性,
通过 UPGMA聚类分析,将69份无芒雀麦种质材
料划分成了5个类群,他还通过ISSR分子标记[10]
技术分析发现,不同的无芒雀麦种质材料之间遗
传多样性丰富。本试验采用ISSR分子标记方法
对25份无芒雀麦进行分析所得的结果与上述研
究基本一致,将供试25份无芒雀麦材料分成五大
类,其聚类结果与25份无芒雀麦种质材料的地域
来源基本相吻合;而将来自加拿大的5份材料和
来自中国内蒙古的4份材料及来自山西的1份材
料聚为一类,可能是无芒雀麦在引种过程中发生
了质变,也可能是由于ISSR分子标记的局限性
以及实验误差等原因所致。雀麦属植物分布广
泛,在长期的历史演化过程中,由于突变、基因交
流、遗传分化、品种选育等自然和人工选择等,使
得各品种(系)和地理种群间产生了较大的遗传
分化。
4 结论
4.1 供试25份无芒雀麦的多态性条带介于57.1%~
100%,总的多态性条带为83.6%。
4.2 供试25份无芒雀麦总的Nei’s基因多样性指
数为0.2434,Shannon信息指数为0.3721,总的遗
传多样性较高。
4.3 聚类分析将供试25份无芒雀麦种质材料分成
五大类群,呈现出来自同一国家的不同材料之间差
异较小、亲缘关系较近,而来自不同国家的材料则表
现出明显的遗传多样性规律。
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(下转第120页)
—701—
张 雪 刘青松 师文贵 李志勇 刘 磊 25份无芒雀麦种质资源遗传多样性的ISSR分析
Analysis of Flavonoid Content in Leaves and Stems
of Nitraria tangutorum
GAO Zhe,WANG Jia,TE Bu-qin,WANG Ying-chun
(College of Life Science,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China)
Abstract:Using high liquid chromatography-tandem mass spectrometry the flavonoids in the methanol
extract in leave and stems of Nitraria tangutorum were qualitatively analyzed.A total of 12flavonoids
components were identified,including three quercetin derivatives,two kaempferide derivatives,and seven
isorhamnetin derivatives.For semi-quantitative analysis of flavonoids,the total content of flavonoids in
stems was up to 14.44mg/g,in leaves was up to 42.43mg/g.
Key words:Nitraria tangutorum;Flavonoids;Content analy
檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼
sis
(上接第107页)
Analysis of Genetic Diversity of 25 Bromus inermis
Accessions Based on ISSR
ZHANG Xue1,2,LIU Qing-song1,2,SHI Wen-gui 1,LI Zhi-yong1,LIU Lei 1,2
(1.Grassland Research Institute of CAAS,Hohhot 010010,China;
2.Graduate School,CAAS,Beijing100081,China)
Abstract:Template DNA for ISSR was extracted fromBromus inermis leaf tissue,ISSR amplification
system was optimized,an optimal reaction system was established,data were analyzed with the software
POPGENE.The results showed that the total Nei's gene diversity index of 5 Bromus inermis Leyss acces-
sions was 0.2434and Shannons Information Index was 0.3721;25materials were divided into four groups,
group one was consist of ten Bromus inermis materials:No.1,No.4,No.11,No.14,No.15,No.18,No.19,
No.21,No.23and No.25,group two was composed of eight materials:No.2,No.5,No.8,No.9,No.10,
No.22and No.24,group three includes three Bromus inermis materials:No.3,No.6and No.7,group four
included only one Bromus inermis materials:No.20,and the last group had three materials:No.7,No.12,
and No.16.
Key words:Bromus inermis;Germplasm resources;Genetic diversity;ISSR
—021—
中国草地学报 2014年 第36卷 第3期