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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-12-09
作者简介 : 尹建洪 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物化工 ; E-mail: yinjianhong200810@126.com
通讯作者 : 罗立新 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 微生物制药和生物化工 ; E-mail: btlxluo@scut.edu.cn
南极假丝酵母脂肪酶 B（CALB）基因在乳酸乳球菌
MG1363中的整合及表达
尹建洪 罗立新 王成
（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）
摘 要： 根据南极假丝酵母脂肪酶 B（CALB）的基因序列将 CALB基因进行 TA克隆、酶切鉴定及测序后，亚克隆至大肠
杆菌 -乳酸乳球菌穿梭表达载体 pMG36e-NisI中，构建重组表达载体 pMG36e-NisI-CALB。设计特异性引物 P3和 P4，对重组质粒
pMG36e-NisI-CALB进行红霉素抗性基因的敲除，以构建食品级表达载体 pMG36N-CALB，后再将两种重组质粒分别电转化入乳酸
乳球菌 MG1363，以 Nisin为选择压力，考察 CALB在 MG1363中的表达情况。结果显示，成功构建了表达载体 pMG36e-NisI-CALB
及 pMG36N-CALB，两株重组菌在含有 20 IU Nisin/mL的培养基中均生长情况良好，遗传性能稳定，且经水解圈鉴定，CALB能够
进行活性表达。进一步研究发现，CALB基因整合到乳酸乳球菌 MG1363染色体中。
关键词： 乳酸乳球菌 食品级表达载体 CALB 基因敲除 整合 活性测定
Expression and Integration of Candida antarctica Lipase B Gene in
Lactococcus lactis MG1363
Yin Jianhong Luo Lixin Wang Cheng
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）
Abstract: It has become a research focus in molecular biology of lactic acid bacteria that exploring some genes with practical
applications significance by cloning and expression in lactic acid bacteria and constructing a food-grade selection marker in Lactococcus lactis
expression system. According to the sequence of CALB, the CALB fragment was amplified by polymerase chain reaction with pMD19-CALB as
template. After sequenced, the amplicon was confirmed by Blast from NCBI. Then, the nisI was subcloned into the E. coli-L. lactis shuttle vector
pMG36e-NisI, resulting in the plasmid pMG36e-NisI-CALB. In order to construct a food-grade vector pMG36N-CALB, erythromycin resistance
gene from the recombinant plasmid pMG36e-NisI-CALB was knocked out by redesigning the pair of specific primers. The recombinant strain
MG1363/pMG36N-CALB and MG1363/pMG36e-NisI-CALB were obtained when the plasmid pMG36N-CALB and pMG36e-NisI-CALB were
transformed into L. lactis MG1363 competent cell by electroporation respectively. In a result, the expression vector pMG36e-NisI-CALB and
pMG36N-CALB were constructed. When the medium 20 IU Nisin/mL, the recombinant strain carrying pMG36N-CALB showed the same growth
curve and genetic stability as L. lactis MG1363. CALB can be expressed actively and the CALB gene was integrated into the chromosome of
Lactococcus lactis MG1363.
Key words: Lactococcus lactis Food-grade expression vector CALB Gene knock-out Integrate Activity assay
脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，不
仅能催化油脂水解，而且能在非水相中催化酯合成、
转酯化、酸解等反应。其中南极假丝酵母脂肪酶 B
（Candida antarctica lipase B，CALB）的用途最为广泛，
其具有许多优良的特性，对非水溶性和水溶性物质
都有较强的催化活性，在 酯 化［1］、水 解［2］、转 酯［3］，
以及其它类型反应中都显示了较其它脂肪酶更为出
色的催化性能，在水解和有机合成反应中具有高度
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期106
的立体选择性。到目前为止，该酶被认为是催化氨
解反应最合适的酶［4］。因此在有机合成、制药、医
药中间体等领域得到广泛应用。
乳酸菌（LAB）是一类被公认为安全的食品级
微生物（generally regards as safe，GRAS），也是在食
品中应用最广泛的重要工业菌株，被人类应用于乳
制品、肉制品、蔬菜制品及软饮料等食品的加工和
保鲜 ；同时，随着对乳酸菌的生理作用的深入研究，
人们逐渐认识到乳酸菌对人体健康有益的生理功能。
近年来，乳酸菌分子生物学迅猛发展，通过基因重
组技术将外源基因转入正常乳酸菌，构建能够表达
异源蛋白或体现新功能的基因工程菌株已成为研究
热点［5］。将 CALB 基因转入乳酸乳球菌 MG1363 中，
不仅有助于人们对乳酸菌基因工程菌的进一步研
究，也有利于 CALB 更广泛地应用于食品、医药行
业。但是，传统的乳酸菌表达载体都以抗生素（如
红霉素、氯霉素）抗性基因作为选择标记，将抗生
素抗性基因投放到环境中或人和动物的体内，由于
存在抗性因子转移的隐患，可能给生物安全性带来
严重的后果。为了防止使用抗生素抗性标记所引起
的危害，最有效的办法是使用对人体和环境安全的
食品级选择标记取代抗生素抗性标记。Nisin 抗性基
因 nisI 所编码的蛋白 NisI，是乳链菌肽 Nisin 产生菌
为防御 Nisin 自身的毒害作用而产生的一种脂蛋白，
将其导入对 Nisin 敏感的宿主菌中，能赋予宿主菌
对 Nisin 的抗性［6］。本研究以本实验室所构建的含
食品级标记基因 nisI 的载体 pMG36e-NisI［7］为表达
载体，将南极假丝酵母脂肪酶 B 基因克隆到穿梭质
粒 pMG36e-nisI 中，再去掉红霉素基因，最后将质
粒 pMG36N-CALB 和 pMG36e-NisI-CALB 分别转化到
乳酸乳球菌 MG1363 中，研究 CALB 在乳酸乳球菌
MG1363 中的稳定性和表达情况。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株 乳酸乳球菌 MG1363 为本实验
室保存，质粒 pMG36e-NisI 为本实验室构建，大肠
杆菌 XL-Blue 为本实验室保存，T 载体 pMD18-T 购
于 TaKaRa（大连）有限公司，pMD19-CALB 为华南
理工大学杨博老师馈赠。
1.1.2 培养基 大肠杆菌用 LB 培养基，37℃振
荡培养。乳酸乳球菌用 GM17（含 0.5% 的葡萄糖
的 M17）或 elliker 培养基，30℃静置培养。乳酸
乳球菌电穿孔转化复苏用 SGM17MC 培养基（42.3
g/L M17、5 g/L Glucose、171 g/L Sucrose、1.9 g/L 的
MgCl2、0.22 g/L 的 CaCl2）［8］，红霉素在大肠杆菌和
乳酸乳球菌中的作用浓度为 250 μg/mL 和 10 μg/mL，
乳链菌肽 Nisin 在 MG1363/pmg36e-NisI 的作用浓度
为 20 IU/mL。
1.1.3 主要试剂和仪器 限制性内切酶 BamH I、
Pst I、EcoR I 和 T4 DNA 连接酶、rTaq DNA 聚合酶、
Prime STAR HS DNA polymerase 以 及 DL2000、1 kb
DNA Marker、λ-EcoT14I digest DNA Marker 均 购 于
TaKaRa（大连）有限公司。Omega 胶回收试剂盒、
质粒小量提取试剂盒以及 Omega 细菌基因组 DNA
提取试剂盒均购于 Omega 中国总代理 - 广州飞扬生
物工程有限公司。乳链菌肽（Nisin）购自 Sigma 公司，
红霉素购自上海生物工程有限公司。其余常用试剂
均为国产分析纯。
PCR 仪（Eppendorf 公司，Mastertycler 型），凝
胶成像分析系统（Bio-Rad 公司，Universal Hood Ⅱ
型），台式高速冷冻离心机（Eppendorf 公司，Cente-
rifuge 5804R 型），超声波细胞粉碎机（宁波新芝生
物科技股份有限公司，Scientz-IID 型），真空冷冻干
燥机（德国 CHRIST ALPHA1-4），电转仪（Bio-Rad，
Gene Pulser Xcell）。
1.2 方法
1.2.1 将 CALB基因克隆至T载体 应用 Oligo6.0 设
计软件，根据 CALB 的基因序列，合成两条引物：5
端引物 P1：5-GCTCTAGAGGATCCTTACCTTCTGGA-
TCAG-3，下划线为 BamH I 位点 ；3端引物 P2 ：5-
AACTGCAGTTAGGGTGTAACAATACCAG-3，下划线
为 Pst I 位点。引物由捷瑞生物技术公司合成。
以 pMD19-CALB 质粒为模板，50 μL 体系扩增
CALB，扩增程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，59.1℃
30 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10
min［9］。将 PCR 产物切胶回收，后将回收的 PCR 产
物与 pMD18-T 载体 16℃连接，PCR 鉴定阳性克隆，
再将此载体送去上海英骏生物技术有限公司广州分
2012年第5期 107尹建洪等 ：南极假丝酵母脂肪酶 B（CALB）基因在乳酸乳球菌 MG1363 中的整合及表达
公司测序，将测序正确的重组克隆命名为 pMD18-
CALB。
1.2.2 重组质粒 pMG36e-NisI-CALB 的构建 分别
用 BamH I 和 Pst I 双酶切 pMD18-CALB 和 pMG36e-
NisI，回收目的片段。将回收的 CALB 和 pMG36e-
NisI 16℃过夜连接，PCR 酶切鉴定阳性克隆，重组
克隆命名为 pMG36e-NisI-CALB。
1.2.3 重组质粒 pMG36N-CALB 的构建 应用 Oligo
6.0 设计软件，根据pMG36e-NisI的基因序列合成两条
引物 ：5端引物 P3 5-TACGTCGATCGAATTCGGTC-
CT-3，下划线为 EcoR I 位点；3端引物 P4 5-CGCG
AATTCATGGATAAACTGCATCCCTTA-3，下划线为
EcoR I 位点。引物由上海英骏生物技术有限公司广
州分公司合成。
以 pMG36e-NisI-CALB 质 粒 为 模 板，50 μL 体
系 PCR 扩增除红霉素基因之外的 pMG36e-NisI-
CALB 的基因，扩增程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，
58.5℃ 30 s，72℃ 4 min，30 个循环 ；最后 72℃延
伸 10 min［9］。将 PCR 产物切胶回收，将回收的 PCR
产物用 EcoR I 单酶切。回收目的片段，将两端均被
EcoR I 酶切的目的片段 16℃过夜连接。该重组质粒
命名为 pMG36N-CALB。
1.2.4 乳酸乳球菌 MG1363 的电转化 乳酸乳球菌
转化采用电穿孔转化法，脉冲参数为 2.0 kV/mm（峰
电压），25 μF 和 200 Ω。重组质粒 pMG36N-CALB
和 pMG36e-NisI-CALB 以及原质粒 pMG36e 电转化乳
酸乳球菌 MG1363，挑取转化子阳性克隆，提取质
粒及基因组，进行 PCR 鉴定。
1.2.5 乳酸菌表达产物的活性鉴定 将 pMG36N-
CALB 和 pMG36e-nisI-CALB 的阳性克隆分别在 MRS
培养基培养 36 h 后，取样于放置牛津杯的含 0.2％
三丁酸甘油酯的 MRS 平板中［10］，培养 24 h 后，观
察是否有水解圈以及水解圈的大小。
2 结果
2.1 重组质粒pMG36e-NisI-CALB的鉴定
以 pMD19-CALB 质粒为模板，PCR 扩增 CALB，
获得的约为 1 000 bp 的基因片段，测序结果表明扩
增的 CALB 基因与模板中的序列完全一致。分别用
BamH I 和 Pst I 双酶切鉴定，电泳结果（图 1）表明
pMG36e-NisI-CALB 构建正确。
M. 1 kb DNA Ladder Marker ； 1. pMG36e-NisI-CALB 经
BamH Ⅰ和 Pst I 双酶切
图 1 重组载体 pMG36e-nisI-CALB的 BamH I和
Pst I双酶切鉴定图
2.2 重组质粒pMG36N-CALB的鉴定
以 pMG36e-nisI-CALB 质粒为模板，PCR 扩增除
红霉素基因之外的 pMG36e-NisI-CALB 质粒，回收
的 PCR 产物经酶切、连接，将连接产物电转化入乳
酸乳球菌 MG1363 中，培养 36 h 后，未能提取出质
粒，而提取基因组后，以 P1 和 P2 为引物，基因组
为模板 PCR 扩增后，获得的基因片段约为 1 000 bp，
与 CALB 基因的片段大小相符（图 2）。因而，表明
CALB 基因已存在于重组菌中，可见载体 pMG36N-
CALB 构建成功。
M. 1 kb DNA Ladder Marker ；1. 以 MG1363/pMG36N-CALB
基因组为模板，PCR 扩增 CALB 基因
图 2 CALB基因已存在于重组菌染色体中的鉴定图
2.3 重组质粒pMG36e-NisI-CALB与pMG36N-CALB
在乳酸菌MG1363基因组中的整合
两种重组菌培养 36 h 后，未能提取出质粒。而
提取基因组后，以 P1 和 P2 为引物，基因组为模
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期108
板 PCR 扩增后，获得的质粒基因片段约为 1 000 bp
（图 3），与 CALB 基因的片段大小相符。可见导致
pMG36N-CALB 在乳酸菌 MG1363 基因组中的整合的
原因不是红霉素的敲除，推测这种整合情况是由原
质粒 pMG36e 与乳酸乳球菌 MG1363 本身导致。故
将原质粒 pMG36e 电转化入乳酸乳球菌 MG1363 中，
依然未能提取出质粒，提取基因组后，也以 P3 和
P4 为引物，基因组为模板 PCR 扩增，获得的基因片
段约为 3 600 bp，与质粒 pMG36e 的基因片段大小相
符。表明载体 pMG36N-CALB 与乳酸乳球菌 MG1363
基因组整合，整合的原因与敲掉红霉素基因无关，
可能与质粒 pMG36e 本身有关。 于食品、医药工业，避免了传统基因工程所需要的
繁琐的提取工艺，极大降低了生产成本。
将 pMG36N-CALB、pMG36e-NisI-CALB 以及 pM-
G36e 电转入乳酸菌 MG1363 后，经验证发现重组质
粒整合入乳酸菌 MG1363 染色体中，推测整合与质
粒 pMG36e 有关，针对这种情况，将乳酸菌 MG1363
基因组与质粒 pMG36e 进行序列比对，发现有 3 段
同源序列，两段同源性都高达 99%，另一段同源性
为100%。故推测质粒的整合与这3段同源序列有关。
且在 nisin 的选择压力下，通过传代试验传至 120 次
后，96% 的重组菌基因组中存在 CALB 基因，说明
该重组菌生长情况良好，遗传性能稳定，CALB 基
因在乳酸菌中可稳定存在。
通过本试验研究，CALB 基因克隆在食品级表
达载体 pMG36-NisI 的 MCS 处，能够正确表达有活
性的脂肪酶。这不仅拓宽了脂肪酶的表达宿主，扩
大了脂肪酶的应用范围，而且为进一步构建能高效
表达脂肪酶的表达系统奠定基础。
由于表达载体 pMG36N-CALB 的启动子是组成
型的，所以其编码基因的表达量只能是处于其生理
浓度范围内，故接下来需要将 pMG36-NisI-CALB 的
组成型启动子换成诱导型启动子，从而建立高效
诱导表达系统。同时，采用游离脂肪酶为催化剂，
酶的再生、循环使用困难，而固定化脂肪酶（如
Novo435）价格昂贵，应用于工业化大生产成本过高。
以表面展示有脂肪酶的乳酸乳球菌全细胞作为催化
剂，具有固定化酶的优点，且酶制剂生产工艺简单，
将发酵液直接离心收集菌体，无需固定化即可用于
生产，反应后离心收集菌体即可重复利用，大大降
M. 1 kb DNA Ladder Marker ；1. 以 MG1363/pMG36e
基因组为模板，PCR 扩增 pMG36e 基因
图 3 质粒 pMG36e与重组菌染色体整合的鉴定图
2.4 乳酸菌表达产物的活性鉴定
将 pMG36N-CALB 的阳性克隆在 MRS 培养基
培养 36 h 后，取样于放置牛金杯的含 0.2％三丁酸
甘油酯的 MRS 平板中，培养 24 h 后，发现平板中，
样品菌液沉淀经超声波破碎后的上清液出现透明圈。
而其它样品均未出现透明圈（图 4）。可见 CALB 在
重组菌中表达产物有活性，存在于细胞内，且表达
量很小，只能是处于其生理浓度范围内。
3 讨论
本研究将 CALB 基因克隆入质粒 pMG36e-NisI
中，去掉红霉素基因，构建不含抗生素的载体
pMG36N-CALB，后转化入乳酸菌 MG1363 中。避免
了抗性因子转移的隐患，将乳酸菌来源的 nisI 基因
作为乳酸菌的选择标记将更为安全。利用本研究所
构建的食品级表达载体 pMG36N-CALB 可直接应用
1. 上清液 ； 2. 菌液沉淀经超声波破碎后的上清液 ； 3. 菌液沉淀经
超声波破碎后的沉淀 ； 4. 缓冲液 ； 5. 菌液
图 4 CALB在乳酸菌中表达产物的活性鉴定图
2012年第5期 109尹建洪等 ：南极假丝酵母脂肪酶 B（CALB）基因在乳酸乳球菌 MG1363 中的整合及表达
低生产成本［11］。因此，表面展示脂肪酶 CALB 也将
是本研究的下一个重要任务。
4 结论
成功构建了 CALB 的穿梭表达载体 pMG36e-
NisI-CALB，将其电转至乳酸乳球菌 MG1363，能够正
确表达有活性的南极假丝酵母脂肪酶 B。成功敲除
了 MG36e-NisI-CALB 中的红霉素抗性基因，即构建
了食品级穿梭表达载体 pMG36N-CALB。证实了穿梭
表达载体与乳酸乳球菌 MG1363 基因组整合。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）