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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
利用重组大肠杆菌生产双乙酰
赵宏峰 边英男 黄伟达
(复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系,上海 200433 )
摘 要: 大肠杆菌自身代谢特征具有发酵生产双乙酰的天然优势。利用 PCR技术,以广泛用于双乙酰生产的 Lactococ-
cus lactis基因组 DNA为模板,克隆得到 A-乙酰乳酸合成酶基因 A-als, 将其构建在表达载体 pET-30a上。与能够高效表达 3种
大肠杆菌来源 H SP 70家族分子伴侣的 pK JE 7质粒共同转化 E. coliBL21( DE3)。利用目的蛋白质分子伴侣共表达的方法,首
次获得了能够高效表达具有酶活力的 A-乙酰乳酸合成酶的重组大肠杆菌。在静置培养条件下, 能够在该菌株的培养基中检
测到双乙酰的生成。融合蛋白酶在温度为 30- 40e 和 pH 在 6- 7之间时具有较高的酶活, 以丙酮酸为底物, 该酶最适 pH为
6. 8, 最适温度为 39e 。
关键词: 双乙酰 乳酸乳球菌 A-乙酰乳酸合成酶 分子伴侣 共表达
A Prelim inary Study on Producing D iacetyl with RecombinantE. coli
ZhaoH ongfeng B ian Y ingnan HuangW eida
(D epar tment of B iochem istry and M olecularB io logy, ShanghaiM edical College, Fudan University, Shanghai 200433)
Abstrac:t Escher ichia coli has many advan tages in produce d iace ty .l S inceLacto cocus lactis is comm on ly used to produce d iace-t
y le, its genom e w as used as a temp la te to amp lify the gene encod ingA-A ce to lactate synthase. The PCR fragm entw as inserted in to pET-
30a vecto r, and the recomb inant expression plasm id and the plasm id pK JE7 was transform ed intoE scherichia co li BL21( DE3). Co-ex-
pression of these tw o p lasm ids pe rfo rm h igh effic iency to produce active A- Aceto lactate synthase, and the bacter ia were detec ted to pro-
duce diacety.l U sing py ruva te as substrate, the recomb inan t enzym e had an optimum tem perature of 35- 40e and pH o f 6. 0- 7. 0.
Key words: D iace tyl Lactococus lactis A-Ace to lactate syn thase Chaperone Co-expression
收稿日期: 2010-06-07
作者简介:赵宏峰,男,硕士,研究方向:蛋白质化学与基因表达控制; E-m ai:l m erlin0000@ 126. com
通讯作者:黄伟达,男,教授, E-m ai:l w huang@ fudan. edu. cn
双乙酰是一种淡黄色具有强烈牛奶香味的液
体,在奶油、奶酪、酸奶等乳制品中, 由于乳酸菌
( Lact ic ac id bacteria, LAB) ,如乳酸乳球菌 ( Lactococ-
cus lactis) ,乳链球菌 ( S trep tococcus lactis) , 嗜热链球
菌 ( S tretococcus thermophilus)等在自然发酵过程中会
产生一定浓度的双乙酰, 而具有独特的风味 [ 1 ]。食
品工业生产的其他一些非乳制品, 如爆米花、饼干
等,通过利用双乙酰作为食品添加剂的方法来产生
奶油风味。同时,在多种香精配方中,双乙酰都是广
泛使用的重要香料。目前, 生产双乙酰的方法主要
有:提取法、化学合成法、以及生物发酵法 [ 2] , 提取
法的成本较高。利用化学合成法合成的双乙酰会混
入难以进行质量控制的杂质,在化学合成双乙酰的
过程中还会产生大量污染环境难于处理的废水、废
气、废渣。在食品安全和环境保护受到整个社会广
泛关注的今天,通过微生物发酵法生产双乙酰已经
成为未来双乙酰生产工艺发展的必然趋势 [ 3 ]。
目前,在双乙酰发酵生产过程中,乙偶姻的生成
是一个重要的问题。乙偶姻也具有一定的奶油风
味,但是香味远弱于双乙酰。常用的工程菌自身组
成性表达的乙酰乳酸脱羧酶会催化 A-乙酰乳酸生
成乙偶姻的不可逆反应, 此反应途径的存在大大降
低了双乙酰的产率。由于自身代谢特征,大肠杆菌
没有乙酰乳酸脱羧酶的表达,且具有培养周期短,代
谢易于控制,营养要求粗放等许多优势 [ 4, 5 ] ,较适合
作为双乙酰生产的工程菌。在乳酸乳球菌等发酵生
产双乙酰的菌株中, A-乙酰乳酸合成酶 ( A-A ceto lac-
tate synthase, A- ALS, E. C. 4. 1. 3. 18)是双乙酰生成
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
的关键酶,它能够催化一分子丙酮酸脱羧并与另一
分子丙酮酸缩合成一分子 A-乙酰乳酸,再由乙酰乳
酸这种前体分子在有氧状态下,非酶自然氧化生成
双乙酰 [ 6]。
本研究首次将 Lactococu s lactis来源的 A-乙酰乳
酸合成酶基因通过分子克隆的方法引入大肠杆菌
中,并探索出能够在大肠杆菌中高效可溶性表达具
有天然催化活性的重组 A-乙酰乳酸合成酶的方法,
并通过对重组酶性质的分析对发酵条件进行初步的
摸索。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和质粒 宿主菌 E. coli BL21 ( DE3)、
E. coli Top10为本实验室保存; 乳酸乳球菌菌株 (Lac-
tococus lactis LM 2345)由爱尔兰 Keith Tompson教授
提供;质粒 pET-30a购自 Novagen公司; 质粒 pK JE7
购自 TaK aRa公司。
1. 1. 2 培养基和培养条件 用于乳酸乳球菌的
MRS培养基参见文献 [ 7]。Lactococus lactis LM 2345
接种于 MRS培养基, 30e 静置培养 24 h。大肠杆菌
E. coli Top10与 E. coli BL21( DE3)接种于 LB培养
基 (蛋白胨 1%、酵母膏 0. 5%、N aC l 1% ), 37e 摇床
培养。
1. 1. 3 酶和试剂 限制性内切酶、PrimerSTAR HS
DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自 TaK aRa生物技术
公司 (中国, 大连 ) ; Agarose购自 Gene Tech公司 (中
国,上海 ); DNA凝胶回收试剂盒购自美国 Axygen
公司; PCR引物由上海 Inv itrogen生物技术有限公司
合成; DNA序列分析工作由上海 Inv itrogen生物技
术有限公司完成;卡那霉素、氯霉素、IPTG和咪唑购
自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司; 一水肌酸、
硫胺素焦磷酸购自上海维编科贸有限公司; N i柱购
自德国 Merck公司; BCA蛋白质含量测定试剂盒购
自上海荔达生物科技有限公司;其他试剂均为国产
分析纯级。
1. 1. 4 软件与数据库 序列分析软件: VectorNTI,
生物信息学网站: www. ncb.i nlm. nih. gov。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计与合成 根据已报道的乳酸乳球
菌 KF147的基因组 DNA序列 ( GenB ank登录号:
NC_013565) ,设计外侧引物 F1 /R1, 同时根据 pET-
30a载体序列设计内侧引物 F2 /R2, 采用套式 PCR
扩增 A-a ls基因 (表 1)。
表 1 用于克隆 A-als的引物
引物名称 引物序列 ( 5c- 3c) 酶切位点
F1 TGGAACTTGTTCCAGATGATG 无
R1 GAAGCATCCTCTTGGAGTGGTA 无
F2
GGAATTCCATATGTCTGAGAAACAATTT-
GGGGCGAA
Nde I
R2
ACCGCTCGAGCTCTTCAGGCAATA-
ATTTTTCTGC
Xho I
下划线标识限制性内切酶位点
1. 2. 2 A-als基因的克隆 CTAB法提取乳酸乳球
LM 2345基因组 DNA, 以抽提的 Lactococus lactis
LM 2345基因组 DNA为模板, F1 /R1为引物扩增得
到一段长度为 2 100 bp左右的片段。PCR反应条
件如下: 94e 预变性 3 m in; 94e 30 s, 45e 30 s,
72e 2 m in, 进行 35个循环; 72e 延伸 7 m in。以上
述过程的 PCR产物为模板, 以 F2 /R2为引物进行
PCR反应, 得到长度约为 1 800 bp左右,包含有表 1
所示酶切位点以及乙酰乳酸合成酶基因的 DNA片
段。 PCR反应条件如下: 94e 预变性 3m in; 94e 30
s, 55e 30 s, 72e 2m in, 进行 30个循环; 72e 延伸 7
m in。 PCR产物经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测分离,
并用 DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将 PCR
扩增得到的片段纯化、酶切、回收, 连接到表达载体
pET-30a上,通过 CaC l2法转化 E. coli Top10感受态
细胞,经 10mg /L卡那霉素的初步筛选,获得了转化
有 pET-30a重组质粒的 E. co li Top10。挑取单克隆
重组大肠杆菌至 2mL液体 LB培养基, 经过 37e 6
h培养后, 碱法抽提重组质粒。
1. 2. 3 重组质粒的鉴定与重组大肠杆菌菌株的构
建 通过 PCR鉴定与双酶切鉴定对抽提的重组质
粒进行鉴定,获得了能够表达带有 H is- tag的融合蛋
白重组质粒 pET-30a-A-als。对上述鉴定结果正确
的重组质粒进行双向测序,测序得到的 DNA序列利
用 VectorNT I翻译成蛋白质序列后与已报道的乳酸
乳球菌 A-乙酰乳酸合成酶的蛋白质序列比较。并
重复过程 1. 2. 2, 通过不同批重组阳性重组质粒
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2011年第 1期 赵宏峰等:利用重组大肠杆菌生产双乙酰
DNA测序结果的比对证实之前的 PCR过程是否引
入突变。将鉴定正确的质粒 pET-30a-A-a ls转化 E.
coli BL21( DE3)表达菌株的感受态细胞后,获得含有
重组质粒的菌株 BL21(DE3)-pET-30a-A-als。
1. 2. 4 共表达菌株的构建 将能够表达大肠杆菌
来源分子伴侣 DnaK、DnaJ和 G rpE的 pKJE 7质粒载
体 [ 8] ,通过 CaC l2法转化 BL21( DE3)-pET-30a-A-als的
感受态细胞,经卡那霉素 10 mg /L和氯霉素 25 mg /L
的双抗筛选,获得能够同时高效表达目的蛋白质和
3种分子伴侣分子的菌株 BL21 ( DE3 )-pET-30a-A-
als-pKJE7。这 3种分子伴侣分子具有在蛋白质翻译
过程中,帮助肽链折叠成为正确分子结构的作用。
1. 2. 5 A-ALS的诱导表达 从菌株 BL21 ( DE3)-
pET-30a-A-als的平板上挑选单克隆接种到 2 mL含
卡那霉素霉素 10 mg /L的 LB培养基中, 在 37e ,
200 r /m in下振荡培养 8 h。按 1%的接种量将 2mL
母液接种到 200 mL含卡那霉素 10 mg /L的 LB培
养基中, 在 37e , 200 r /m in下振荡培养至 OD600达
0. 6左右,加入 IPTG使其终浓度为 0. 45mmol /L,再
在 25e 振荡培养 10 h; 另一方面, 从 BL21 ( DE3)-
pET-30a-A-als-pK JE7的平板上挑选单克隆接种到 2
mL含卡那霉素 10 mg /L,氯霉素 25 mg /L的 LB培
养基中,在 37e , 200 r /m in下振荡培养 8 h。按 1%
的接种量将 2 mL母液接种到 200 mL含卡那霉素
10 mg /L, 氯霉素 25 mg /L, 阿拉伯糖 0. 5 mg /mL的
LB培养基中, 在 37e , 200 r /m in下振荡培养至
OD600达 0. 6左右, 加入 IPTG使其终浓度为 0. 45
mmo l/L,再在 25e 振荡培养 10 h。最后, 7 000 r/m in
离心 20 m in收集菌体。
1. 2. 6 A-ALS表达情况鉴定 取离心收集的 BL21
( DE3 )-pET-30a-A-a ls取 5 Lg加入 100 LL SDS-
PAGE sample buffer后备用。剩余的菌体经溶菌酶
37e 处理 30m in,超声破壁, 7 000 r/m in离心 20m in。
取 100 LL上清,加入 50 LL 3 @ SDS-PAGE sample buf-f
er备用。取 5 Lg沉淀加入 100 LL SDS-PAGE sam-
ple buffer后备用。上述 3种蛋白质样品沸水浴 90 s
后,利用 10% SDS-PAGE进行检测。 BL21 ( DE3 )-
pET-30a-A-als-pK JE7鉴定过程与上述过程相同。
1. 2. 7 A-ALS的纯化 离心收集的 BL21 ( DE3)-
pET-30a-A-als-pKJE7菌体经溶菌酶 37e 处理 30m in,
超声破壁, 7 000 r/m in离心 20 m in得到上清, 上清
通过,以 50 mmo l/L 磷酸钾缓冲溶液, 200 mmo l/L
NaC l平衡 N i柱, 以 50 mmo l/L 磷酸钾缓冲溶液,
200mmo l/L N aC l冲柱,分别以 50 mmo l/L磷酸钾
缓冲溶液, 200 mmo l/L N aC ,l 100 mmo l/L咪唑和
200mmo l/L咪唑洗脱。得到高纯度的 A-ALS, 最
后保存在含 12%甘油的磷酸钾缓冲溶液中, 冻存
于 - 20e 。
将上述过程中的上样流出, 50 mmo l/L 磷酸钾
缓冲溶液, 200 mmol /L N aC ,l 100 mmo l /L咪唑以及
200 mmo l/L咪唑洗脱分别取 100 LL, 加入 50 LL
3 @ SDS-PAGE sample buffer后废水浴 90 s, 用 SDS-
PAGE检测融合蛋白质的纯化情况。
1. 2. 8 双乙酰发酵有效性研究 将 BL21( DE3 ),
BL21( DE3)-pET-30a-A-als, 以及 BL21 ( DE3)-pET-
30a-A-a ls-his-pK JE7三种菌株分别以摇瓶与静置两
种方式在含有 5 g /L葡萄糖的 LB培养基中, 37e
培养 24 h后, 7 000 r/m in离心 20 m in。以 LB培养
基为负对照,对菌液上清中双乙酰含量进行检测。
1. 2. 9 A-ALS基本性质的测定 酶活力的测定方
法参见文献 [ 9]。 ( 1 ) A-ALS最适温度的测定:
11217中纯化到的 A-ALS稀释一定倍数后与 20
mmo l/L丙酮酸进行反应, 反应 buffer为 pH 6. 5的
磷酸钾缓冲溶液。选择 30e 、35e 、40e 、50e 和
60e 作为反应温度分别进行酶活力检测。 ( 2) A-
ALS最适 pH的测定: 1. 2. 7中纯化到的 A-ALS稀释
一定倍数后与 20 mmo l /L丙酮酸钠进行反应, 反应
温度 37e 。反应 buffer为磷酸钾缓冲溶液,选择 pH
5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和 9. 0进行酶活力检测。
2 结果和分析
2. 1 A-als基因表达载体构建结果
如图 1所示, 以 pET-30a-A-a ls为模板, F2 /R2
为引物的 PCR反应,产生一个大小约为 1 800 bp的
片段,经 Nde I /X ho I双酶切之后, 放出一个大小与
PCR结果相同的片段,且该片段大小与预计试验结果
大小相同。表明重组质粒 pET-30a-A-als构建正确。
重组融合蛋白的安吉酸序列与 NCB I数据库中
报道的乳酸乳球菌 A-乙酰乳酸合成酶的蛋白质序
列比对,同源性高达 99%。通过不同批重组阳性重
组质粒 DNA测序结果的序列比对后, 发现 PCR过
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
程并未引入突变。
M. DNA M ark erer; 1. pET-30 a-A-als( 1 ) PCR鉴定结
果 ; 2. pET-30 a-A-als( 2 ) PCR鉴定结果 ; 3. pET-30a-
A-als( 1 ) 酶切鉴定结果 ; 4. pET-30 a-A-als( 2 ) 酶切鉴
定结果
图 1 重组质粒的 PCR和酶切鉴定结果
2. 2 A-ALS的诱导表达与纯化结果
图 2为 BL21(DE3)-pET-30a-A-al与质粒 pK JE7
共转化 BL21( DE3),构建的 BL21( DE3)-pET-30a-A-
als-pK JE7菌株表达蛋白质的总蛋白、上清、包涵体
经 SDS-PAGE 检测的试验结果; 以及在对 BL21
( DE3)-pET-30a-A-a ls-pKJE7大肠杆菌菌体粗提液
进行 N i亲和层析纯化时,各步骤产出的蛋白质样品
进行 SDS-PAGE检测的结果。
1. pET-30a-A-als (未诱导 ) ; 2. pET-30a-A-als ( IPTG 诱
导 ) ; 3. pET-30a-A-als的包涵体; 4. pET-30a-A-als菌粗提
液; 5. pET-30a-A-als-pK JE7(阿拉伯糖和 IPTG诱导 ) ; 6.
pET-30 a-A-a ls-pK JE7的包涵体; 7. pET-30a-A-als-pKJE7
菌粗提液; 8.菌粗提液 N i柱的上样流出; 9. 100 mm ol/L
咪唑洗脱; 10. 250 mm ol /L咪唑洗脱
图 2 A-ALS的诱导表达及 N i柱纯化
如图 2所示, BL21( DE3)-pET-30a-A-als菌株虽
然蛋白质表达量很高,但主要以包涵体的形式存在,
而可溶化的 A-ALS表达量很低。共转化 pKJE7质
粒十分显著地提高了可溶化 A-ALS的表达量。
N i亲和层析对 BL21( DE3)-pET-30a-A-als-pKJE7
大肠杆菌菌体粗提液的纯化过程中各步骤的蛋白质
溶液经过 SDS-PAGE检测结果可知, 含 100 mmo l/L
咪唑的洗脱液能将与柱子非特异性结合的蛋白质完
全冲洗下来;含 200mmol /L咪唑的洗脱液能将与柱
子特异性结合的 A-ALS洗脱下来 (图 2)。
2. 3 不同大肠杆菌菌株在不同发酵条件生产双乙
酰的检测结果
通过文献记录的相关方法, 只在静置培养的
BL21( DE3)-pET-30a-A-a ls-pK JE7中检测到双乙酰
的生成, 浓度为 32. 63 mmo l/L。可以看出, 具有高
效可溶化表达 A-乙酰乳酸合成酶能力的 BL21
( DE3)- pET-30a-A-als-pK JE7菌株在含氧量较低的
发酵情况下具有生产出双乙酰的能力。大肠杆菌本
身,以及仅有少量 A-ALS可溶化表达的 BL21( DE3)-
pET-30a-A-als并不具备生产双乙酰的能力。
2. 4 A-ALS的基本性质检测结果
由试验结果可知, A-ALS最适温度为 39e ,在 35-
40e 之间有较高酶活力 (图 3-A ); 其最适 pH618, 在
pH 6- 7之间能保持较高酶活 (图 3-B)。
图 3 温度 ( A)和 pH( B)对 A-ALS酶活性的影响
3 讨论
目前,为了提高微生物发酵生产双乙酰的量,大
量的研究是针对乳酸乳球菌等能够自然发酵产出双
乙酰的菌株展开的。它们当中有可作为工业发酵生
产双乙酰的菌种, 但双乙酰生成过程中被异化为乙
偶姻的问题一直是大家研究的重点。另外, 目前使
用的菌株在发酵过程中, 均需要加入较为昂贵的培
养基作为发酵的原料 [ 10]。本研究旨在发挥大肠杆
菌发酵生产双乙酰的优势, 弥补利用乳酸菌发酵存
在的营养要求高,培养周期长,会大量形成乙偶姻等
不足 [ 5]。首次通过分子克隆的方法在在大肠杆菌
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2011年第 1期 赵宏峰等:利用重组大肠杆菌生产双乙酰
中引入 A-乙酰乳酸合成酶基因, 并探索出使这一双
乙酰生产过程中的关键酶高效可溶化表达的方法,
构建了一条能够生产双乙酰的代谢途径。大肠杆菌
在其自身的厌氧发酵过程中由丙酮酸为前体产生的
混合酸有甲酸、乙酸, 而只有在有氧状态下, A-乙酰
乳酸才能够非酶氧化产物。因此, 无论是细胞内的
底物浓度,还是双乙酰发酵生产过程中的培养基的
溶氧量,都是大肠杆菌发酵生产双乙酰重要的因素。
因此, 对 A-乙酰乳酸合成酶的酶学性质等的研究,
是提高大肠杆菌发酵生产双乙酰产率的良好途径,
需要在在今后的过程中进一步的探索。
另外,本研究利用与分子伴侣共表达的方法,帮
助 A-乙酰乳酸合成酶在大肠杆菌翻译过程中进行
正确折叠,从而显著提高了具有活性的 A-乙酰乳酸
合成酶产量。据文献 [ 11]报道, 该酶的 Km值较大,
具有活力的酶的表达量对产物的生成非常重要,本
研究中的试验结果也证实了这一点。显著提高酶可
溶化表达量之后,在上清中检测到了双乙酰的生成。
随着对双乙酰生成途径的进一步研究, 会有更多的
与之相关的酶被发现, 如文献 [ 12]中报道的 NOX
酶,通过多种蛋白质共表达的方法,引入我们的表达
体系, 也是进一步提高双乙酰的产率的重要途径。
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(责任编辑 李楠 )
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