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普通小麦与无芒雀麦不对称体细胞杂交的研究



全 文 :普通小麦与无芒雀麦不对称体细胞杂交的研究
向凤宁 夏光敏 周爱芬 陈惠民
(山东大学生命科学学院 济南 250100)
黄 粤 翟晓玲
(青岛市农业科学研究所 青岛 266100)
摘要 普通小麦(Triticum aestivum L.)99P 原生质体与经紫外线照射的无芒雀麦(Bromus inermis Leyss)愈伤组织来
源的原生质体用PEG法诱导融合。融合再生的 3 个单细胞克隆(No.1~ No.3)经染色体 、同工酶和 RAPD分析表明 ,
它们均为杂种细胞系。No.1 克隆形成的愈伤组织分化出大量白化苗 , 其叶片同工酶和 RAPD分析均出现双亲特征
谱带及新带 ,白化苗的染色体数目为 42 ~ 54 ,大于亲本小麦 , 并具有无芒雀麦的小染色体和染色体断片 , 确认它们
为不对称体细胞杂种。
关键词 小麦 ,无芒雀麦 , 紫外线照射 ,不对称融合 , 白化苗
Asymmetric Somatic Hybridization Between Wheat (Triticum aestivum)
and Bromus inermis

XIANG Feng-Ning XIA Guang-Min ZHOU Ai-Fen CHEN Hui-Min
(School of Life Science , Shandong University , Jinan 250100)
HUANG Yue ZHAI Xiao-Ling
(Research Institute of Agriculture of Qingdao City , Qingdao 266100)
Abstract Asymmetric hybridization was conducted between wheat and Bromus inermis Leyss which is a dis-
tantly related intergeneric plant (belonging to different tribe)of wheat and possesses some favorable traits ,
such as resistant to cold , drought and disease.Protoplasts isolated from young embryo-derived calli of common
wheat(Triticum aestivum L., cv.99P , (AABBDD), 2n=42)were fused with UV-treated protoplasts isolat-
ed from young embryo-derived calli of Bromus inermis by PEG method.Three clones(No.1 ~ No.3)were re-
generated from the fusion products and differentiated into albino seedlings.The clones and the seedlings were
all verified as hybrids by chromosome counting , isozyme and RAPD analysis.Their isozyme and RAPD pattern
contained the characteristic bands of both parents as well as new band(s).The chromosome numbers of albino
were in the range of 42 ~ 54 with small chromosomes of Bromus inermis and chromosome fragments.The above
results confirmed that hybrid albinos were obtained.
Key words Triticum aestivum , Bromus inermis , UV-irradiation , Asymmetric protoplast fusion , Albino
  近年来 ,植物的体细胞杂交由于供体-受体不对
称融合方法的应用 ,增加了成功的机会 ,可望实现部
分核基因或胞质基因的转移 ,达到育种改良的目的 。
在此方面小麦曾存在较大的困难 ,但近几年 ,已获得
小麦与4种近缘属间禾草不对称体细胞杂交杂种再
生植株[ 1~ 3] ,并发现融合中双亲再生能力互补及杂
种优先生长的现象。然而 ,上述双亲皆来源于同一
亚族内亲缘较近的属间品种 ,小麦与其不同族的远
缘植物属间体细胞杂交尚未见报道 ,这问题无论在
理论上或育种实践上都很值得研究 。无芒雀麦在分
类上属孤茅族 、雀麦亚族 、雀麦属 ,与小麦分属不同
族 ,具耐寒 、耐旱 、抗病及营养价值高等优良性状[ 4] 。
本研究通过紫外线照射供体的不对称融合方法[ 2] ,
获得了小麦与无芒雀麦的体细胞杂种白化苗。
1 材料和方法
1.1 双亲原生质体的来源
用普通小麦(Triticum aestivum L.)99P 幼胚诱导
愈伤组织 ,经继代和选择培养筛选出黄色瘤状结构 ,
此愈伤组织每半个月继代一次 ,两年以后分化频率
国家自然科学基金(39570456)资助。 Supported by the National Natural Science Foundation of China(39570456).
收稿日期:1998-04-10 接受日期:1998-07-30
植 物 学 报 1999 , 41(5):458~ 462
Acta Botanica Sinica
很低(3%左右)。分离其原生质体[ 5] ,作为融合受
体。
无芒雀麦(Bromus inermis Leyss)幼胚来源的致
密瘤状愈伤组织继代一年左右 ,也仅具很低的分化
频率(约 5%),用于游离原生质体 ,方法同小麦[ 5] 。
分离的原生质体经纯化后悬浮于洗液(0.6 mol/L 甘
露醇+5 mmol/L CaCl2)中 ,取直径为 3.5 cm的培养
皿放入约 0.2 mL 悬浮液 ,在皿底成一薄层 ,用强度
为300 μW/cm2 的紫外线照射 30 s 、1 min 、2 min后作
为融合供体。
1.2 原生质体的融合和培养
将供体与受体以 1×106/mL 密度按 1∶2的体积
比混合均匀 ,用 PEG法(同文献[ 6])诱导融合 ,以培
养单独的双亲原生质体及混合的双亲原生质体作对
照。融合物与对照皆用 P5 培养基[ 7]浅层培养 。融
合组合为:A.小麦原生质体+紫外线照射 30 s的无
芒雀麦原生质体;B.小麦原生质体+紫外线照射 1
min的无芒雀麦原生质体;C.小麦原生质体+紫外
线照射2 min的无芒雀麦原生质体 。
当融合处理及对照培养物再生的小愈伤组织长
到1.0 ~ 1.5 mm 大小时 ,转至含 0.5 mg/L 2 ,4-D的
MB培养基[ 7] 上增殖 ,以后转至含 0.5 mg/L IAA+
0.5 mg/L zeatin的MB培养基上分化 。
1.3 杂种愈伤组织及白化苗的鉴定
(1)染色体分析:将再生的愈伤组织和 No.1细
胞系再生的白化苗叶基用去壁低渗火焰干燥法[ 8]制
片 ,同时观察继代 1个月 、6 个月 、12个月的不同细
胞系染色体变化 。(2)同工酶分析:取以上愈伤组织
或白化苗叶片制样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳[ 9] ,分
析其酯酶同工酶和过氧化物同工酶 。(3)RAPD 分
析:取亲本和融合再生愈伤组织或白化苗叶片各
100 mg , CTAB 法提取和纯化 DNA 。PCR 反应条件
为:20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),3 mmol/L MgCl2 ,50
mmol/L KCl , 250 μmol/L核苷酸(dATP 、dGTP 、dCTP 、
dTTP), 15 ng 随机引物(10 mer operon primer ,美国
Operon公司),50 ng 样品 DNA ,1 U Taq DNA聚合酶
(Promega),总体积定为 15 μL。温度循环:95 ℃×5
min ,35 ℃×2 min ,72 ℃×3 min ,一次循环;94 ℃×
10 s ,38 ℃×10 s ,72 ℃×50 s ,共 42次循环;最后在
72 ℃保温 5 s。PCR仪为SX-24OC 型(西安顺达电子
有限公司)。扩增产物在 1×TBE 缓冲液 、1%琼脂
糖凝胶中电泳 , EB染色 ,紫外灯下观察照相 。杂种
DNA的每一双亲特征谱带及新带作为一个特异位
点。
2 结果和分析
2.1 小麦与无芒雀麦原生质体的融合与培养
刚游离的无芒雀麦原生质体内富含淀粉颗粒 ,
而小麦原生质体胞质浓而透明 ,内含物较少 ,异质融
合细胞容易识别 。经 PEG 处理并培养 1 d后 ,可观
察到胞间界限消失了的融合体 。在各融合组合中 ,
融合细胞生长发育状况差异明显。A 组融合中 ,融
合培养物在培养第 5 d左右出现第一次分裂 ,20 d
左右出现大量小细胞团 ,但直至 30 d 左右仅形成 3
块直径 1.0 ~ 1.5 mm结构致密的单细胞克隆 ,其余
为只长大至直径 0.2 ~ 0.5 mm 左右的粉粒物。B 、C
组合中 ,仅有少量直径 0.2mm以下结构松散的细胞
团形成。A 、B 、C 中松散的细胞团在以后的液体培
养基中虽能增殖 ,但体积未能进一步长大。40 d左
右从组合A中挑取上述 3块单细胞克隆再生的愈伤
组织(按其生长速率大小编号为 No.1 ~ No.3)转至
固体培养基上进行增殖 。增殖后的 3个细胞系经分
化培养 2个月左右 ,由No.1细胞系分化出 6株高度
约 5 ~ 6 cm及少量 1 ~ 2 cm的白化苗(图版 Ⅰ , 1),
No.2细胞系分化出少量 1 cm 左右的白化苗 ,No.3
仅分化出白化小芽 。
对照小麦原生质体在培养 3 ~ 4 d后即出现 1
次分裂 ,以后形成大量小愈伤组织 ,但没有出苗 。无
芒雀麦原生质体不能分裂 ,混合双亲的原生质体可
形成大量的愈伤组织 ,其外观与小麦的愈伤组织相
似 ,亦未分化植株 。
2.2 杂种愈伤组织的鉴定
2.2.1 表型比较 小麦原生质体再生的愈伤组织
多为黄色 ,颗粒小 ,较松散。无芒雀麦原生质体不分
裂 ,用来游离无芒雀麦原生质体的愈伤组织为浅黄
色致密瘤状结构 ,颗粒较大。No.1和 No.2细胞系
均形成黄色致密瘤状愈伤组织;No.3为浅黄色颗粒
状愈伤组织;外型均介于亲本之间。
2.2.2 染色体分析 参见表 1。对照小麦原生质
体再生愈伤组织的染色体数目 99%以上在 30 ~ 38
之间 ,极个别为 42 ,含断片的细胞极少(表 1)。无芒
雀麦的染色体正常数目为 2n=28(图版 Ⅰ ,2),有 8
条较小的染色体 ,它们比小麦染色体小 ,在融合细胞
中可以明显区分。其愈伤组织在继代培养中染色体
数目变异范围较大 ,本实验所用继代一年的愈伤组
织染色体数目最少为 24条 ,最多为 72条 , 68%的细
胞为26 ~ 42 ,含染色体断片的细胞比例很低(表 4)。
融合再生的No.1和No.2细胞系的染色体数目明显
5 期 向凤宁等:普通小麦与无芒雀麦不对称体细胞杂交的研究 459 
多于双亲 , 多数细胞为 56 ~ 68 和 54 ~ 64 , 平均为
61.1和 60.2。No.3染色体数目较少 ,多数细胞只有
22 ~ 30 ,平均为 25.1。3个细胞系均含有无芒雀麦
较小的染色体和高频率地出现染色体断片(图版 Ⅰ ,
3 ~ 5;表1),表明无芒雀麦的遗传物质已导入小麦
细胞中 。
表 1 融合产物染色体 、同工酶分析及分化情况
Table 1 Analysis of chromosome , isozyme and differentiation of fusion products
No.of cell clone
Number of chromosomes Isozyme
Average±SD No.of fragments  Range of chro-
mosome No. Esterase Peroxidase
Differentiation
No.1 61.1±15.1 1~ 3 46~ 72 C , N C ,N Albino
No.2 60.2±13.5 1~ 4 36~ 72 C , N C ,N Smaller albino
No.3 25.1±9.1 1~ 3 19~ 30 C C White shoot
Wheat 35.1±2.1 0~ 1 33~ 38 B B Low frequency
Bromus inermis 28.1±4.8 1~ 2 24~ 72 T T Low frequency
C.Characteri stic band(s)of parents;N.New band(s);B.Bands of Bromus inermis;T.Bands of wheat.
2.2.3 同工酶分析 No.1 ~ No.3细胞系酯酶同工
酶和过氧化物同工酶分析的结果见表 1。图版 Ⅰ图
6为 3个细胞系的酯酶同工酶谱 ,它们均出现双亲
的特征谱带 ,No.1 ~ No.3出现了新带。证明了 3个
细胞系均含有双亲基因组 。
2.2.4 RAPD分析 对No.1 ~ No.3细胞系及双亲
做随机扩增多态 DNA(RAPD)分析。选用的OPJ-12 、
OPJ-20 、OPA-01 ~ OPA-20 、OPG-01 ~ OPG-03共 25 种
随机引物中 ,有 10个随机引物扩增出多态特异性片
段 ,多态位点在 4 ~ 6之间。各引物序列及其扩增的
多态特异位点数见表 2 ,从分子水平上证实了 3 个
细胞系中双亲 DNA的存在及重组。
综合以上分析可以确证所获得的 3个愈伤组织
均是杂种 。
表 2 产生 RAPD标记的随机引物序列及多态位点扩增数目
Table 2 Sequences of primer resulting in RAPD marker and the
numbers of polymorphic bands
Primer
5′—3′
sequences
Numbers of polymorphic
characteristi c bands
OPJ-12 GTCCCGTGGT 6
OPJ-20 AAGCGGCCTC 6
OPA-02 TGCCGAGCTG 4
OPA-03 AGTCAGCCAC 4
OPA-04 AATCGGGCTG 4
OPA-06 GGTCCCTGAC 3
OPA-13 CAGCACCCAC 5
OPA-18 AGGTGACCGT 4
OPA-19 CAAACGTCGG 4
OPF-12 ACGGTACCAG 5
2.3 杂种白化苗的鉴定
对No.1细胞系再生的白化苗进行同工酶 、染色
体及 RAPD分析(表 3)。No.2细胞系分化出的白化
苗未能长大 , No.3 仅分化出小芽 , 因此未作分析。
No.1白化苗的酯酶同工酶(图版 Ⅰ , 7)和过氧化物
同工酶及 RAPD电泳谱带(图版Ⅰ ,8)均含有双亲特
征带及新带 。观察的白化苗叶基染色体数目为 42
~ 54 ,均具有无芒雀麦较小的染色体及 1 ~ 2个染色
体断片(图版 Ⅰ ,9),并发现明显的染色体易位 ,出现
多着丝粒染色体(图版 Ⅰ ,9)。亦表明由 No.1细胞
系再生的白化苗为小麦与无芒雀麦的体细胞杂种。
2.4 融合细胞系在继代过程中的染色体变化
在不同继代时间内 ,No.1 ~ No.3细胞系及双亲
愈伤组织细胞的染色体数目变化见表 4。结果表
明 ,随着继代时间的延长 ,No.1和No.2染色体数目
略变少 ,其变异幅度也逐渐变小 ,No.3染色体数目
略有增加 ,但其变异幅度逐渐变小。双亲中 ,无芒雀
麦变异幅度明显大于小麦。可看出杂种细胞系染色
体数目在继代过程中变化不大 ,渐趋稳定 。
杂种愈伤组织在继代过程出现一些染色体结构
变异 ,这些结构变异可在各培养时期的融合细胞中
出现。其中以染色体粘连较多。在继代培养 1个月
的No.1和No.2细胞系中出现较高频率(26.5%和
28.7%)的染色体粘集(图版 Ⅰ , 10),由十几至二十
几条染色体粘集在一起。继代一年后 ,其频率明显
下降(No.1为 11.6%, No.2为 13.4%)。在No.3中
未见到该现象。
460  植   物   学   报 41 卷
表 3 白化苗的同工酶 、染色体及 RAPD分析
Table 3 Isozyme , chromosome and RAPD analysis of albino seedling
Hybrid and control Numbers of chromosome Numbers of fragments Esterase Peroxidase RAPD
Albino of No.1 clone 42~ 54 1~ 2 C , N C ,N C
Plants of Bromus inermis 28 0 B B B
Plants of wheat 42 0 T T T
C , N , B ,T are the same as in Table 1.
表 4 不同继代时间中 No.1~ No.3 细胞系的染色体分析
Table 4 Analysis of chromosome(chr.)in different time of subculture
No.of calli Subculture
time(month) Cell numbers
Numbers of chr.
Average±SD C.V.% Range
Cell numbers and frequency
with chr.fragment
Numbers of chr.
fragment
1 68 61.1±15.1 24.7 46~ 72 40 42.1 1~ 3
No.1 6 100 59.0±11.6 19.7 40~ 72 36 36.0 1~ 3
12 100 58.4±9.8 16.7 46~ 48 32 32.0 1~ 3
1 54 60.2±13.5 22.5 36~ 72 22 40.7 1~ 4
No.2 6 65 58.5±11.7 19.9 34~ 74 26 40.1 1~ 4
12 72 57.0±10.7 18.8 37~ 66 24 33.3 1~ 3
1 49 25.1±9.1 36.2 19~ 30 21 42.8 1~ 3
No.3 6 60 27.6±8.4 30.6 17~ 35 25 41.7 1~ 3
12 70 30.8±6.6 21.8 24~ 64 24 34.3 1~ 3
1 60 35.1±2.1 6.0 33~ 38 1 1.7 0~ 1
Wheat 6 100 33.0±2.4 7.4 28~ 39 2 2 0~ 1
12 100 30.3±3.7 12.2 22~ 38 3 3.3 0~ 1
12 45 28.1±4.8 17.1 24~ 72 1 2.2 1±2
Bromus inermis 18 60 33.3±8.2 24.6 24~ 56 2 3.3 1±2
24 80 35.9±9.4 26.5 28~ 72 2 2.5 1±2
3 讨论
3.1 杂种细胞系在继代过程中的染色体变化
为了探讨杂种细胞的遗传物质在继代培养过程
中的稳定性 ,对染色体及其断片做了观察。在杂种
愈伤组织中常见到一些染色体结构变异 ,其中以染
色体粘连较多 ,由十几至二十几条染色体互相粘集
在一起(图版 Ⅰ , 10)。此种染色体粘连的现象在远
缘体细胞杂交中并非罕见 ,在大豆与粉兰烟草杂种
细胞中 ,烟草染色体有一种互相粘连在一起的倾
向[ 10] 。对比之下在近缘属间的体细胞杂交中则较
少见 。例如在小麦与 4种近缘属间禾草体细胞杂交
中未见到此现象[ 1~ 3] 。这种因亲缘关系而异的染色
体变异现象尚待以后更多的工作来分析 。本实验中
这种染色体粘连的出现随着培养物继代时间的延长
而逐渐减少;在继代一个月时出现频率平均为
27.6%至一年后下降为 12.5%,这种下降可解释为
双亲的染色体在继代过程中进行了重建 ,使得双亲
的染色体行为同步[ 10] 。
至于杂种细胞中的染色体断片 ,在继代 1个月
期间出现频率(出现断片的细胞/观察的细胞总数)
达40%左右 , 半年内下降很少 , 到一年时才降到
32.0%~ 34.3%(表 4),看来存在于杂种愈伤组织中
的染色体断片在继代一年中还是相对地稳定。它们
得以较长时间保留的原因可能是含有端粒或着丝
点 ,从而靠自身的分裂而保留下来 ,并且以后还可随
着愈伤组织的分化进入杂种植株中。由于供体断片
的存在或与受体染色体整合 ,才使得与断片相关的
性状导入杂种中 ,所以断片在杂种细胞中存在的问
题无论在理论或实践上都很重要 ,但研究尚不多 。
3.2 融合中双亲再生能力的互补
上面已经提及本实验所用双亲材料分化能力都
很低 ,并且作为融合对照的双亲分别或混合培养都
不能获得再生植株 ,而融合产物却仍分化出一定数
量的植株来 。这事实说明小麦的远缘体细胞杂交中
也同样存在再生能力互补的效应 。
3.3 杂种优先生长的效应
我们在小麦与 4种近缘属间禾草的体细胞杂交
中发现:融合克隆的生长速度大于未融合的双亲 ,故
融合产物中早期形成的克隆多属于杂种。此效应与
再生能力互补效应一样都能起到对杂种筛选的作
用 。这种可以省去用碘乙酰胺(IOA)失活受体来筛
选杂种的策略[ 11] ,避免了因 IOA对小麦原生质体的
损伤而引起的杂种生活力及再生能力下降[ 1] 。在小
5 期 向凤宁等:普通小麦与无芒雀麦不对称体细胞杂交的研究 461 
麦与新麦草及小麦与高冰草的体细胞融合中 ,利用
这种 “杂种优先生长”来筛选体细胞杂种获得成
功[ 2] ,本实验从紫外线剂量最小的处理得到了 3个
能继续长大的单细胞克隆 ,经鉴定均为杂种。因此 ,
杂种的优先生长现象在小麦体细胞杂交中普遍存
在 ,为其提供了简便有效的筛选方法。
3.4 白化苗的产生
本实验虽然获得一定数量的杂种植株 ,但它们
都是白化苗 ,其原因可能与两亲本亲缘关系较远(族
间)有关。此外 ,本实验对两亲本愈伤组织分化能力
测定时均发现有少数白化苗出现 ,因此也不能排除
双亲本身的叶绿体缺失细胞的基因进入杂种细胞中
导致杂种白化苗的形成 。另外 Hall等[ 12] 的工作表
明:紫外照射引起DNA损伤的程度远高于离子射线
(ionizing rays),如 X 射线。在小麦与紫外线照射的
高冰草的不对称融合中亦发现有杂种白化苗出
现[ 2] 。本实验中白化苗的产生是否与紫外线有关 ?
以上问题均需进一步研究 。
参 考 文 献
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图 版 说 明
图版Ⅰ  1.杂种细胞系 No.1 再生的白化苗。2.无芒雀麦
愈伤组织染色体 , 2n=28。↑.较小染色体。3.杂种 No.1
愈伤组织染色体 , 2n=54 , ↑.染色体断片 , SC.较小染色
体。4.杂种 No.2 愈伤组织染色体 , 2n=47 , ↑.染色体断
片 , .双着丝粒染色体 , SC.较小染色体。5.No.3 愈伤组
织染色体 , 2n=30 , ↑.染色体断片 , SC.较小染色体。6.
No.1 ~ No.3 细胞系酯酶同工酶谱带 , ↑.双亲特征带及新
带。7.杂种 No.1 愈伤组织再生的白化苗酯酶同工酶谱带 ,
↑.双亲特征带及新带。8.杂种 No.1 愈伤组织再生的白化
苗 RAPD谱带 , ↑.双亲特征带及新带 。9.杂种 No.1 愈伤
组织再生的白化苗叶基染色体 , 2n=53 , ↑.染色体断片;
.双着丝粒染色体 , SC.较小染色体。10.No.1 杂种细胞
系染色体发生粘连 , ↑.粘连。
Explanation of Plate
Plate Ⅰ  Fig.1.Albino from hybrid No.1 clone.Fig.2.Chromo-
somes of Bromus inermis Leyss calli , 2n=28 , ↑.Smaller chromo-
some.Fig.3.Chromosomes of hybrid No.1 calli , 2n =54 , ↑.
Chromosome fragment , SC.Smaller chromosome.Fig.4.Chromo-
somes of hybrid No.2 calli , 2n=47 , ↑.Chromosome fragment ,
SC.Smaller chromosome , .dicentrio chromosome.Fig.5.Chro-
mosomes of hybrid No.3 calli , 2n =30 , ↑.Chromosome frag-
ment;SC.Smaller chromosome.Fig.6.Isozyme pattern of No.1 ~
No.3 clone , ↑.Characteristic bands of both parents and new
band(s).Fig.7.Esterase isozyme pattern of albino from No.1
clone , ↑.Characteristic bands of both parents and new band(s).
Fig.8.RAPD pattern of albino from No.1 clone , ↑.Characteristic
bands of both parents and new band(s).Fig.9.Chromosomes of
leaf base of albino from No.1 clone , 2n =53 , ↑.Chromosome
fragment , SC.Smaller chromosome , .Dicentrio chromosome.
Fig.10.Chromosome coherence of No.1 clone , ↑.Chromosome
coherence.
462  植   物   学   报 41 卷