全 文 ：收稿日期:2012 － 04 － 27
作者简介:黄洪云(1979 －) ，女，讲师，主要从事生物物理研究;E-mail:
lzyhhy0922@ 163． com。
离子束介导大豆球蛋白基因转化无芒雀麦
黄洪云
(唐山学院基础教学部， 河北 唐山 063000)
摘要:饲草品质在很大程度上决定和影响着动物的生产性能，表现在影响乳品、肉品和毛的质量与产量方面。因而可以
通过改善牧草营养品质来提高动物的生产性能，而饲草品质的改善可以利用转基因技术。本研究在活体组织离子注入
后可以存活的前提下，确定离子束介导无芒雀麦愈伤组织的转化剂量范围是 2． 6 × 1015、5． 2 × 1015、7． 8 × 1015 Ar + /cm2，
然后通过实际的转化实验确定最佳转化剂量为 5． 2 × 1015Ar + /cm2。在此剂量注入后将 GUS基因和构建好的植物表达
载体 pBI 121 /Gy 3 转入无芒雀麦的愈伤组织，并将大豆球蛋白基因 Gy 3 cDNA导入牧草无芒雀麦以使其成为高蛋白含
量的优质抗旱牧草，从而为我国畜牧业的发展做出贡献。
关键词: 球蛋白 Gy 3 基因;离子束;转化;无芒雀麦
中图分类号: S 565． 1 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2012)08-0010-05
Transforming Glycinin Gy 3 Gene into Bromus inermis Mediated by Ion Beam
HUANG Hong-yun
(Department of Tangshan College，Tangshan Hebei 063000，China)
Abstract:The animal productive performance are decided by the quality of the pasture，so we can improve its
quality by transforming gene． We studied how to avoid frostbite to the callus of Bromus inermis during ion beam
implantation，and found the suitable transformation dose are 2． 6 × 1015，5． 2 × 1015，7． 8 × 1015 Ar + /cm2，the
best dose is 5． 2 × 1015Ar + /cm2 ． At the same time we constructed expression vector PBI 121 /Gy 3，finally we
got the transformation．
Key words: glycinin Gy 3 gene;ion beam;transformation;smooth bromegrass
无芒雀麦(Bromus inermis)又名禾萱草，隶属于禾
本科、早熟禾亚科、雀麦族的雀麦属［1］，该牧草具有营
养价值高、产量高、适口性好、利用季节长、耐严寒、耐
干旱、适应性强、干草产量要比一般的冷季型禾草高等
特征，是一种优良牧草，可用作干草、放牧、青贮等。由
于其地下根茎发达，因此也是固沙的先锋植物［2］。
近年来，随着中国农村产业结构的调整和生态环
境的治理，无芒雀麦的人工种植面积不断扩大，对无芒
雀麦种子的需求也呈上升趋势，因此进行品质改良已
迫在眉睫。目前，大都采用基因工程手段进行品质改
良工作，而成功的植物基因转化需要好的植物组织培
养和再生体系，可是禾本科牧草的组织培养再生相对
较难，若辅以离子处理也许会有较好的效果 。
大豆种子中含有丰富的蛋白质，其贮藏蛋白的含
量远远高于其他作物，占种子干重的 40%以上，是人
类食物和动物养殖的主要植物蛋白来源。基因工程技
术扩增和改造大豆蛋白质基因，并转化到其它作物中，
在改良作物品质方面具有重要的应用价值。美国国际
植物研究所的科学家们从大豆获取蛋白质合成基因，
成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其
蛋白质含量接近大豆，大大提高了营养价值。日本学
者 Hirano等［3］从大豆种子中克隆了碱性 7 S球蛋白基
因，构建了含该目的基因的植物表达载体和工程农杆
菌，并对烟草进行遗传转化，得到了转基因烟草。
Katsube等［4］首次报道了，将大豆球蛋白基因 Gy 3
cDNA与水稻谷蛋白基因 GluB-1 启动子构成融合基因
导入水稻，研究发现，大豆球蛋白可以在水稻胚乳中合
成，形成六聚体高级结构，并与水稻谷蛋白共同定位在
蛋白体Ⅱ中。楼程富等［5］在构建含大豆蛋白 A1 a B1 b
亚基基因的植物表述载体和工程农杆菌的基础上，以
桑叶为材料，利用农杆菌介导法进行遗传转化并获得
了转基因植株。目前，利用大豆球蛋白基因改良植物
品质的研究中，大豆的 Gy 3 亚基是应用最为广泛的一
个，但是将此蛋白基因转入牧草的研究尚未见报道，因
此以大豆球蛋白 Gy 3 为目的基因，改良无芒雀麦这种
禾本科植物的营养品质，以提高饲用牧草的营养价值。
·01·
第 31 卷 第 8 期 2012 年 8 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 8 Aug． 2012
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2012.08.047
1 材料与方法
1． 1 材 料
供试材料无芒雀麦成熟种子，由宁夏绿洲草业有
限公司提供。种子产于宁夏。大豆球蛋白 A1 a B1 b亚
基基因(pBI 121 /Gy 3)和 pMD 19-T /Gy 3 由自己实验
构建并保存;大肠杆菌菌株 DH 5 α为内蒙古大学基因
工程实验室保存;PBI 121 质粒载体由山东大学李静馈
赠，且此种质粒在大肠杆菌 DH 5 α中扩增。
1． 2 方 法
1． 2． 1 无芒雀麦愈伤组织培养
剥取成熟的种子，用 70%乙醇消毒 30 s，用无菌水
洗 3 ～ 4 次，再以 0． 1%升汞(HgCl2)消毒 10 ～ 15 min，
再用无菌水洗 3 ～ 4 次。然后接种于诱导培养基上
(MS基本培养基 + 2，4-D 2． 0 mg /L + 6-BA 1． 5 mg /L
pH =5． 8) ，置于 25 ～ 28 ℃条件下暗培养，培养7 ～ 14 d
后移入愈伤继代培养基(MS 基本培养基 + 2，4-D 1． 5
mg /L + 6-BA 0． 5 mg /L pH =5． 8)。
1． 2． 2 无芒雀麦愈伤组织的抗冻性
选用甘油作为真空保护剂，设置 8 个浓度梯度:
10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，121 ℃
高压灭菌 20 min，以无菌蒸馏水浸泡处理愈伤组织作
为空白对照。愈伤组织活力测定采用 TTC 法(氯化三
苯基四氮唑还原法)［6］。
1． 2． 3 质粒 DNA的扩增、提取和纯化
参照《分子克隆实验指南》［7］，用碱法大量提取质
粒 DNA，用紫外分光光度仪测定 OD260 /OD280 = 1． 8 ±
0． 02，计算浓度后，以 200 μg /mL溶解于 0． 1 × SSC(15
mM NaCl，1． 5 mM柠檬酸钠，pH =7． 0)缓冲液中备用。
1． 2． 4 离子束注入处理
按照文献［8］中以愈伤组织正常增重作为愈伤组
织成活的初步，以能量为 20 keV，剂量分别为 50、100、
200、300、400、500 的 Ar +注入经甘油处理后的愈伤组
织。在介导转基因实验中，离子束处理完成后立即将
愈伤组织浸入含有质粒 DNA(200 μg /mL)和 0． 1 ×
SSC导入介质中，于 26 ℃温育 8 ～ 12 h，取出愈伤组织
用0． 1 × SSC溶液反复冲洗 3 次，用无菌滤纸吸干残存
溶液，接种于 MS诱导愈伤培养基上(记作处理 T)。
1． 2． 5 转化处理
选用 20 keV，剂量分别为 2． 6 × 1015、5． 2 × 1015、
7． 8 × 1015 Ar + /cm2 对生长 7 d 的愈伤组织进行注入，
注入前愈伤组织用 50%的甘油进行抗冻处理，注入后
将愈伤组织立即放入无菌水中于摇床上缓慢振摇
10 min，使组织复水并洗去表面的保护剂，然后浸泡于
质粒 DNA溶液中温育 12 h，经组织化学染色检测 GUS
基因的瞬间表达情况，或进行抗性筛选。同时设两个
对照，一个是愈伤组织接受和处理相同的离子束处理
后，浸于不含质粒 DNA的导入介质中温育，记为 ck 1;
另一个对照是愈伤组织放置于离子束注入环境中，但
不接受离子注入处理，同样浸入含质粒 DNA导入介质
中温育，记为 ck 2，其它操作均和处理相同。
1． 2． 6 抗性愈伤组织的筛选培养
取相同生长状态的新鲜愈伤组织，移入浓度分别
为 0、20、40、60、80、100 mg /mL的卡那霉素的愈伤继代
培养基上，记录愈伤组织的初始重量 W0，培养 21 d 后
记录重量 W1，计算愈伤重量增长率 r =(W1-W0)/W0，
以抗生素为零的愈伤重量增长率 r0 为对照，计算其他
浓度条件下愈伤相对重量增长率 R = r / r0。本实验每
个浓度处理愈伤组织 20 瓶(每瓶 5 个愈伤组织) ，实
验数据为 5 次重复的平均值。
1． 2． 7 GUS组织化学染色分析
参照 Jefferson等［9］的方法进行。
1． 2． 8 转化体的 PCR检测
分别提取未转入外源基因的无芒雀麦愈伤组织和
叶片的基因组 DNA，然后用已设计的特异性引物上游
引物(5-tctaga AACACTCATCAGTCATCACC-3) ，下游
引物(5-ggatcc CTAAGCCACAGCTCTCTTC-3) ，进行
PCR反应，以此两 PCR 产物为阴性对照，用已克隆的
大豆球蛋白 Gy 3 亚基的 cDNA序列做阳性对照，按照
博大泰克基因组小提试剂盒提取培养基上筛选出的抗
性愈伤组织的基因组 DNA进行同样的 PCR反应。
1． 2． 9 转化体的 RT-PCR检测
分别提取未转入外源基因的无芒雀麦愈伤组织和
PCR检测成功愈伤组织的总 RNA，然后用已合成的特
异性引物和已摸索出的最佳反应条件进行 RT-PCR反
应。以未转化愈伤组织总 RNA 的 RT-PCR 产物为阴
性对照，用已克隆的大豆球蛋白 Gy 3 亚基的 cDNA 序
列做阳性对照，按宝生物公司的植物总 RNA提取试剂
盒和 RT-PCR试剂盒进行实验操作。
2 实验结果
2． 1 质粒中量提取结果
中量提取质粒电泳结果如图 1 所示。
2． 2 质粒 pBI 121 转化实验结果
离子注入对转化受体细胞造成一定的刻蚀，刻蚀
的程度能够影响转化的效率，因此考察了不同的注入
剂量对 GUS 基因瞬间表达率的影响。结果如表 1
所示:
·11·
研究报告 黄洪云:离子束介导大豆球蛋白基因转化无芒雀麦
a．对照 ck 1;b．对照 ck 2;c．离子注入处理
图 2 GUS染色结果
1:已鉴定的连接产物 pBI 121 /Gy 3;
2、3、4、5、6:中量提取的质粒 pBI 121 /Gy 3
图 1 (目的片段与表达载体已连接)质粒中量提取
表 1 不同的注入剂量对 GUS瞬间表达率的影响
剂量
(× 1015Ar + /cm2)
愈伤组织
块数
染色后显蓝色
愈伤组织块数
瞬间表达率
(%)
2． 6 100 32 32
5． 2 100 43 43
7． 8 100 47 47
从表 1 可以看出，随着剂量的增加，GUS基因的瞬
间表达率逐渐升高，但是考虑到剂量为 7． 8 × 1015Ar + /
cm2 时，愈伤组织的存活相对较低，因此转化过程中，
选用 5． 2 × 1015 Ar + /cm2 的剂量进行注入。GUS 基因
在愈伤组织中的瞬间表达结果如图 2 所示。
2． 3 质粒 pBI 121 /Gy 3 转化实验结果
2． 3． 1 抗生素敏感性实验结果
相同生长状态的新鲜愈伤组织，在浓度分别为 0、
20、40、60、80、100 mg /mL的卡那霉素的愈伤继代培养
基上，愈伤相对重量增长率如图 3 所示，在 Kan 为 20
mg /L 的培养基上，它们的愈伤相对重量增长率在
70% ～80%之间，40 mg /L 的培养基上，愈伤相对增长
率都少于 40%，当 Kan 浓度为 80 mg /L 时，才能完全
抑制其愈伤组织的生长。
转化操作完成后，处理及 2 个对照的愈伤组织接
种于愈伤诱导培养基上预培养 4 ～ 6 d 后，移到浓度为
100 mg /mL Kan的 MS继代筛选培养基上筛选 3 ～ 4 代
(14 d /代) ，将产生的 Kan抗性愈伤组织移入诱导培养
基，继 3 代(28 ～ 42 d)愈伤组织正常存活，则认为是转
化体，可继续进行检测。
图 3 愈伤组织对抗菌素的敏感性
M:Marker(λ-HindⅢ)1:叶片基因组;
2:愈伤组织;3、4、5:抗性愈伤组织。
图 4 基因组 DNA
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第 31 卷 第 8 期 2012 年 8 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 8 Aug． 2012
2． 3． 2 转化体的 PCR检测结果
按照博大泰克基因组小提试剂盒提取培养基上筛
选出的抗性愈伤组织和无芒雀麦叶片的基因组 DNA
(图 4)进行同样的 PCR反应，得到的 PCR检测结果如
图 5 所示。
M:Marker(λDNA /EcoRⅠ + Hind Ⅲ marker)
1、2:阴性对照;3:阳性对照;4、5、6、7、8:转化体。
图 5 PCR检测结果
1:对照愈伤组织总 RNA;
2、3、4:转化愈伤组织总 RNA。
图 6 愈伤组织总 RNA琼脂糖凝胶电泳
M:Marker(λ-Hind Ⅲ)1:阴性对照;
2:阳性对照;3、4、5:转化体。
图 7 RT-PCR检测结果
2． 3． 3 转化体的 RT-PCR检测结果
按宝生物公司的植物总 RNA 提取试剂盒和
RT-PCR试剂盒进行实验操作。总 RNA 的提取和
RT-PCR检测结果如图 6、7 所示。
3 讨 论
用相对比较理想的惰性 Ar +摸索到合适的注入剂
量范围，GUS 基因在愈伤组织中的成功表达，表明本
实验所采用的转化条件可以有效地将外源基因导入无
芒雀麦愈伤组织，实现转化。通过比较实际转化实验
中瞬间表达率随剂量增加的差异，选定最佳的转化剂
量为 5． 2 × 1015Ar + /cm2。
研究了不同浓度的抗生素对愈伤组织重量增长率
的影响，确定了合适的抗生素筛选浓度，在转化实验中
对照组愈伤组织未能存活，说明建立的抗生素筛选体
系是有效的。在上述工作的基础上，从离子束介导转
基因必备的几个关键步骤入手，确立了与介导转化有
关的几个重要参数，即选用 20 keV 为介导转基因的注
入能量，注入剂量选用 5． 2 × 1015 Ar + /cm2。5 组筛选
出的愈伤组织有 3 组(电泳结果中的泳道 4、5、8)扩增
出与阳性对照(泳道 3)相同的 1 520 bp Gy 3 亚基的
cDNA基因片段，而其余 2 组(泳道 6、7)和阴性对照
(泳道 1、2)均未能扩增出预期大小的片段。PCR鉴定
结果显示，选用 Ar +为注入离子，已将克隆的大豆 Gy 3
亚基基因已成功转入无芒雀麦愈伤组织。进行的
RT-PCR检测进一步证实了以上结论是正确的。研究
结果表明，离子束介导愈伤组织转基因是可行的。低
能离子束介导的愈伤组织转化的转化效率与离子注入
能量、剂量、离子种类等参数有关，有效的组织培养体
系和阳性转化个体筛选体系是转化成功的前提。然而
本研究还需继续深入，要通过优化注入条件和改进组
织培养技术来稳定和进一步提高转化效率。
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研究报告 黄洪云:离子束介导大豆球蛋白基因转化无芒雀麦
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收稿日期:2012 － 04 － 25
基金项目:内蒙古草品种育繁工程技术研究中心提升项目。
作者简介:王 勇(1976 －) ，男，内蒙古呼伦贝尔市人;硕士，主要从事
牧草种质资源、遗传育种科研及教学工作;E-mail:wy972002
@ 163． com。
不同贮藏年限老芒麦种子活力研究
王 勇1， 徐春波2， 韩 磊1
(1．内蒙古农业大学生态环境学院， 呼和浩特 010019;
2．中国农业科学院草原研究所， 内蒙古 呼和浩特 010010)
摘要:以内蒙古农业大学牧草试验站收获的老芒麦种子为材料，研究在常温条件下贮藏 1 ～ 7 年老芒麦种子活力的变化
规律。结果表明:在自然条件下贮藏，老芒麦种子的活力下降较快，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数随贮藏年限的增
加呈下降趋势。贮藏超过 6 年的种子活力极大丧失;生理指标测试显示，种子浸出液电导率随贮藏年限增加而升高、过
氧化物酶及 TTC含量则降低，种子葡萄糖含量与贮藏年限之间不存在必然的变化规律。
关键词: 老芒麦;种子贮藏;种子活力
中图分类号: S 543 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2012)08-0014-04
Studies on Seed Vigor and Physiological Indicators of
Different Storage Duration Elymus sibiricus L．
WANG Yong1，XU Chun-bo2，HAN Lei1
(1． College of Ecology and Environmental Science，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010019，China;
2． Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science，Huhhot 010010，China)
Abstract:The research studied that seed vigor of Elymus sibiricus L． were stored at normal temperatures for
1 － 7 years． The results showed that the seed stored at natural conditions，seed vigor dropped quickly，and ger-
mination rate，germination energy，germination index，vigor index were decreased with the increasing of storage
duration． The seed vigor would be lost enormously if seed was stored over 6 years;The results of physiological
indicators indicated，while the storage duration increased，electric conductivity increased，TTC and peroxides
decreased，There was no obvious rule between sugar content of seed and storage duration．
Key words: Elymus sibiricus L．;seed storage;seed vigor
老芒麦(Elymus sibiricus L．)是禾本科披碱草属多
年生疏丛型草本植物，其特点是适应性强、易栽培管
理、产量高和饲用价值高。老芒麦在中国北方种植面
积在不断扩大，表现出了许多优良特性，是建立人工打
草场的一种很好的栽培草种［1，2］。在 20 世纪 80 年代
和 90 年代分别登记了农牧 1 号老芒麦、吉林老芒麦、
川草 1、2 号老芒麦等优良品种［3 ～ 5］;对老芒麦种子贮
藏过程中的种子活力与生理生化变化研究还较少。老
芒麦作为中国北方地区主要的栽培及生态建设使用草
种之一，具有抗寒、抗旱、耐盐碱、产量高等优良特性，
其种子产量高低和质量优劣受到种子生产者、经营者
和使用者的广泛关注。
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第 31 卷 第 8 期 2012 年 8 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 8 Aug． 2012