全 文 ：　2010年 20(6) 生　物　技　术　
图 6　Hly/pET32a重组质粒图谱
Fig.6　MapoftherecombinantplasmidHly/pET32a
图 7　重组质粒 Hly/pET32a酶切及PCR鉴定
Fig.7　IdentificationofrecombinantplasmidHly/ pET32abydigesting
withrestrictionenzymeandPCRamplification
LaneM:DNAMarkerDL10000;Lane1:Hly/pET32adigestedwithNcoⅠ
andHindⅢ;Lane 2:PCR identificationofrecombinantplasmidHly/
pET32a.
3　讨论
本研究从人胎盘组织中成功地克隆出人溶菌酶基因 , 首
次运用生物信息学方法对人溶菌酶基因编码蛋白进行分析 ,
结果显示其含 130个氨基酸 , 分子量为 14.7kDa, 理论等电点
为 9.28, 其中酸性氨基酸的比例为 8.5%、碱性氨基酸的比例
为 14.6%, 含量最丰富的氨基酸包括 Ala(10.8%)、 Arg
(10.8%)、Asn(7.7%);属于稳定类蛋白;含有一个典型的溶
菌酶超家族保守结构域;二级结构以 α-螺旋 、无规则卷曲 、延
伸链和 β -转角为主要结构元件。在引用生物信息学数据库
时均选择了应用较为广泛的数据库 , 以期能尽量提高预测的
准确率 ,为今后开展人溶菌酶的深入研究和利用提供了一定
的理论参考。
人溶菌酶是人体内源性蛋白 , 和人体具有天然相容性 ,不
会产生免疫原性和副作用 , 同时具有抗菌消炎 、抗病毒 、抗肿
瘤 、提高机体免疫力 、无残留等优越性 , 是一类非常有前景的
抗生素替代品 [ 8] 。如何大量低成本获得这类抗菌活性蛋白以
满足其开发与应用的要求是科学工作者积极探索的问题。目
前 ,抗菌活性蛋白的来源主要有三种。一是直接从生物体分
离纯化 ,但作为应用开发成本太高 , 而且数量极少 , 几乎不可
能。二是根据抗菌蛋白的分子结构 , 采用人工合成的方法合
成但同样也会遇到成本高 、活性低 , 而且合成的蛋白较长时 ,
存在缩合率低 、产率低 、纯化困难 、花费昂贵等一系列问题 [ 9] 。
基因工程领域的飞速发展为抗菌活性蛋白低成本获得提供了
一种可持续方案 , 其核心技术是基因表达技术。利用基因工
程技术生产药物 , 成功的范例很多。早在 1979年 , GoeddelDV
等 [ 10]就用微生物成功生产了重组生长素 , 1982年重组人胰岛
素也在美国上市。通过基因重组技术 , 许多生物活性肽如干
扰素 、生长因子等都大量高效地合成 ,在肿瘤 、乙肝 、神经系统
疾病 、创伤以及艾滋病等治疗领域得到了广泛应用。抗菌蛋
白在基因工 程领域的 应用研 究也取 得了一 定进展 ,
cecropin[ 11] 、melittin[ 12] 、defensin[ 13]等多种肽类抗菌物质都通
过基因重组技术得到了成功表达。本研究将获得的人溶菌酶
基因克隆入原核表达载体 pET32a中 , 成功构建了重组原核表
达质粒。以上工作为人溶菌酶的表达分析和功能研究奠定了
实验基础。
参考文献:
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12个雀麦种的遗传多样性 ISSR分析
宋薇 1 ,于涛 1 ,景文 1 ,田爽 1 ,田青松 2＊ ,韩冰 1(1.内蒙古农业大学生命科学学院 ,内蒙古 呼和浩特 010018;
2.中国农业科学院草原研究所 /农业部草地资源生态重点开放实验室 ,内蒙古 呼和浩特 010010)
摘要:目的:鉴别 12个雀麦种的遗传多样性。方法:利用 ISSR分子标记方法检测 12个雀麦种(共 22份材料)的基因组中每
2个 SSR序列间的 DNA片度长度多态性。结果:19个 ISSR引物共扩增出 109条谱带 , 95条是多态条带 , 多态性位点比率为
29
生　物　技　术 2010年 20(6)　
87.61%。 POPEGEN软件分析显示:22份雀麦材料总的 Neis基因多样性指数为 0.2784, Shannon信息指数为 0.4235, 基因流(Nm)为 0.7928;SLT NTsys2.1e软件对 12个雀麦种进行 UPGMA聚类分析和主坐标分析 , 可分为 11类。对 22份雀麦材料进行
UPGMA聚类分析 ,分为 5个类群 8个小组;Arlequin3.1软件进行 AMOVA分析 , 种间的分子变异比率为 21.74%,种内的分子变
异比率为 78.26%。结论:雀麦在属的水平和种的水平都具有丰富的遗传变异 , 12个雀麦种间的基因交流有限 , 种内变异是雀麦
遗传多样性的主要来源。
关键词:雀麦;种质资源;遗传多样性;ISSR
中图分类号:S543.024　　文献标识码:A　　doi:10.3969 /j.issn.1004-311X.2010.06.186GeneticDiversityAnalysisof12 BromusSpeciesbyISSR
SONGWei1＊ , YUTao1 , JINGWen1＊ , TIANShuang1＊ , TIANQing-song2＊ , HANBing1
(1.BioengineeringCollegeofInnerMongoliaAgriculturalUniversity;2.GrasslandResearchInstitute, ChineseAcademy
ofAgriculturalScience/KeyLaboratoryofGrasslandResources＆Ecology, MinistryofAgriculture, Hohhot010018, China)Abstract:Objective:Investigatethegeneticdiversityof12Bromusspecies.Method:InterSimpleSequenceRepeat(ISSR)wereusedto
investigatetheDNAlengthpolymorphismofgenomicineverytwomicrosatellitesequencesamong12Bromusspecies(including22Bromusmaterials).Result:Atotalof109 bandswereamplifiedby19 ISSRprimerschosenforthestudy.Amongthose95 arepolymorphicbands.Theaveragepercentageofpolymorphicbandswas87.61%.AsanalyzedbythesoftwareofPOPEGEN:thegeneticdiversityof22
BromusmaterialswasthatNeisgenediversityindexof0.2784 andShannonsInformationIndexof0.4237.Thegeneflowwas0.7928;U-singthesoftwareofSLT NTsys2.1e, 12 Bromusspeciesweredividedthe11 groupsbymethodofUPGMAclusteringandprincipalcoordi-
natesanalysis, andforthe22 Bromusmaterialsweredividedthe5 groupsand8 subgroupsbyUPGMAclusteringanalysis;Arlequin3.1softwarewereusedtoanalysisofmolecularvariance(AMOVA)amongandwithin12Bromusspecies, revealingthatmolecularvariationra-tioamongspeciesis21.74% andwithinspeciesis78.26%.Conclusion:ThegeneticvariationofBromuswashighinthegenusandthe
specieslevels.Geneexchangeamongspecieswaslimited.Molecularvariationwasmajorwithinspecies, andwhichwasthesourceofge-neticdiversity.Keywords:Bromus;germplasmresources;geneticdiversity;ISSR
收稿日期:2010-04 -19;修回日期:2010 -10 -19
资助项目:中央级公益性研究院所基本科研业务专项资金(中国农业
科学院草原研究所);中国科学院 “西部之光 ”人才培养项目;内蒙古农
业大学大学生科技创新项目;内蒙古农业大学教学改革项目资助
作者简介:宋薇(1987 -),女 ,呼和浩特市人 , 07级在读本科生 , Email:
songwei0503@qq.com。 ＊通讯作者:田青松(1967 -),男 ,内蒙古扎鲁
特人 ,博士 ,副研究员 ,从事草地资源生态研究, Email:tqingsong@sina.
com。
　　雀麦属植物大约由 160种一年生和多年生的物种组成 ,
在世界各地均有分布 [ 1] 。人们称它为雀麦或雀麦草。雀麦染
色体倍性水平从二倍体到十倍体不等 , 由于染色体的形态学
相似性 , 使得对其基因组的结构 、进化和多样性研究很困
难 [ 2] 。雀麦属的许多形态学特征有别于其他物种:如 , 叶鞘在
生长周期内大部分时间是关闭的;通常芒生于近尖端;子房附
有较多毛状物;花为松散的 , 开放式的圆锥花序 , 通常表现为
下垂的 [ 3] 。除此之外 ,一些雀麦种间具有大量的形态学差异 ,
而有些种间形态学的差异较细微难于区分 , 结果导致了雀麦
属种间分类学较复杂 [ 4] 。通过研究雀麦属内不同种的遗传多
样性将有助于对雀麦属不同种间亲缘关系的了解 , 加快在雀
麦应用和种质资源保护等诸多方面的步伐。
近年来 ISSR分子标记技术广泛用于检测植物种的基因
多样性和遗传关系 [ 5, 6] 。本研究采用 ISSR分子标记技术比较
分析了雀麦材料间和各种间的遗传亲缘关系 , 首次鉴别如此
多雀麦种间材料 ,旨在揭示雀麦种间遗传多样性。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
雀麦材料种植于中国农业科学院草原研究所(沙尔沁牧
草资源野外科学观测试验站),每份材料采集 10个不同植株
的鲜嫩叶片 ,等量混合后置于低温保存 。雀麦材料来源及编
号见表 1。
1.1.2　试剂
2.5mol/LNaCl溶液 、0.2mol/LEDTA溶液 、1mol/LTris-
HCl溶液 、氯仿 /异氯仿(24:1)溶液 、 70%乙醇溶液 、β 巯基乙
醇 、0.5 ×TBE缓冲液 、TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)、
CTAB、琼脂粉。
1.1.3　仪器
Eppendorf5417R低温高速离心机(德国);BiometraPCR
仪(北京华粤公司);BG-power3500型稳压稳流电泳仪(北京
百晶生物技术有限公司);伯乐 BIO-RAD凝胶成像分析系统
(美国)。
表 1　雀麦材料来源
Table1　TheexperimentalmaterialofBromusfororigin
种名
Speciesname
材料编号
MaterialID
材料来源
Materialsources
种名
Speciesname
材料编号
MaterialID
材料来源
Materialsources
无芒雀麦
A10
A41
内蒙古察右中旗
江苏 雀麦
D1
D2
陕西
北京
A50
A56
新疆
波兰
河边雀麦
红雀麦
E1
F1
美国
美国
缘毛雀麦
B5 克什克腾旗 大麦状雀麦 G1 美国
B8 阿尔山市 密丛雀麦 H1 美国
B9 内蒙古农业大学 杂色雀麦 I1 美国
B10 内蒙古草勘院 疏花雀麦 J1 贵州
草地雀麦
C3 美国 硬雀麦 K1 美国
C4 中国农业大学 沙地雀麦 SD 正蓝旗
C5 加拿大
C6 前苏联
1.2　方法
1.2.1　DNA提取
采用 CTAB法提取植物基因组总 DNA, 提取过程重复一
遍用于 DNA纯化。利用紫外分光光度检测总 DNA在 260nm
和 280nm的 OD值 , 根据 OD
260
/OD
280
的值判断其纯度;用
0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳 , 判别 DNA分子的大小和一致
性 [ 7] 。
1.2.2　引物筛选与 PCR扩增
参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)所设计的 ISSR引物序
列 , 选取其中的 62个在上海生物工程技术服务有限公司合
成。选取 4个材料的 DNA样品混合后进行扩增筛选 , 得到 19
条扩增重复性好 、条带清晰的引物(见表 2), 用于全部样本的
扩增。 PCR扩增为 25μl体系:包括 10 ～ 30ngDNA模板;3μl
的 10 ×buffer;4μl的 MgCl
2
(25mmol/L);1.0μl引物 (10
pmol/ml);2μldNTP(2.5mmol/L);0.25μlTaqDNApolymerase
(5U/μl);无菌双蒸水补充体系至 25μl。 PCR扩增程序为;
94℃预变性 10min, 一个循环。 94℃、 1min;52 ～ 59℃、 1min;
72℃、2min;总共 44个循环。 72℃延伸 10min、4℃保存。
1.2.3　PCR产物检测
PCR扩增产物在加入绿色荧光染料的 1.5%琼脂糖凝胶
上电泳分离。电泳结束后在凝胶成像系统下拍照。条带大小
30
　2010年 20(6) 生　物　技　术　
由 DL2000Marker估计。
表 2　雀麦 ISSR扩增反应的引物序列和多态性条带数
Table2　ISSRprimersequencesusedforanalysis, andnumberofpolymor-
phicbandsamplifiedinBromus
引物
Primer
引物序列
Sequence
ofprimer
多态性条带数
No.of
polymorphicbands
引物
Primer
引物序列
Sequence
ofprimer
多态性条带数
No.of
polymorphicbands
Primer1 (GA)8C 6 Primer11 (TCC)5AC 1
Primer2 (CT)8G 7 Primer12 (AG)8GT 7
Primer3 (AG)8T 8 Primer13 CAA(TG)7T 3
Primer4 (AC)8C 3 Primer14 TCA(TG)7T 5
Primer5 (AG)8C 5 Primer15 AGA(TG)7T 5
Primer6 (TC)8C 7 Primer16 CCA(TG)7T 8
Primer7 (AG)8GC 8 Primer17 TAA(TG)7T 3
Primer8 (CT)8RG 2 Primer18 CC(CA)8CGA 9
Primer9 (AC)8CC 3 Primer19 TGT(AC)8GA 3
Primer10 (AC)8CT 2
注:R:A/G。 Note:R:A/G.
1.2.4　数据处理
根据电泳图谱中 DNA条带在同一位置上的有无 , 有记为
“ 1” ,无记为 “ 0”, 根据软件要求的格式输入计算机 ,进行数据
分析。用 POPGENE软件进行遗传参数的分析 [ 8] ;用 SLT NT-
sys2.1e软件进行 UPGMA聚类分析和主坐标分析(PCOOR-
DA)[ 9] ;用 Arlequin3.1软件包中 AMOVA分析 ,对种间和种内
遗传变异进行分析 [ 10] 。
2　结果与分析
2.1　12个雀麦种基因组 ISSR遗传多态性
12个雀麦种的 ISSR产物有丰富的多态性 , 扩增的 DNA
片段大小从 150bp到 2 000bp均有分布。 19个 ISSR引物总共
扩增出 109条稳定 、清晰的谱带 ,平均每个引物产生 1到 10个
条带不等。引物 Primer7在部分雀麦材料上的 ISSR电泳图谱
见图 1。 12个雀麦种的总位点数 、多态位点数 、多态位点百分
率见表 3。
图 1　Primer7对 22份雀麦材料的ISSR扩增部分图谱
注:M为 DL2000 Marker。
Fig.2　ISSRfingerprintsof22 BromusmaterialsamplifiedwithPrimer7
partly
Note:MistheDL2000 Marker.
表 3　12个雀麦种的 ISSR遗传多样性
Table3　GeneticvariabilityofISSRmarkerin12 Bromusspecies
种名
Speciesnames
材料数
Materialnumbers
Nei s多样性指数
Neisgenediversityindex
Shannons指数
Shannon s
informationindex
多态位点数
Polymorphism
locusnumbers
多态位点百分率(%)
Percentage
ofpolymorphismloci(%)
无芒雀麦 B.inermis 4 0.1274 ±0.1912 0.1887±0.2754 37 33.94
缘毛雀麦 B.ciliatus 4 0.1444 ±0.1935 0.2154±0.2800 43 39.45
草地雀麦 B.biebersteini 4 0.1886 ±0.2113 0.2771±0.3004 53 48.62
雀麦 B.japonicus 2 0.1558 ±0.2016 0.2275±0.2943 41 37.61
河边雀麦 B.riparius 1 0 0 0 0
红雀麦 B.rubens 1 0 0 0 0
大麦状雀麦 B.hordeaceus 1 0 0 0 0
密丛雀麦 B.benekenii 1 0 0 0 0
杂色雀麦 B.variegatus 1 0 0 0 0
疏花雀麦 B.remotiflorus 1 0 0 0 0
硬雀麦 B.rigidus 1 0 0 0 0
沙地雀麦 B.ircutensis 1 0 0 0 0
总体 Total 22 0.2784 ±0.1724 0.4235±0.2321 95 87.61
2.2　12个雀麦种的遗传多样性分析
由表 3可知 ,不同雀麦种遗传多样性有差异。 Nei s指数
计算的各种群遗传多样性比 Shannon多样性指数计算的值偏
低 ,虽然二者估算的遗传多样性程度有所差异 , 但二者估计的
各种群内平均遗传多样性的变化趋势基本一致。 22份雀麦材
料总的 Neis(1973)基因多样性指 [ 16]数为 0.2784, Shannon信
息指数为 0.4235, 雀麦总的遗传多样性水平较高。
Nei s指数估算的 19个引物扩增所得位点的种内和种间
的基因多样性见表 4。平均总基因多样性为 0.2513,种内基因
多样性为 0.1541, 61.32%的遗传变异存在于种内 , 38.68%的
遗传变异存在于种间;遗传分化系数为 0.3867, 基因流(Nm)
为 0.7928<1,种间的基因交流有限。
12个雀麦种的 AMOVA分析结果见表 5, 在总的遗传变异
中有 78.26%的变异存在于种内 , 21.74%的变异存在于种间 ,
雀麦遗传多样性可能主要来源于种内变异。
2.3　12个雀麦种的聚类分析和主坐标分析
2.3.1　12个雀麦种的聚类分析
根据 19个 ISSR引物的 PCR扩增条带数据 , 使用 Jaccards
coeficient计算 22份雀麦材料的遗传相似度矩阵 , 经 UPGMA
聚类分析构建亲缘关系树状图(图 2)。在相似系数 coefficient
=0.50处 22份雀麦材料分为 5个类群:
第Ⅰ类群中包括了 11份雀麦材料 ,主要以无芒雀麦和缘
毛雀麦为主。在相似系数 coefficient=0.64处又把此类分成 6
组:第一组包括 3份雀麦材料 , 为 A10、A50、F1;第二组包括 4
份雀麦材料 , 为 A41、A56、B10、B5;第三 、四 、五 、六组各包括了
1份雀麦材料 , 分别是 B9、D1、H1、B8。 第Ⅱ类群包括 1份雀
麦材料 , 为贵州的 J1疏花雀麦 。第Ⅲ类群包括 8份雀麦材料 ,
主要以草地雀麦为主。在相似系数 coefficient=0.52处又把
此类分成 2组:第一组包括 5份雀麦材料 , 为 C3、C5、C6、E1、
K1;第二组包括 3份雀麦材料 , 为 C4、D2、I1。第Ⅳ类群包括 1
份雀麦材料 , 为美国的 G1大麦状雀麦。第Ⅴ类群包括 1份雀
麦材料 , 为正蓝旗的 SD沙地雀麦。
根据 POPGENE计算所得的 Nei s无偏一致度 , 通过 UP-
GMA法进行 12个雀麦种的聚类分析(见图 3), 无芒雀麦与缘
31
生　物　技　术 2010年 20(6)　
毛雀麦亲缘关系最近聚为一支;草地雀麦和雀麦也较近聚为
另一支 ,这四个种亲缘关系很近 ,形成 3级聚类;红雀麦与前 4
个雀麦种大类相聚 ,然后河边雀麦 、杂色雀麦 、硬雀麦 、密丛雀
麦 、大麦状雀麦 、疏花雀麦 、沙地雀麦分别与其前面的雀麦类
群依次相聚。由图中所示沙地雀麦与其他雀麦种的遗传分化
较大 ,亲缘关系与其他雀麦种较远 ,这与沙地雀麦的表形和生
活型与其他种雀麦差异十分显著相一致。
表 4　12个雀麦种的遗传分化(由Neis指数估算)
Table4　Geneticdiferentiationsamong12 Bromusspecies(evaluatedby
Neisindex)
引物
Primer
总基因多样性
Totalgene
diversity
种群内基因多样性
Genediversity
withinpopulations
种群间遗传分化
Geneticdiferentiation
amongspecies
基因流
Gene
flow
Primer1 0.2558 0.1593 0.3108 1.7856
Primer2 0.2802 0.1799 0.3015 1.7176
Primer3 0.3141 0.2236 0.2507 2.5267
Primer4 0.3072 0.1487 0.4706 1.0427
Primer5 0.2330 0.1204 0.4481 1.0188
Primer6 0.2586 0.1899 0.2419 4.3289
Primer7 0.1800 0.1202 0.2834 5.3357
Primer8 0.1099 0.0770 0.2187 2.6547
Primer9 0.3434 0.1212 0.6592 0.3094
Primer10 0.2710 0.1646 0.3710 1.2382
Primer11 0.2911 0.1036 0.6442 0.2761
Primer12 0.1944 0.1163 0.2777 2.5282
Primer13 0.1988 0.0976 0.3743 1.5227
Primer14 0.2135 0.1164 0.4080 1.0948
Primer15 0.2589 0.1382 0.4193 2.1121
Primer16 0.2903 0.2076 0.2507 2.1400
Primer17 0.2226 0.1423 0.3235 2.3288
Primer18 0.3413 0.2266 0.3109 3.4900
Primer19 0.1286 0.0603 0.3486 2.3262
平均值 Average 0.2513 0.1541 0.3867 0.7928
表 5　AMOVA分析种间和种内分子变异
Table5　AnalysisofAMOVAwithinandamongspecies
变异来源
Sourceofvariation
自由度
d.f.
变异组分
Variance
component
总变异百分率(%)
Percentageof
totalvariance
P
种间 Amongspecies 11 3.59693 va 21.74 <0.001
种内 Withinspecies 10 12.95000 va 78.26 <0.001
总计 Total 95 16.54693
注:显著度检测为对 ISSR扩增产物带进行 1 000次随机重复所得的显
著性检测。
Note:p-valuesaretheprobabilitiesofhavingamoreextremevariance
componentthantheobservedvaluesalone.Probabilitieswerecalculatedby
1 000 randompermutationsofindividualsacrosspopulations.
图 2　依据 Jaccards(1908)相似性系数的 22份雀麦材料 UPGMA聚类
分析亲缘关系树状图
Fig.2　Dendrogram(UPGMAmethod)of22 Bromusmaterialsbasedon
thesimilaritycoefficientofJaccards(1908)
图 3　 12个雀麦种的 UPGMA聚类分析亲缘关系树状图
Fig.3　Dendrogram(UPGMAmethod)of12 BromusspeciesbasedonNei
s(1978)measuresofgeneticidentity
2.3.2　12个雀麦种的主坐标分析
根据 12个雀麦种的 Nei s无偏一致度矩阵进行主坐标分
析。前 3个主坐标解释的变异分别为 20.13%、 17.79% 和
13.87%, 总变异为 51.79%。对 12个雀麦种前三个主坐标三
维图的排序(图 4),结果表明 12个种的远近关系基本支持聚
类分析的结果 。
图 4　 12个雀麦种依据ISSR分析的三维主坐标图
Fig.4　Threedimensionalplotofprincipalcoordinatesanalysisof12 Bro-
musspeciesbasedonNeisunbiasedidentitymatrix
3　讨论
利用 Nei s指数分析基因多样性时 , 总遗传多样性(HT)
分解为各种内多样性(HS)和各种间的遗传多样性(DST), 即HT=HS+DST,基于种内基因多样性和种间的基因多样性得出
的种内遗传变异为 61.32%, 种间的遗传变异为 38.68%。
AMOVA分析得出在总的遗传变异中有 78.26%的变异发生在
种内 , 有 21.74%的变异发生在种间。二者数值的不一致可能
是统计计算的理论基础不同 ,但二者说明的大致趋势一致 , 即
种内变异是雀麦遗传多样性的主要来源。
22份不同来源的雀麦材料的 UPGMA分析显示出不同材
料间的关系 , 给予不同材料间的进一步研究提供一些信息。
由于某些雀麦种仅有一份材料 , 这对于不同来源雀麦材料和
不同雀麦种间的关系研究影响较大 , 因此以后应致力于扩大
雀麦材料收集范围 ,以丰富雀麦的遗传多样性研究。 12个雀
麦种进行的主坐标分析和 UPGMA聚类分析的结果基本一致 ,
但主坐标分析可以从不同方向 、不同层面更加直观地显示各
雀麦种的关系 [ 11] , 然而前三个主坐标解释的总变异为 51.
79%, 仅以前三个主坐标为依据进行分析还不全面。根据 12
个雀麦种的 UPGMA分析可知:无芒雀麦与缘毛雀麦亲缘关系
最近 , 这与缘毛雀麦为无芒雀麦的近缘野生种有关 [ 12] 。 草地
雀麦与雀麦二者也形成一级聚类 , 可能是草地雀麦与雀麦的
种间授粉 、种间杂交使的二者的亲缘关系较近。这 4种雀麦
32
　2010年 20(6) 生　物　技　术　
又聚为一类 ,可能与这 4种雀麦多年来在生产上被广泛利用
于栽培和人工育种 ,导致了种间交流频繁有关。 红雀麦 、河边
雀麦 、杂色雀麦 、硬雀麦 、密丛雀麦 、大麦状雀麦 、疏花雀麦与
前四种雀麦亲缘关系较远 , 并且依次聚类 , 这几种雀麦生产应
用较少 ,并且每种都具有自己的特征或特性 ,是很好的遗传资
源尚待开发利用。沙地雀麦与其它的雀麦亲缘关系都较远 ,
这与它独特的表型和生境特性相符 , 沙地雀麦有别于其他雀
麦的丛生性生长 ,属于根茎横走型沙地植物 ,并且多生长于干
旱的沙地 ,特殊的生境和生长特性导致其具有独特的遗传特
征 [ 13] 。
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天麻 ITS序列分析及变异类型鉴定
王德信
(山东菏泽学院资源与环境系 , 山东 菏泽 274015)
摘要:目的:选取天麻 3种变型有代表性的样品进行ITS序列(DNA基因的内转录间隔区序列)测序分析 , 从分子水平对天麻
不同变异类型亲缘关系作出鉴定。方法:采用改进 CTAB法提取天麻 DNA, 利用合成的特异引物对其 DNA中 ITS区进行扩增 、
克隆 ,对目的片段测序分析。结果:黄天麻和绿天麻首先构成两个姊妹群 , 它们的遗传距离约为 25,乌天麻与它们的遗传距离约
为 50,而且它们之间的遗传距离都达到了 100%的置信度。其中 ITS1的 209个碱基中仅仅有 15个位点的差异 , 相同碱基数目达
到 92.8%,这 15个变异位点可作为天麻变型间的特异性鉴定。结论:表明 ITS区序列分析可作为鉴定天麻不同变异类型的一种
新方法。
关键词:天麻;变异类型;ITS序列 ;鉴定;遗传距离
中图分类号:Q331;S567　　文献标识码:A　　doi:10.3969 /j.issn.1004 -311X.2010.06.187IdentificationofDiferentTypesinGastrodiaelataBasedontheAnalysisofITSSequence
WANGDe-xin
(DepartmentofResourcesandEnvironment, HezeUniversity, Heze274015, China)
Abstract:Objective:InordertofurtheridentifythedifferencesinthreerepresentativesamplesofGastrodiaelata, theirITSsequencesof
rDNAgeneswereamplified, sequencedandanalyzed.Itisindicatedthattherearediferentrelationshipbetweenthemfromthelevelof
molecularvariation.Method:GenomicDNAfromGastrodiaelataextractedbymodifiedCTABmethodwereregardedastemplatesforPCR
amplification, cloningandsequencingbysyntheticspecificprimerthenrDNAITSsequences.Result:G.elataBl.f.flavidaS.Chowand
G.elataBl.f.viridisMakconstitutethefirsttwosistergroups, theirgeneticdistancewereabout25, G.elataBl.f.glaucaS.Chowandtheir
geneticdistancewereabout50 andthegeneticdistancebetweenthemhasreachedthe100% confidence.IntheamplifiedITS1 sequence
with209bp, thereare15variedbasesiteswhichcouldbeusedasspecificcharacterstoidentifythreetypes.Intermsofthenaturalpopula-
tionscale, G.elataBl.f.glaucaismuchricherthanothertypesinGeneticdiversity, itmightbetheoriginaltypeofG.elataspeciesin
phylogenyandevolution.Conclusion:Fromtheabove, sequenceanalysisofITSprovidesanewapproachtoidentifytheGastrodiaelata
resources.
Keywords:Gastrodiaelata;variationtype;ITSsequence;identification;geneticdistance
收稿日期:2010-06 -28;修回日期:2010 -09 -08
资助项目:昭通天麻规范化种植技术(GAP)研究及示范基地建设项目
(2002ZY-1)资助
作者简介:王德信(1975 -),男 ,山东聊城人 ,硕士 , 讲师 ,研究方向:植
物资源开发与利用 , Email:wangdexin1996@ 163.com。
　　天麻(GastrodiaelataBl.)是我国名贵的传统中药材 ,天麻
属兰科多年生共生草本植物 [ 1] 。天麻属植物在我国已被确认
的有 5个种 ,能入药的仅天麻 1个种。中国科学院昆明植物
研究所的周铉根据花的颜色 、花茎的颜色 、块茎的形状 、块茎
的含水量不同 , 把天麻分 6个变型 [ 2] 。但颜色中间存在过度
类型 ,天麻分子标记技术研究进行品种鉴定国内外尚属空白。
通过天麻 ITS分子标记技术研究进行分析 ,为天麻的遗传多样
性及亲缘关系的研究 , 鉴定新的种质资源以及天麻的育种工
作提供可借鉴的资料。
ITS区序列指 DNA基因的内转录间隔区序列 , 包括 ITS1、
5.8S及 ITS2等 3个区段。利用 ITS区序列鉴定道地药材应用
较多 , 能够鉴别同属植物相似种以及药用植物混淆种 [ 3-5] 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
天麻三种不同变型(乌天麻 G.elataBl.f.glaucaS.Chow、
黄天麻 G.elataBl.f.flavidaS.Chow和绿天麻 G.elataBl.f.
viridisMak), 采于云南昭通小草坝天麻种植基地。
1.2　试验方法
DNA提取方法是按 CTAB法改进而来。
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