全 文 ：内蒙古农业科技 20() 3 (s2 ) : 1 10 · 1 13
i
ner 而 n go lia A幼 e u l t u ar l cS ie nc e nA d
缘毛雀麦过氧化物酶及醋酶同工酶分析
张晓华 ` , 张晓丽 2 , 刘 东林 3
( 1
.赤峰市巴林左旗草原站 ,内蒙古 赤峰 024以幻 ;2 .赤峰市巴林左旗华夏职业学校 ,内蒙古 赤峰 0 240 X()
3
.赤峰市巴林左旗草原监理所 ,内蒙古 赤峰 0 24 阅0)
摘 要 : 实脸采用聚 丙烯跳胺凝胶电泳技术对 巧 个缘毛雀麦不 同类型及 2 个无芒雀麦品种 的过氧化 物醉同
工酶和酣酶 同工酶的 分析 , 明确 了其醉语特征及分布 , 并通过酶语差异探讨 了不 同类型之间的差异 ,及这些
类型与无芒雀麦 间的差异 ,从而为鉴定提供 了主要参考依据 。
关键词 :缘毛雀麦 ;过氧化物 酶 ;酣酶 ; 同工酶
中图分类号 :巧 201 . 25 文献标识码 : A 文章编号 : 10 07 刁907 《2加 3 )s2 刁1 0戒月
同工酶技术是近年来发展起来的一项新技
术 ,它被广泛利用在农作物 、蔬菜 、 牧草育种研究
及品种鉴定上 。 同工酶是蛋白质 ,是基因的直接产
物 ,是基因表达的结果 , 因而是良好的遗传标志 。
同工酶技术所依据的主要原理是将蛋白质结构的
近代知识与同工酶概念联系起来 , 通过电泳和组
织化学方法进行特异性染色而把蛋 白质分子分
离 ,并将位置和活性直接在染色区带标记出来 。 酶
蛋白所显示的图像就为酶谱 。 因此 ,用聚丙烯酞胺
凝胶电泳测定同工酶 , 方法简便 ,灵敏度高 , 重现
性强 , 测定结果便于观察 、记录 、保存 。
缘毛雀麦是典型草原和草甸草原地 区很有栽
培前途的野生优 良牧草 。 其草质柔嫩 ,营养丰富 ,适
口性好 , 是一种放牧和打草兼用的优良禾本科牧
草 ,经过几年驯化 ,发现其变异类型较多 。 因此 ,本
文通过电泳技术测定各个类型酶谱及计算 fR 值来
说明各类型间的差异及无芒雀麦种间的差异 。
1 材料和方法
1
,
1 材料
共有初步选育的 巧 个缘毛雀麦类型和 2 个
无芒雀麦品种 。 在其抽穗期取其末现穗枝条的上
部叶 。 缘毛雀麦的编号为 0 1 、 02 、 0 3… … 14 、 9 70 ,
且每一类型材料分别取 3 株 。 各取 1 株无芒雀麦
1 (克旗野生种 )、无芒雀麦 2( 加拿大卡尔顿 )。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 实验中所需药品的配制及配比 ( l) 电极
缓冲液母液制备 。 称取 (三经甲基 )氨基甲烷 口r is)
6 9
, 甘氨酸 (lG刃28 . 89 混合加 蒸馏水定溶 到
1 0( )0以 , 即电极缓冲液母液 。 ( 2) 电极缓冲液及提
取液配制 。 取 20 0m l 母 液 , 用 蒸馏水稀释到
Z0 0m l, p H值调至 .8 3即可使用 。 取 5 0诫 母液 , 用
收稿日期: 20 3一 12 一巧
浓 H a 和 浓 N a 0 H 溶液调 pH 二 .7 5 后 稀 释到
l o m l 即可使用 。 (3 )凝胶制备 。 电泳胶有封底胶 ,
分离胶 、浓缩胶之分 。 封底胶制备 :称取 19 琼脂溶
于 10 而 蒸馏水 , 加热至沸腾 。 分离胶制备 (表
l) : ) H
二 .8 9, 浓度 .6 5%) 。 浓缩胶制备 (表 2) :印 H二
.6 7
,浓度 3 . 1% ) 。 各类胶中药品的配制 :
表 1 分离胶制备
药品 体积( d )到加 一 10 30 L ” L 面一 L翻s 一 HC IPH二8 . 9
Ae -r B i s
D i s H刀
T E M E D
AP (%)
1
.
25 0
2
.
10
.6 6阅
.0 0 5
.0 05 0
3
.
7 50
.6 30
l 9
.
80()
0
.
0 15
0
.
15 0
竺.
s co
1.2 6 (洲)
3 .9 6以)
.0 03 0
.0 30
表 2 浓缩胶制备
药品
irT
s 一 HCIP H
二 6 . 7 1 . 2 50 2
.
5X() 3
.
7 5 0
A e r一B is 1 .峨拟 ) 2 .以力 3 .0以)
众 s H刃 7 . 65 0 15 . 3X() 2 2 .9 5 0
T EM E D 0
.加5 0 . 0 10 氏0 15
A p (%)
.
.01 阅 .0聊 .~ . .0} 照一
irT
s一 H C I , p H二8 . 9 的制备 : 称取 36 . 3 girT s 加
入 4 8d IN HC I 中 , 调 p H二8 . 9 后加水定容至
l o m l
。
irT
s 一 HC I , p H二 6
.
7 的制备 : 称取 irT s 5 . 95 9
加人 4 8m l I N H C I 中 , 调 p H 二6 . 7 后加水定容至
l o d
。
A c卜 iB 。 配制 : (A c卜丙烯酞胺 iB s一甲叉丙
烯 酞胺 ) 称取 A c r3 飞 , iB so . s g 混合加水定容至
l o m l
。
A (P%) 制备 : 取 AOP . l g 定容至 l m l 。 (’) 染
色剂 的制备 。 过 氧 化 物酶 : 2m0 1 2% 联 苯胺 ,
70 .4 mg 抗坏血酸 ,20 d .0 6% H必 2 , 60 耐 蒸馏水 ,临
时混合 。 其中 2%联苯胺制备 : 2 9联苯胺 , 1 8耐 冰
醋酸加水定容至 10 耐 。 .0 6% H八 的制备 : 5时
30% H 20
: 定容至 25 0耐 。 醋酶 : 30m g 固兰 RR 盐
溶于 3 oml p H二 .6 4 的磷酸缓冲液 ,过滤 ,在滤液中
张晓华等 :缘毛雀麦过氧化物酶及醋酶同工酶分析
加人 2m l l %o (r I ln Z % )a一醋酸茶醋 , Zm l l % p -
醋酸茶醋 。 其中 pH二 .6 4 磷酸缓冲液 .(0 ZM )制备 :
7
.
164 少 aH Z0P 4 . 12 H必 溶 于 水 定 容 至 10 血 ,
3
.
56 1少处HoP 4 · Z H必 溶于水定容至 10 耐 , 分别
量取 7 3 . s m lN a HZP O ; 液 , 2 6 . S lnI N为H P 0 4 液混合即
得 p H二 .6 4, .0 2M 的磷酸缓冲液 。 1% 的 a一醋酸茶醋
的制备 : 0 . 19 醋酸一卜茶醋溶于少许丙酮定容于
10耐 so %酒精 。 1% p一醋酸茶醋的制备 : 19 醋酸 -
p一茶醋溶于少许丙酮定容于 or m l 8 0%酒精 。 (5 )
固定液的制备 。 过氧化物酶 : 3Om 1 95 % 乙醇 ,.7 5耐
乙酸 , 15 ml 甘油混合加水定容至 10 血 。 醋酶 :
50 m l 甲醇 , 10m l 冰乙酸 , 5 0 lnI d i s H 20 混合 。
1
.
.2 2 实验步骤 ( l) 实验样品制备 。 分别称取各
样品重复样 19 ,剪碎 ,分别放人冰浴的研钵中 , 在
每个研钵 中加人 s d (样品的 1一 3 倍 )已制备好的
提取液 ,研磨成匀浆 , 在 4 0 0 转m/ in 的离心机上
离心 s m in , 取上清液装人小瓶 中 , 并分别加 人
5m l (即与提取液等量 )3 o%的甘油 , 放人低温冰箱
内保存备用 。 (2) 胶板制备 (灌胶 ) 。 将电泳板装好
后 , 用琼脂胶封底 , 巧 m in 后 ,灌人分离胶 , h2 后 ,
再灌人浓缩胶 , 插人样槽梳 , l . hs 后 ,取下梳子 ,备
用 。 (3 )电泳 。 将已磨好的样品用微量进样器各取
2u0 l( 过氧化物酶 ) , 7u0 l( 醋酶 )分别加人已制好的
凝胶样品槽中 ,然后在槽内加满 电极缓冲液 ,再在
靠近负极的底板边加 .0 5% 的滨酚蓝作为前沿指
示剂 。 接通 电源 ,在 0一4℃的恒温冰箱中电泳 。 将
电流设置 45 一50 n 1A , 电压设置到 265 V 左右 。 当前
沿指示剂接近底板 1 . 0一 .2 sc m 时 ,停止电泳 ,取出
电泳槽进行剥胶处理 。 (4 )染色 。 将已取出的凝胶
去掉上部浓缩胶和下部琼脂胶部分 (即余下分离
胶 ) ,进行染色 。 过氧化物酶的位点在染色液中出
现较快 , 待大多数位点清晰后 ,在蒸馏水中漂洗 ,
而后放人固定液中进行保存 。醋酶位点出现慢些 ,
一般在 37 ℃恒温箱中染色 3Om in , 待位点清晰后
取出放人固定液中保存 。 (5 )绘制模式图及照相 。
2 结果与分析
2
.
1 过氧化物酶同工酶
把所有样品按上述方法做出过氧化物酶同工
酶谱 。单从酶谱上还不能完全说明各类型间差异 。
从酶谱看 , 各个样的谱带数不尽相同 , 04 号酶带
最多 , 共 8 条 , 03 号有 7 条酶带 , 0 2 号 、 05 号有 6
条酶带 , 06 号 、 07 号 、 0 8 号 、 0 9 号 、 10 号 、 12 号 、 14
号 、 97 0 1号 、 无 l 、 无 2 号具有· 5 条谱带 , 01 号 、
9 70 2 号具有 4 条谱带 , 13 号有 3 条谱带 , n 号
只有 2 条谱带 。
为了准确对他们进行鉴定 , 特计算出各谱带
的 fR 值 (表 3) 。 由 fR 值可看 出 ,所有类型共有 12
条不同 fR 值的同工酶带 ,各类型在酶带的相对迁
移率上有较大差异 。 大多数类型具有第五 、 第六 、
第七 、第九条带 。 与对照样相 比 , 04 号和无芒雀麦
2 都有第四 、 第五 、第九 、第 10 条谱带 ,说明 04 号
与无 2 号有较大相同之处 , 但 04 号另具第六 、 第
七条酶带 。
02 号与 05 号都具有第五 、 第六 、 第七带 ,但
02 号独具第三 、第九 、 第 12 条带 , 05 号独具第八 、
第 10 、第 1 1条带 。 06 号 、 07 号 、 0 8 号 、 09 号 、 10
号 、 12 号 、 14 号 、 97 0() l 号 、无 2 号 、 无 l 号 ,在 fR
值上较相似 , 只能在谱带的强带数和位置上来区
别 , 0 6 号 、 0 9 号 、 10 号 、 一2 号都具有一条强带 , 06
号是在第五条带上 , 09 号也是在第五条带上 , 但
他独具第 or 条带且为中强带 , 10 号是在第九条
带位置上 , 12 号在第四条带位置上 , 且第九条中
强带较宽 。 0 8 号 、 无 2 号 、 无 1 号都具有两条强
带 , 08 号是在第五 、 第九条位置上 , 无 2 号在第
四 、第五条带位置上 。 无 1号在第一 、第六条带位
置上 。 14 号 、 97 0 1号都具有 3 条强带 , 14 号在第
四 、 第八 、 第 10 条位置上 , 97 0 1 号在第四 、 第
九 、第 1 条位置上 。
01 号 、 97 0 02 号在谱带位置上有差别 , 01 号
所有谱带分别在第三 、 第六 、第七 、第 10 条带位置
上 , 97 0 2 号分别在第四 、 第六 、第九 、 第 1 条带
位置上 , 且从图谱上看 , 01 号有 3 条强带 , 97 0 1
号有 2 条强带 。
13 号样中所取的 3 株样有差别 ,产生这种结
果的原因可能是其内部有差异 。 通过分析可以得
出 ,所取样品中各类型在过氧化物酶及 fR 上各具
特点 , 充分说明他们在遗传和育种上有较大差
异 。
.2 2 醋酶 同工酶
经过醋酶染色法染色后 , 结果表明 , 各类型在
谱带上也有明显差异 , R f值见表 4 。
从由醋酶图谱可以看 出酶带的数量不尽相
同 。 02 号酶带最多 ,共 6条 。 03 号和 05 号都有 4
条带 。 1 1 号有 3 条带 。 04 号 、 06 号 、 0 8 号 、 0 9
号 、 14 号都有 2 条带 。 0 1号 、 07 号 、 10 号 、 12 号 、
13 号都有 1 条带 。 虽然带数有的相同 ,但从 fR 值
内 蒙 古 农 业 科 技
上看 , 带的位置却各不相同 , 03 号和 05 号都有第 二条带 , 09 号另具第九条带 。 06 号具有第四 、
二条带 ,但 03 号另具第三 、 第六 、第八条带 , 05 号 第八条带 , 08 号具有第三 、第六条带 , 14 号具有第
另具第 四 、第七 、 第 or 条带 。 一 、 第三条带 , 由此分析可鉴定不是同一类型 。
04 号 、 09 号都具有第五条带 ,但 04 号另具第 01 号 只有第六条带 , 07 号 只有第四条带 , 10
表 3 无芒雀麦及缘毛雀麦各类型过 氧化物酶 fR 值
类型及 酶谱带
品种 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12
无 1 0 . 04 0 . 1 9 0 . 3 3 .0 4 8 0 . 5 7
286759.0.0.无 2
。 .
0
.
0 3
60.0
96咤心曰J11ù呢ó.0
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.
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.
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0
.
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.
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.
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.
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.
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.
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0
.
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0
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.
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.
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.
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.生二Jjl.月马l内J飞à月jù.023104.0住.
内马ù
.0 0
01工345肠7892
9 7 0 0 1
9 70 2
表 4 缘毛雀麦各类型醋酶 fR 值
类型 酶谱带
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
.
6 8
0
.
7 2 0
.
7 8
0
.
6 9 0
.
7 9
0
.
7 3
0
.
7 9
0
.
8 5
0
.
8 0
0
.
5 5
0
.
5 1
号只有第 九条带 , 12 号只有第三条带 , 13 号只有
第八条带 , 由此位置可以说明他们不是同一类型 。
通过以上分析可知 ,各类型在醋酶及 fR 上都
有独特之处 ,说明各样品间有显著差异 。
3 讨论
品种鉴定的电泳方法 , t 早已在法国 、 澳大利
亚 、美国 、 中国等国家普遍采用 。但是 ,此方法大多
用于进行农作物品种鉴定 , 而在牧草品种鉴定方
面应用甚少 。 近年来 , 随着科学技术的发展 ,实验
水平的要求 , 同工酶技术越来越被重视 ,他可以更
准确地分析 、鉴定品种 。 用 同工酶谱进行牧草品种
鉴定 ,是一种简便 、准确 、可行的方法 。 尽管在牧草
酶谱检索表还不健全的情况下 , 我们还无法对每
一个类型进行正确鉴定 、命名 ,但至少我们可以把
外观相近 , 而不是一个种或一个品种的牧草区别
开来 。 这种方法对于鉴定一些用传统方法难以鉴
别的类型或外部形态相似的类型 , 无疑是有效的 ,
并且可以用作发现新种或新品种的辅助手段之
酶谱带数的多少 ,可能与不 同类型的基因表
达的酶蛋 白中种类多少有关 , 酶谱带颜色的差
别 ,可能是不同类型基因表达的酶蛋白量的不同
所致 。 由于同一基因不同表达的差异要小于不同
基因的差异 ,所 以各类型有很大差异 。
内蒙古农业科技 20 3( 52) : 1 13
nI n e r M o n g o li
a Ahg
e u lt u耐 cS ie nce A n d eT c h n ol o gy
春甘蓝套种玉米栽培技术
张凤云
(赤峰市喀喇沁旗马蹄营子乡农业科技服务站 , 内蒙古 赤峰 0 24 14)
中图分类号 : 5 6 35 文献标识码 : B 文章编号 :1 0 7一的0 7 《2X() 3 152一 1 3刁 l
春甘蓝是赤峰地 区露地蔬菜中收获期较早
的叶菜类蔬菜之一 , 其产量高 ,病害少 ,上市时价
格较高 , 6 67 时 纯收人千元以上 。 采用地膜甘蓝套
种地膜玉米立体栽培是一项投人少 、 收益高 、风
险性小的粮菜型种植模式 ,其栽培技术如下 。
l 栽培模式
甘蓝套种玉米带型多种多样 , 以 2 行甘蓝套
种 2 行玉米为例 : 甘 蓝 6 7时 保苗 2 7 0 0 株 , 产量
3500k娜6 7m 2 左右 , 收人 1 30 . 0 元 16 67衬 ;玉米
保苗 3 50 0 株 16 6 7m 2 左右 , 产量 印。k洒6 7m 2 以
上 , 收人 4 5 0 . 0 0 多元 /6 6 7m 2 , 扣除成本 , 6 6 7m 2纯
收人 12 0 . 0 元以上 。
2 甘蓝栽培技术
2
.
1 种植品种
选用 中甘 1 1 、 春旱王 、 北 京早熟等优质 、 早
熟 、 商品性好 、 产量高 、 抗寒性强的品种 。
.2 2 甘蓝育苗
甘蓝采用温室育苗 ,每 66 7耐 移栽 田用种量
为 80一 10 9 。 l 月下旬温室育苗 , 每 扩 苗床施人
腐熟优质有机肥 3 o k g , 磷酸二氢钾 5飞 , 与床土
混匀后 , 铺 2一 c3 m 厚 。 种子未包衣的播种前用
.0 4% 福美双拌种 , 播种后 , 白天控制棚内温度
20 ~ 25 ℃ , 夜间不低于 8一 10℃ 。 当幼苗 3一4 片叶
时 , 按 10 c m x lo c m 株行距分苗一次 。 定植前 1d0
苗床浇透水 ,并适当通风 ,进行炼苗 。
.2 3 甘蓝定植及田 间管理
移栽前整地 , 667 耐 施有机肥 4加 0 一50 0k g ,
硫酸钾复合肥 25k g 。 3 月下旬 ,苗龄 6 d0 ,甘蓝苗
7一 8 片叶时移栽到大田 , 行距 40 e m ,株距 30 c m 。
为增温 、保墒 , 每垅按 1 . 2 m 距离插上 9c0 m 长的
小竹片 , 做成 30c m 高的小拱 ,覆盖 9 c0 m 宽的地
膜 。 4 月下旬 , 气温回升时 , 及时扣拱膜防风 。 5 月
上旬拆掉拱膜 。 5 月中旬用速灭杀丁 、灭杀毙等
防治小菜蛾 ,适时浇水 ,促进甘蓝叶球生长 。
2
.
4 收获
6月上旬甘蓝全部采收 ,上市 。
3 玉米栽培技术
3
.
1 品种选择
选择掖单 13 、农大 108 等高产品种 ,采用包
衣种子 。
.3 2 适时播种
4 月 下 旬 播 种 , 66 7砰 施 有 机 肥 4 0 00 -
5 0X() k g
, 硫酸钾复合肥 2 5 k g , 行距 3 c3 m , 株距
2 c5 m
,播后覆膜 。
3
.
3 田间管理
玉米出苗后及时查苗补苗 , 3一 4 叶 时间苗 ,
4一 5 叶时定苗 。 在玉米大喇叭口 期打孔追施尿素
30 甲 667 m 2 ,并适时浇水 ,开花灌浆期及时浇灌浆
水 。 抽雄至乳熟期防治玉米螟 ;进人蜡熟后期 , 采
取果穗站秆扒皮晾晒促早熟 , 当苞叶全部变黄时
即可收获 。
(资任编辑 侯旭光 )
收稿日期 : 2X() 3一 1 刁 1
酶电泳法进行牧草 品种鉴定 ,是牧草分类鉴
定领域的一个新尝试 ,还需做大量工作 。
用 以上方法做出的缘毛雀麦各类型的过氧
化物酶和醋酶及它们的 fR 值能初步确定各类型
均不属于同一品种 。
参考文献 :
【l] 梁慧敏 ,等 .几种暖季型草坪草过氧化物酶同工酶分
析田 . 中国草地 , 19 96 , (4 ) : 40 一 .2
z[] 朱大鸣 ,等 .同工酶电泳技术在牧草鉴定上的初步探
讨田 . 中国草业科学 , 19 88, (5) : 35 一 38 .
(贵任编辑 侯旭光 )