全 文 ：陈晓斌 男，1982年生，在读硕士研究生，E-mail：chenxiaobin8204@163.com。
*通讯作者 蒋昌顺，电话：0898-23300114，E-mail：changshunj@yahoo.com.cn。
收稿日期：2008-01-29 修回日期：2008-05-22
热 带 作 物 学 报
CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPS
Vol.29No.3
Jun.2008
第 29卷 第 3期
2008年 6月
应用ISSR标记分析12份臂形草种质的遗传差异
陈晓斌 1,2 邹冬梅 1 田维敏 1 蒋昌顺 1*
1 中国热带农业科学院热带作物栽培生理学重点开放实验室
2 海 南 大 学 农 学 院
海南 儋州 571737
摘 要 选用 17条 ISSR引物分析 12份臂形草种质遗传差异，结果表明：臂形草种质间的多态性高，17条引
物产生了 286条 DNA片段，其中 280条具有多态性，多态性比率高达 97.90%；每个引物可扩增出 6~23条
DNA片段，平均 16.8条，种质间遗传相似系数变化范围为 0.486~0.968，平均值为 0.681；通过聚类分析可将 12
份臂形草种质分为两类：一类为巴拉草和湿生臂形草，其余品种则聚为另一类。
关键词 臂形草 ISSR标记 遗传差异
中图分类号 S543.9
臂形草(Brachiaria，又名旗草，英文名 Palisadegrass或 Signalgrass)属于禾本科臂形草属的一年生或
多年生牧草，有文献报道，全属约50种，我国产 6种，其中海南产 2种[1~5]，另周自玮[6]报道，臂形草全属
共 97种，中国产 9种。主要分布于热带及亚热带地区，既可用于建植人工草地，又可用于水土保持，是
优良的放牧型和水土保持型牧草。中国热带农业科学院最早于1963年从斯里兰卡引进珊状臂形草(B.
brizantha)，尔后又从哥伦比亚国际热带农业中心(CIAT)引进5个臂形草属牧草新品种[1]。我国早期对臂
形草属牧草主要是做引育种的工作，最近几年，在臂形草属牧草种子生产、牧草产量和饲用价值等方面
做了大量的研究，在臂形草属牧草内生菌方面也做了初步的研究[7~16]。而利用分子标记技术对臂形草属
进行遗传差异的研究，至今仍未见报道。因此，开展臂形草种质的遗传多样性及亲缘关系的研究对臂形
草品种的鉴定、选育及利用很有必要，同时对臂形草属植物的分类提供借鉴。简单重复序列间区 (Inter-
simplesequencerepeat，简称 ISSR)标记技术由加拿大蒙特利尔大学的 Zietkiwicz等于 1994年提出[17~20]。
Nagaoka和 Ogihara用 ISSR引物对小麦的研究结果表明，此类引物的分析结果与 RFLP分析结果一样
可靠，并发现(AC)n引物能扩增出更多的多态性[17，20]。Kojima等首先将 ISSR标记用于一粒小麦遗传作
图，结果表明ISSR标记分布于整个染色体组，其在图上所处的位置与 RFLP相似[21]。近年来，ISSR标记
在牧草研究中得到了广泛应用。例如，魏臻武等采用 12个ISSR引物对苜蓿55个品种的遗传多样性进
行了分析[22，23]。Dangi等在对胡卢巴属(Trigonela)的研究中，从100个ISSR引物中选用了14个有效引物
对17个T.foenum-graecum居群进行了遗传多样性研究 [24]。肖海峻等利用 ISSR标记对鹅观草属 20个
种，6个变种，共60份材料进行了遗传多样性检测[25]。ISSR标记已广泛应用在遗传连锁图谱构建、基因
定位、种质资源鉴定、植物分类、进化和遗传多样性等方面的研究[17，20，22~29]。本研究通过对12份臂形草种
质进行ISSR标记分析其遗传差异，为今后的深入研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 植物材料
由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供的 12份臂形草种质（表 1），均栽种于热带作
物品种资源研究所牧草中心基地。采摘适量各品种的嫩叶，并置于超低温冰箱中保存。
1.2 化学试剂
CTAB、Tris碱、EDTA、PVP、Agrose等均购于宝生物工程（大连）有限公司；2×TaqPCRMasterMix
3期 陈晓斌等：应用 ISSR标记分析 12份臂形草种质的遗传差异
购于天根生化科技（北京）有限公司；34条ISSR
引物[18]由生工生物工程（上海）有限公司和
Invitrogen公司合成，从中筛选出 17条引物用
于ISSR-PCR反应（表2）。
1.3 实验仪器
移液枪（德国Eppendorf公司）；核酸蛋白分
析仪（德国 Eppendorf公司）；高速冷冻离心机
（德国sigama公司）；PCR仪（德国 Biometra公
司）；Uvidoc凝胶成像系统（德国 Biometra公
司）；电泳仪（德国Biometra公司）。
1.4 DNA提取与检测
利用改良的 CTAB法提取臂形草的总
DNA[18]，具体步骤如下：取嫩叶约 0.5g在液氮冷冻下研磨成粉末，迅速转入 2mL离心管，加入 800μL
预冷的 CTAB-free缓冲液（200mmol/LTris-HCl，50mmol/LEDTA-Na2，250mmol/LNaCl，1%巯基乙醇
V/V）并迅速混匀，置于冰上 10min；4℃，8000r/min离心 5min，弃上清，加入 600μL65℃预热的 2×
CTAB提取缓冲液（2%CTAB，100mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA-Na2，1.5mol/LNaCl，1%巯基乙
醇V/V），充分混匀后置于65℃水浴40min，每隔15min轻摇1次，使样品充分悬浮在提取缓冲液中；取
出离心管，待冷却后加入等体积的苯酚 /氯仿 /异戊醇（25∶24∶1，V/V），轻轻颠倒混匀，4℃，12000r/min
离心6min；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1，V/V），轻轻颠倒混匀，4℃，12000r/min离心 6min；
取上清，加入等体积冰冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置于 4℃沉淀 30min；4℃，7000r/min离心 7min，
弃上清，用 70%乙醇洗涤沉淀 2~3次，风干，加入 100μLTE（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA）溶
解，加入1μL10mg/L的RnaseA，4℃保存。
用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用核酸蛋白分析仪检测 DNA的浓度和纯度，并用无菌水稀释到均
一浓度50ng/μL。
1.5 ISSR分析
PCR反应体系为20μL，其中包括：模板DNA1.0μL（50ng）；ISSR引物1.0μL(10pmol/μL)；2×Taq
PCRMasterMix10.0μL；ddH2O8.0μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性45s，52℃
1 热研3号俯仰臂形草 B.decumbenscv.ReyanNo.3 国际热带农业中心(CIAT)
2 热研6号珊状臂形草 B.brizanthacv.ReyanNo.6 国际热带农业中心(CIAT)
3 珊状臂形草 B.brizantha 国际热带农业中心(CIAT)
4 珊状臂形草CIAT6387 B.brizanthaCIAT6387 国际热带农业中心(CIAT)
5 Mekong珊状臂形草 B.brizanthaMekong 国际热带农业中心(CIAT)
6 泰国刚果臂形草 B.ruziziensiscv.Thailand 泰国(Thailand)
7 FM9201/1873杂交臂形草 B.hybridFM9201/1837 国际热带农业中心(CIAT)
8 Mulato1臂形草 B.hybridcv.Mulato1 国际热带农业中心(CIAT)
9 Mulato2臂形草 B.hybridcv.Mulato2 国际热带农业中心(CIAT)
10 巴拉草 B.muica(Forssk.)Stapf. 斯里兰卡(SriLanka)
11 杂交臂形草CIAT360601 B.hybridCIAT360601 国际热带农业中心(CIAT)
12 湿生臂形草 B.humidicola(Rendle)Schweickt. 澳大利亚(Australia)
序号 种质名称 学名 来源
表 1 12份臂形草种质的名称及来源
809 (AG)8G 841 (GA)8Y(C/T)C
817 (CA)8A 842 (GA)8Y(C/T)G
818 (CA)8G 846 (CA)8R(A/G)T
823 (TC)8C 847 (CA)8R(A/G)C
825 (AC)8T 848 (CA)8R(A/G)G
829 (TG)8C 855 (AC)8Y(C/T)T
830 (TG)8G 857 (AC)8Y(C/T)G
835 (AG)8Y(C/T)C 891 H(A/C/T)V(A/C/G)H(A/C/T)(TG)7
840 (GA)8Y(C/T)T
说明：Y=(C,T)；R(A/G)；H=(A,C,T)(i.e.notG)；V=(A,C,G)(i.e.notT)
编号 引物序列 编号 引物序列
表 2 17条 ISSR引物编号及序列
311
热 带 作 物 学 报 29卷
或 56℃退火 1min，72℃延伸 90s，36个循环；最后 72℃延伸 5min。PCR产物上样于 1.5%的琼脂糖
凝胶，150V电泳至溴酚蓝指示剂离胶孔3/4处为止。电泳完毕后在Uvidoc凝胶成像系统上观察照相。
1.6 数据统计与分析
电泳图谱中迁移率一致的条带被认为具有同源性，按照同一位置上DNA条带的有无进行统计，分
别记录为1（有）或0（无），形成原始的表型数据矩阵。利用 NTSYS-pcVersion2.10y软件对遗传变异程
度进行数据处理，分析不同种质之间的遗传关系。
2 结果与分析
2.1 ISSR-PCR扩增结果
12份臂形草引进品种的 ISSR-PCR部分引物扩增结果见图 1。从筛选出的 17个 ISSR引物扩增谱
带统计结果来看，每个引物可扩增出 6~23条 DNA片段，平均每个引物扩增 16.8条 DNA片段，17个引
物共产生 286条谱带，其中 280条具有多态性，多态性比率为 97.90%。并且从大多数引物的扩增图谱
可以看出：巴拉草和湿生臂形草与其他臂形草的DNA条带存在的差异性较明显（图A10中的箭头所
指表示唯一缺失性，其它表示唯一具有性）。
2.2 遗传相似系数
利用 NTSYS-pcVersion2.10y软件对 17个 ISSR引物扩增出的 286条 DNA片段分析计算供试材
料间的遗传相似系数（图略），结果表明，12份臂形草引进品种间的遗传相似系数变化范围为
0.486~0.968，平均值为 0.681。其中，FM9201/1873杂交臂形草和 Mulato1臂形草的遗传相似系数
（0.968）最大，表明这两个品种的亲缘关系较近，遗传差异很小。巴拉草和湿生臂形草的遗传相似系数为
0.598，它们与其余的臂形草种质间的相似系数均小于 0.601。由此可见，巴拉草和湿生臂形草与其余臂
形草种质的亲缘关系较远，遗传差异较大，存在较高的遗传多样性。
2.3 聚类分析
用 NTSYS-pcVersion2.10y软件对 12份不同来源的臂形草进行聚类分析，得分子树状图（图 2），
从聚类图中可以看出 12份臂形草种质在遗传相似系数为 0.585的水平上可分为 A和 B两类，A类群
仅为巴拉草和湿生臂形草两份种质；B类群包括10份材料，其中热研3号俯仰臂形草、热研6号珊状臂
形草和珊状臂形草CIAT6387聚在一起成为一个亚类C，珊状臂形草、FM9201/1873杂交臂形草、Mulato1
臂形草和杂交臂形草 CIAT360601聚成另一个亚类 D，亚类 C和 D先聚在一起，然后先后与 Mekong臂
形草、Mulato2臂形草、泰国刚果臂形草聚在一起形成 B类群。
2.4 臂形草种质的主坐标分析
主坐标分析以12份臂形草种质的遗传相似性系数为基础，产生的二维图见图 3。可以发现，主坐标
A为引物 809，B为引物 825；
M为 200bpDNALadderMarker；1~12为表 1中的种质编号
图 1 臂形草 ISSR-PCR扩增结果
312
3期 陈晓斌等：应用 ISSR标记分析 12份臂形草种质的遗传差异
分析结果与聚类分析结果一致。巴拉草和湿生臂形草与其它臂形草种质的遗传距离较远，它们具有较
高的遗传多样性，分布于二维图的左边偏下；热研 3号俯仰臂形草、热研 6号珊状臂形草和珊状臂形草
CIAT6387在二维图的右上方排列；珊状臂形草、FM9201/1873杂交臂形草、Mulato1臂形草和杂交臂形
草CIAT360601在二维图的右下方排列；其余臂形草种质则位于二维图的中部偏右。
3 讨 论
ISSR标记技术结合了 RAPD标记技术和 SSR标记技术的优点，具有实验操作简单、快速、高效、遗
传多态性高、重复性好、无需知道任何靶标序列的SSR背景信息等特点，被广泛应用到各类研究中。本
1~12为表 1中的种质编号；A,B,C,D为类群编号
图 2 12份臂形草种质间的 ISSR聚类分析图
1~12为表 1中的种质编号；A，B，C，D为类群编号
图 3 基于 ISSR数据获得的 12份臂形草种质的前两个主坐标的二维图
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热 带 作 物 学 报 29卷
实验首次用ISSR标记分析了12份臂形草种质遗传差异，在所用的 17条ISSR引物中共扩增出 286条
谱带，其中280条具有多态性，多态性比率为97.90%，遗传相似系数为0.486~0.968，平均值为 0.681，表
明臂形草的遗传多样性是比较丰富的。以上研究结果表明，ISSR标记适合于臂形草种质遗传多样性分
析和种质鉴定。
通过聚类分析在阈值为0.585的水平上可将这12份臂形草种质分成两类，其中巴拉草和湿生臂形
草为一类群，其余种质为另一类群，从中可以看出俯仰臂形草、珊状臂形草和杂交臂形草较为接近，它
们的亲缘关系也应该较近。如果在阈值为0.684的水平上则可将这 12份臂形草种质分为三类（与主坐
标分析结果一致），其中巴拉草和湿生臂形草各为一类，其余种质还是为另一类群，这与周自玮在臂形
草属牧草的分类及种质资源中的分类一致，其将巴拉草归为第Ⅲ组，湿生臂形草为Ⅵ组，而俯仰臂形
草、珊状臂形草和泰国刚果臂形草（路氏臂形草）为Ⅴ组[6]。供试材料中的4种杂交臂形草，其中Mulato1
臂形草由珊状臂形草和刚果臂形草杂交而来，Mulato2臂形草杂交亲本为俯仰臂形草和刚果臂形草，因
此 Mulato1臂形草和 Mulato2臂形草都归为Ⅴ组。由于 FM9201/1873杂交臂形草和杂交臂形草
CIAT360601是直接从国外引进，未知其杂交亲本，但通过聚类分析和主坐标分析可以发现，它们与珊状
臂形草和 Mulato1臂形草非常接近，因此它们的亲缘关系非常近，应该都与珊状臂形草有关联。
本实验只对臂形草的 12份种质做了初步的遗传差异分析，证明了ISSR标记在臂形草种质间进行
遗传差异分析的可行性，可为后续的研究工作提供借鉴。
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AssessmentofGeneticDiversityof12Signal
GrassGermplasmsbyISSRMarkers
ChenXiaobin1,2 ZouDongmei1 TianWeimin1 JiangChangshun1
1KeyOpenLaboratoryforCultivationandPhysiologyofTropicalCrops,CATAS Danzhou Hainan 571737
2ColegeofAgronomy,HainanUniversity Danzhou Hainan 571737
Abstract Geneticdiversityof12accessionsofsignalgrass(BrachiaraGriseb)wasevaluatedbyusing17ISSR
primerswithinter-simplesequencerepeat(ISSR)markers.Theresultsshowedthathighgeneticdiversityinthe
signalgrassgermplasmswasdetected.Atotalof286bandswereamplifiedfrom17primers,ofwhich280bands
(97.90%)werepolymorphic,and6to23polymorphicbandscouldbeamplifiedfromeachprimer,withanaverage
of16.8.ThemeangeneticsimilarityvaluebasedonISSRmarkersamong12accessionsofsignalgrasswas0.681,
rangingfrom0.486to0.968.Clusteranalysisshowed12accessionsofsignalgrasscouldbeclassifiedinto2
groups.OnegroupincludedB.mutica(Forssk.)StapfandB.humidicola(Rendle)Schweick,andtherestoftheac-
cessionswereclusteredintotheothergroup.
Keywords signalgrass ISSRmarkers geneticdiversity
315