全 文 ：2014 年第 2 期
(总第 142 期)
闽江学院学报
JOUＲNAL OF MINJIANG UNIVEＲSITY
No． 2 2014
Ceneral Serial No． 142
观音竹蛋白激酶基因 BmPti1 启动子的
克隆与序列分析
吴幼容1，郑郁善2
(1．闽江学院后勤管理处，福建 福州 350121;2．福建农林大学竹类研究所，福建 福州 350002)
摘要:以观音竹(Bambusa multiplex var． riviereorum)基因组 DNA 为模板，通过 PCＲ 扩增获得蛋白激
酶基因 BmPti1 的启动子片段，长度为 1 466 bp，通过 PlantCAＲE 启动子预测工具分析表明:该序列中
除含有 TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外，还发现 1 个参与生理周期调控的元件、1 个厌氧
诱导的顺式元件，1 个干旱诱导的 MYB结合位点、1 个光诱导 MYB位点、1 个水杨酸响应元件、1 个赤
霉素响应元件、1 个低温响应元件、2 个 ABA与 VP1 响应元件和 2 个激素响应元件．表明 BmPti1 基因
的表达可能受干旱、光照、氧气、低温等环境因子以及脱落酸、水杨酸、赤霉素等激素的调控．此外，推
测 BmPti1 基因的表达可能与植株的生理周期相关．
关键词:观音竹;蛋白激酶;启动子;序列分析
中图分类号:S795． 9 文献标识码:A 文章编号:1009 － 7821(2014)02 － 0108 － 06
Cloning and sequence analysis of the protein kinase gene BmPti1 promoter of
Bambusa multiplex var． riviereorum
WU You-rong1，ZHENG Yu-shan2
(1． Logistics Management Office，Minjiang University，Fuzhou，Fujian 350121，China;
2． Institute of Bamboo Ｒesearch，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:A promoter fragment of protein kinase gene BmPti1 was obtained by PCＲ using genomic
DNA template，1 466 bp in length． Sequence analysis showed that the promoter contained the basic
cis-acting elements of TATA-box and CAAT-box，a regulation element to participate in menstrual cy-
cles，an anaerobic-induced cis-acting element，a drought-induced MYB binding site，a light induced
MYB-bit，an ABA response element，a salicylic acid response element，a gibberellin response ele-
ment，a low temperature responsive element，two of ABA and VP1 response element and two hormone
response elements． That BmPti1 gene expression may be regulated by environmental factors such as
drought，light，oxygen，low temperature and abscisic acid，salicylic acid，gibberellin and other hor-
mones． In addition，BmPti1 gene expression may be related to the physiological cycle of plants．
Key words:Bambusadea multiplex var． riviereorum;protein kinase;promoter;sequence analysis
收稿日期:2013 － 11 － 26
作者简介:吴幼容(1974 －)，女，福建宁德人，闽江学院后勤管理处工程师，博士．
郑郁善(1960 －)，男，福建永泰人，福建农林大学竹类研究所教授．
·801·
第 2 期 吴幼容，等:观音竹蛋白激酶基因 BmPti1 启动子的克隆与序列分析
蛋白激酶又称蛋白质磷酸化酶，是一类催化蛋白质发生磷酸化反应的酶．它催化腺苷三磷酸
(ATP)上的 γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上，从而改变蛋白质构象，导致蛋白质功能
激活或失活．蛋白激酶在植物响应外界生物和非生物胁迫的特殊机制中发挥着重要的作用［1］，
因而备受关注．
Pto基因是从番茄(Lycopersion esculentum)中克隆到的抗丁香假单孢杆菌(Pseudomonas syin-
gaepv． tomato)的基因，编码一种细胞内的蛋白激酶［2 － 3］．它可以作为细胞内的一种受体蛋白，与
无毒蛋白 AvrPto相互作用，从而引发植物的抗病反应［4 － 5］．而 Pti1 (Pto-interacting 1)基因是 Pto
的互作基因，编码 Pto下游的一个蛋白，且 Pto-Pti互作可以引起植物的过敏性反应［6］． Pti1 的同
源基因在不同植物中广泛存在，例如水稻、拟南芥、玉米和大豆等． 目前对 Pti1 基因功能的研究
主要集中在抗病反应上，较少涉及其在非生物胁迫信号转导中的作用．笔者首次从观音竹(Bam-
busa multiplex var． riviereorum)叶片的均一化全长 cDNA文库中筛选获得一个类 Pti1 基因 BmPti1
(GenBank:JQ907320)． BmPti1 基因功能初步鉴定表明转 BmPti1 基因的水稻表现出较强的耐盐
性．为了进一步解析该基因及其编码的蛋白的功能，本研究对 BmPti1 基因的启动子进行了克隆
与序列分析．
1 材料与方法
1． 1 植物培养
选取健壮无病虫害的 1 年生观音竹苗栽植于装有沙子与黄泥土各 1 /2 的塑料钵中，每盆栽
2 株，在福建农林大学温室中培养．试验前摘取观音竹幼叶，迅速投入液氮，存于 － 80 ℃超低温冰
箱中，用于基因组 DNA提取．
1． 2 DNA的提取
采用 DNA提取试剂盒(BioFlux，Cat． No． BSC13S1)提取观音竹叶片 DNA，用 Thermo 公司
的核酸定量仪测定 DNA的纯度与浓度，并用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的质量．
1． 3 BmPti1 基因 5＇端启动子序列的克隆
采用 APAgeneTM GOLD Genome Walking Kits (BIO S＆T)进行染色体步移法克隆启动子． 首
先，根据已获得的 BmPti1 序列，设计 3 条巢式特异引物，分别为
GSPa:5 － CCACATAGTAACCCAACATCTCAACAAG －3;
GSPb:5 － CGTCCGTATGAACCTTCACCAATCAGAGCA －3;
GSPc:5 － CGTCAAACCCGCAATTACAACAGAACCA －3．
再依据试剂盒说明书，用试剂盒中的简并随机标签引物(degenerate random tagging primers，
DＲT)与以上的特异引物，进行 3 轮 PCＲ扩增后，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，用 DNA 凝胶回收
试剂盒进行目的条带的纯化回收，回收产物与 PMD18 － T Vector(购于 TaKaＲa 公司)连接过夜，
次日将连接产物化学转化到大肠杆菌 DH10B，在含有 Amp 的 LB /X － gal / IPTG培养基上进行蓝
白斑筛选，挑取白斑菌落进行摇菌过夜，PCＲ验证阳性克隆后，委托上海英骏生物技术有限公司
测序．
1． 4 启动子序列分析
测序后的序列经去除载体序列后，应用在线软件
PlantCAＲE(http:/ /bioinformatics． psb． ugent． be /webtools /plantcare /html /)分析启动子序列中
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闽江学院学报 2014 年
各功能元件．
2 结果与分析
叶片基因组 DNA用核酸定量仪测定浓度与纯度，显示测定的 DNA 的 A260 /A280 为 1． 8，
图 1 观音竹基因组 DNA(a)及 BmPti1 启动子第 3 轮 PCＲ
扩增产物(b)
Fig． 1 Agarose gel electrophoresis of total DNA from Bambusa multiplex
var． riviereorum young leaves(a)and the third round PCＲ prod-
uct of BmPti1 promoter (b)
A260 /A230 大于 2． 0，浓度为
238 ng·L －1，说明 DNA 的纯度
较高，没有酚、蛋白质及离子的
污染．经 1%琼脂糖凝胶电泳验
证(图 1(a)) ，显示一条清晰的
条带，表明 DNA 没有降解，没
有 ＲNA 污染，符合后续实验的
要求． 采用染色体步移方法进
行 3 轮 PCＲ 的扩增后，获得了
1 条大小约 1 500 bp 的特异性
片段，测序结果显示该特异性
片段大小为 1 527 bp．将克隆到
的序列与先前获得的 BmPti1
部分 5 端非编码区序列进行拼接，得到 BmPti1 基因起始密码子 ATG 上游长度为 1 466 bp 的启
动子序列(图 1(b))．
PlantCAＲE软件在线分析 BmPti1 基因启动子区域的功能元件，结果见图 2 与表 1．从图 2 可
以看出，BmPti1 基因启动子序列中含有 TATA-box、CAAT-box 等基本顺式作用元件;在此序列中
还发现有一个参与生理周期调控的顺式作用元件，表明 BmPti1 基因表达可能与植株的生理周期
相关;还有厌氧诱导的顺式元件，序列中还有 1 个干旱诱导的 MYB 结合位点、1 个光诱导 MYB
位点、1 个水杨酸响应元件、1 个赤霉素响应元件、1 个低温响应元件、2 个 ABA 与 VP1 响应元件
和 2 个激素响应元件．这些调控序列的存在表明 BmPti1 基因的表达可能受干旱、光照、氧气、低
温等环境因素以及脱落酸、水杨酸、赤霉素等激素的调控．此外，该序列中还发现一些光响应元件
如 CATT-motif、TCT-motif、Sp1 等．
3 讨论
Pti基因作为一类重要的蛋白激酶基因，自 1995 年首次从番茄中分离出以来，已相继在十几
种植物［7 － 10］中获得克隆，其在提高植物抗病，耐盐、耐干旱等方面起到至关重要的作用．大豆的
GmPti1 基因(GenBank:AY263347)受抗病信号分子水杨酸(SA)与伤害的诱导，且具有自我磷酸
化能力［11］．邵华文［12］从玉米中克隆的 ZmPti1 基因(GenBank:AY708048)，其表达受到 SA、低
温、高盐和甘露醇的诱导，且在玉米不同生育期、不同组织中有不同的表达模式．从玉米中获得的
ZmPti1 － 1 基因(GenBank:EF158035)受到 SA、甘露醇、NaCl、脱落酸(ABA)和 4 ℃低温的诱导
表达，并首次报道了过量表达 ZmPti1 － 1 增强了植物的耐旱性，表明 ZmPti1 － 1 基因响应生物胁
迫和非生物胁迫的诱导［13］．启动子是研究基因表达调控的一个重要工具，本研究克隆了BmPti1
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第 2 期 吴幼容，等:观音竹蛋白激酶基因 BmPti1 启动子的克隆与序列分析
(启动子基本元件用方框表示;其他调控元件用阴影表示;起始密码子用黑体表示)
图 2 观音竹 BmPti1 基因启动子序列及其功能元件
Fig． 2 Sequence of BmPti1 gene promoter and elements
·111·
闽江学院学报 2014 年
基因 5上游序列，通过 PlantCAＲE软件预测到该启动子具有基本转录元件 TATA-box 和 CAAT-
box，同时还发现多个与环境信号响应相关的元件．发现有一个参与生理周期调控的顺式作用元
表 1 应用 PlantCAＲE预测 BmPti1 基因启动子的顺式作用元件
Tab． 1 Cis-acting regulatory element analysis of BmPti1 gene promoter sequence by PlantCAＲE
位点或元件名称 核心序列 拷贝数 功能
CAAT-box GGCAAT 1 启动子区域顺式作用元件
CAAT 7
TATA-box TATA 5 转录起始 － 30 核心启动子元件
Skn-1_motif GTCAT 2 调控胚乳表达元件
CATT-motif GCATTC 2 部分光响应元件
TCA-element CCATCTTTTT 1 水杨酸响应元件
circadian CAANNNNATC 2 参与生理周期调控元件
MBS CGGTCA 1 MYB 类转录因子识别位点
MＲE AACCTAA 1 光响应相关的 MYB类转录因子识别位点
TATC-box TATCCCA 1 赤霉素响应元件
TCT-motif TCTTAC 1 部分光响应元件
Sp1 GGGCGG 1 光响应元件
AＲE TGGTTT 1 厌氧诱导必要的顺式作用元件
GC-motif CCCCCG 2 厌氧诱导元件
LTＲ CCGAAA 1 低温响应元件
CAT-box GCCACT 3 分生组织表达相关元件
CE3 GACGCGTGTC 2 VP1、ABA响应元件
TGA-element AACGAC 2 植物激素响应元件
件，表明 BmPti1 基因的表达与植株的生理周期相关;还有厌氧诱导的顺式元件，序列中还有 1 个
干旱诱导的 MYB结合位点、1 个光诱导 MYB位点、1 个水杨酸响应元件、1 个赤霉素响应元件、1
个低温响应元件、2 个 ABA与 VP1 响应元件和 2 个激素响应元件．这些潜在的与胁迫应答有关
的顺式作用元件，表明 BmPti1 基因的表达可能受干旱、光照、氧气、低温等环境因素以及脱落酸、
水杨酸、赤霉素等激素的调控．此外，该序列中还发现一些光响应元件如 CATT-motif、TCT-motif、
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第 2 期 吴幼容，等:观音竹蛋白激酶基因 BmPti1 启动子的克隆与序列分析
Sp1 等．序列分析结果暗示该启动子很可能是一个多胁迫诱导型启动子．至于这些作用元件是否
都能真正介导 BmPti1 对外界相关胁迫的应答，还需加以证实．基因的表达调控是一个非常复杂
的过程，只有将参与调控的顺式作用元件以及一些重要的转录因子的功能充分阐明后，BmPti1
基因启动子的调控机理才有可能得以清楚的解释． 后续工作还需将构建的 pBI-GS-GUS 植物表
达载体转入拟南芥或水稻中，获得稳定表达的转基因植株，从而探究 BmPti1 基因的表达调控情
况、组织定位及其在植物生物与非生物胁迫中转导的作用，进一步研究 BmPti1 基因启动子
功能．
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［责任编辑:金 甦］
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