全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１４（０８）：１００～１０４
第一作者简介：贾贤（１９８８－），男，硕士研究生，研究方向为热带林
木遗传育种。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｏｍｊｉｍ１００＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ．
责任作者：陈雄庭（１９５７－），男，博士，研究员，博士生导师，研究方
向为橡胶树细胞工程。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｘｔ６６９８８０６３＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：海南省重大科技攻关资助项目（ＺＤＺＸ２０１３０２３－１）。
收稿日期：２０１３－１２－０３
基于均匀设计法优化土沉香的组培再生体系研究
贾 　 贤１，２，贾 　 瑞１，２，王 　 颖２，吴 坤 鑫２，陈 雄 庭２
（１．海南大学 农学院，海南 海口５７０２２８；２．中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口５７１１０１）
　　摘　要：以带有腋芽的幼嫩土沉香茎段为外植体，运用ＤＰＳ数据处理系统，通过均匀设计法
筛选诱导土沉香茎段从出芽到生根整个再生体系的适宜培养基。结果表明：适宜土沉香茎段腋
芽萌发的培养基为７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ　０．３５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０１ｍｇ／Ｌ，诱导率为９３．３３％；适宜土沉
香出芽增殖的培养基为７／１０ＭＳ＋ＫＴ　１．２７ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ，增殖倍数为３．５３；适宜土沉
香茎段生根的培养基为７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ　０．０２ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　１．２３ｍｇ／Ｌ＋ＣＭ　２５ｍＬ／Ｌ，诱导率为
３３．３３％。该试验优化了土沉香茎段再生体系的培养条件，为其快速繁殖的推广及遗传转化体系
的建立提供了基础支持。
关键词：土沉香；组织培养；均匀设计；优化
中图分类号：Ｓ　７７２．３＋７　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１４）０８－０１００－０５
　　土沉香（Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．）属瑞香
科（Ｔｈｙｍｅｌａｅａｃｅａｅ）沉香属（Ａｑｕｉｌａｒｉａ　Ｌａｍ．）植物，又称
白木香（广州）、牙香树、女儿香（广东）、芫香（东莞）、香材
（海南）［１］、奇南栈、栈香（香栈）［２］、沉香［３］。沉香属植物
约１５种，分布于缅甸、泰国、越南、老挝、柬埔寨、印度东
北部及不丹、马来半岛、苏门答腊、加里曼丹等地。我国
有２种，分别为土沉香和云南沉香，其中土沉香分布在
海南、广东、广西、福建等地，云南沉香主要产于云南（西
双版纳及临沧地区）［４］。
土沉香树干经真菌侵染或物理、化学等因素的伤
害，会分泌出树脂，沉于土下，日久堆积，即形成了一种
天然珍贵的药材—沉香。其味辛、苦，微温，具有降气调
中、暖肾止痛的功效。可用于治疗胸腹疼痛、胸闷、呕吐
呃逆、腹鸣泄泻以及气逆喘促等症状［５］。同时沉香的提
取物又被作为一种天然香料用于香水、香皂等高档化妆
品。土沉香树皮纤维发达，是良好的人造棉和纸生产的
原料。其木材也可以做建筑材料用。研究表明，沉香有
一定的抗癌活性［６］。但是随着消费水平的提高，沉香的
供应量不足等原因，导致沉香价格日益增高，Ｂａｒｄｅｎ
等［７］曾报道沉香最终卖到了１０　０００美元／ｋｇ。加之自然
环境和人为的破坏，土沉香资源量日益枯竭，１９８７年与
１９９９年分别将沉香列为国家珍稀濒危三级保护植物［８］
和国家二级重点保护野生植物［９］。
目前国内外已有不少关于利用土沉香不同组织进
行组织快繁体系研究的报道［１０－１６］，但是不同报道对于相
同材料所得出的激素浓度差异较大。该研究在前人研
究基础上，利用均匀设计法对土沉香茎段诱导出芽、芽
的增殖生长以及茎段的生根培养基进行筛选，以期为提
高优质土沉香组培苗的生产率提供技术依据。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试土沉香茎段采摘于中国热带农业科学院苗圃
内无病虫害的优良土沉香实生植株。于２０１２年９月某
连续３ｄ晴朗的下午１５：００左右，从高１ｍ以上的枝条上
剪取约１０ｃｍ带有叶芽的幼嫩茎段，立即放入冰盒中带
回实验室备用。
１．２　试验方法
１．２．１　外植体材料的消毒　将采摘回来的茎段剪去叶
子，保留约０．３ｃｍ长的叶柄以保护腋芽。在试验前，先
用酒精棉球擦洗茎段表面的灰尘，洗衣粉水溶液浸泡
２０ｍｉｎ后，用流水冲洗干净，在超净工作台中用７５％酒
精浸泡３０ｓ，无菌水冲洗１次，再用加入若干滴吐温－２０
的０．１％ ＨｇＣｌ２消毒８ｍｉｎ，最后用无菌水冲洗４～５次，
直至洗去表面消毒液为止。将材料置于无菌滤纸上，吸
取残余水分，用医用手术刀切去消毒液与材料接触的部
分，约０．５ｃｍ，将茎段切成包含有腋芽的约２ｃｍ左右长
的小段，插入到不添加任何激素的１／２ＭＳ培养基中培养
７ｄ，以获取无菌材料。
１．２．２　诱导土沉香茎段出芽培养基的筛选　设１／５ＭＳ、
２／５ＭＳ、３／５ＭＳ、４／５ＭＳ、ＭＳ　５种基本培养基，添加浓度
范围分别为０．０１～１．０ｍｇ／Ｌ 的６－ＢＡ 和０．０１～
０．１ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ的进行研究。利用ＤＰＳ数据处理系
００１
北方园艺２０１４（０８）：１００～１０４ ·生物技术·
统的混合水平均匀设计试验功能（ｎ＜２５５）设计１０个试
验组的Ｕ１０（５×１０２）均匀表（表１），１４ｄ后进行观察统
计，以考察ＭＳ大量元素和６－ＢＡ、ＮＡＡ对土沉香茎段腋
芽萌发启动率的影响。
表１ 土沉香茎段芽诱导的
Ｕ１０（５×１０２）因素及水平设计
　　Ｔａｂｌｅ　１ Ｕ１０（５×１０２）Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ
ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｂｕｄｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ／ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ（ｘ１） ６－ＢＡ（ｘ２） ＮＡＡ（ｘ３）
１　 １／５　 ０．３４　 ０．０７
２　 １／５　 ０．８９　 ０．０２
３　 ２／５　 ０．０１　 ０．０５
４　 ２／５　 ０．５６　 ０．１０
５　 ３／５　 ０．７８　 ０．０８
６　 ３／５　 ０．２３　 ０．０３
７　 ４／５　 １．００　 ０．０６
８　 ４／５　 ０．４５　 ０．０１
９　 １　 ０．１２　 ０．０９
１０　 １　 ０．６７　 ０．０４
１．２．３　诱导土沉香茎段芽的增殖培养基的筛选　依据
上述诱导出芽培养基的结果分析，设计以７／１０ＭＳ为基
本培养基，添加ＫＴ浓度为０．１５～１．５０ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ浓
度为０．０２～０．２０ｍｇ／Ｌ，ＧＡ３ 浓度为０．１０～１．００ｍｇ／Ｌ
的激素组合。利用ＤＰＳ数据处理系统的均匀设计试验
功能设计１０个试验组的Ｕ１０（１０３）均匀表（表２），６０ｄ后
进行观察统计，以考察６－ＢＡ、ＮＡＡ以及ＧＡ３ 对土沉香
茎段出芽增殖倍数的影响。
表２ 土沉香茎段芽增殖的
Ｕ１０（１０３）因素及水平设计
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｕ１０（１０３）Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ
ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｂｕｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ／ｍｇ·Ｌ－１
ＫＴ（ｘ１） ＮＡＡ（ｘ２） ＧＡ３（ｘ３）
１　 ０．１５　 ０．１４　 ０．６０
２　 ０．３０　 ０．０６　 ０．３０
３　 ０．４５　 ０．１８　 ０．９０
４　 ０．６０　 ０．１０　 ０．１０
５　 ０．７５　 ０．０２　 ０．７０
６　 ０．９０　 ０．２０　 ０．４０
７　 １．０５　 ０．０８　 １．００
８　 １．２０　 ０．１６　 ０．２０
９　 １．３５　 ０．０４　 ０．５０
１０　 １．５０　 ０．１２　 ０．８０
１．２．４　诱导土沉香茎段生根培养基的筛选　同样依据
上述诱导出芽培养基的结果分析，设计以７／１０ＭＳ为基
本培养基，添加６－ＢＡ浓度为０．０２～０．２０ｍｇ／Ｌ，ＩＢＡ浓
度为０．２～２．０ｍｇ／Ｌ，椰乳浓度为５～２５ｍＬ／Ｌ。利用
ＤＰＳ数据处理系统的均匀设计实验功能设计１０个试验
组的Ｕ１０（５×１０２）均匀表（表３）。利用间接生根法，１４ｄ
后将无菌苗转入到只附加有１ｇ／Ｌ活性炭的７／１０ＭＳ培
养基中，６０ｄ后进行观察统计，以考察６－ＢＡ、ＮＡＡ以及
椰乳对土沉香茎段生根诱导率的影响。
表３ 土沉香茎段生根的
Ｕ１０（５×１０２）因素及水平设计
　　Ｔａｂｌｅ　３ Ｕ１０（５×１０２）Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ
ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ
６－ＢＡ（ｘ１）／ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ（ｘ２）／ｍｇ·Ｌ－１　 ＣＭ（ｘ３）／ｍＬ·Ｌ－１
１　 ０．０２　 １．００　 １０．００
２　 ０．０４　 １．８０　 ２５．００
３　 ０．０６　 ０．６０　 １５．００
４　 ０．０８　 １．４０　 ５．００
５　 ０．１０　 ０．２０　 ２０．００
６　 ０．１２　 ２．００　 １０．００
７　 ０．１４　 ０．８０　 ２５．００
８　 ０．１６　 １．６０　 １５．００
９　 ０．１８　 ０．４０　 ５．００
１０　 ０．２０　 １．２０　 ２０．００
１．２．５　练苗与移栽　将高约５ｃｍ、长约３ｃｍ左右的根
的组培苗从培养箱中取出，放置于室外较为阴凉的地方
约７ｄ时间，每隔１ｄ将瓶盖开口打开一点，以使组培
苗适应外界环境，待全部打开时，用自来水将组培苗根
部残留的培养基洗去，用０．５ｇ／Ｌ的甲基托布津浸泡
２０ｍｉｎ，最后植入经灭菌的蛭石∶细河砂＝１∶１的混合
基质中，用透明塑料杯覆盖以达到保湿保温的作用，１个
月后统计移栽成活率。以上所有设计的培养基均添加
蔗糖３０ｇ／Ｌ，琼脂７ｇ／Ｌ，ｐＨ调至５．８左右，在温度为
（２６±１）℃、光照强度为１　５００ｌｘ、光照周期８ｈ／ｄ的条件
下培养。每组接种３０个无菌材料，重复３次取平均值。
１．３　数据分析
试验数据采用ＤＰＳ　９．５０数据处理系统利用二次多
项式逐步回归进行回归分析，求得回归方程，并找到最
优解的组合加以验证［１７］。
腋芽萌发启动率（％）＝外植体腋芽萌发数／接种外
植体数×１００％；增殖倍数＝增殖周期结束时芽数／增殖
周期开始时芽数；生根诱导率（％）＝生根苗数／总苗
数×１００％；移栽成活率（％）＝成活苗数／移栽总苗
数×１００％。
２　结果与分析
２．１　诱导土沉香茎段出芽培养基的筛选
通过ＤＰＳ进行二次多项式逐步回归分析得到回归
方程：Ｙ＝－５６．７１＋３５３．９０Ｘ１＋１３８．９５Ｘ２－２２７．１８Ｘ１２－
９９．１８Ｘ２２－９８．２３Ｘ１Ｘ２－１７９．２６Ｘ１Ｘ３；其中Ｆ（０．０１，６，３）＝
２７．９１，Ｆ值＝４３．５１２０＞Ｆ（０．０１，６，３），Ｐ值＝０．００５２＜０．０１，
复相关系数Ｒ＝０．９９４３，调整相关系数Ｒａ＝０．９８２８，剩
余标准差ＳＳＥ＝３．８２６，决定系数Ｒ２＝０．９８８７，调整决定
系数Ｒａ２＝０．９６５９，表明回归方程有意义，可用于预测。
通过比较各变量显著水平值的大小，可以知道对土沉香
茎段出芽诱导率的影响大小顺序为Ｘ１＞Ｘ１２＞Ｘ２＞
Ｘ２２＞Ｘ１Ｘ２＞Ｘ１Ｘ３，说明Ｘ１（ＭＳ培养基的大量元素）和
Ｘ２（６－ＢＡ浓度）对于结果的影响较大。根据回归方程求
出Ｙ的最优组合为：Ｘ１＝０．７０，Ｘ２＝０．３５，Ｘ３＝０．０１。在
１０１
·生物技术· 北方园艺２０１４（０８）：１００～１０４
此组合基础上求得最优解：ｙ＝９０．８６，此解为该回归方
程的解析解。根据公式Ｙ＝ｙ±ｕα·ｓ（其中ｕα为正态分
布的双侧分位数，ｓ为剩余标准差）得到优化值区间估计
为Ｙ＝９０．８６±１４．１８，即７６．６８％ ～１０５．０４％。采用最优
组合加以验证，将土沉香茎段接种到７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ
０．３５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０１ｍｇ／Ｌ的培养基中，１４ｄ后进行
观察统计，土沉香出芽诱导率为９３．３３％，在预测的优化
值区间范围，且高于１０个组合中的最大值，表明在该试
验所设计浓度范围内诱导土沉香茎段出芽的最佳培养
基为７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ　０．３５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０１ｍｇ／Ｌ。
３０ｄ后，土沉香出芽叶片约３～４片，且茎段基部略有膨
大（图１Ａ）。
表４ 土沉香茎段芽诱导的
Ｕ１０（５×１０２）均匀设计处理与结果
　　Ｔａｂｌｅ　４　　 　Ｕ１０（５×１０２）ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｅｓｔ　ｐｌａｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｏｒ
　　　　　ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｂｕｄｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
因素
Ｆａｃｔｏｒｓ／ｍｇ·Ｌ－１
Ｘ１（ＭＳ） Ｘ２（６－ＢＡ） Ｘ３（ＮＡＡ）
启动率Ｙ
Ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ
ｓｔａｒｔｉｎｇ　Ｙ／％
１　 １／５　 ０．３４　 ０．０７　 ３１．１１
２　 １／５　 ０．８９　 ０．０２　 ３１．９０
３　 ２／５　 ０．０１　 ０．０５　 ４４．４４
４　 ２／５　 ０．５６　 ０．１０　 ６８．８９
５　 ３／５　 ０．７８　 ０．０８　 ６２．９１
６　 ３／５　 ０．２３　 ０．０３　 ８６．６７
７　 ４／５　 １．００　 ０．０６　 ３５．５６
８　 ４／５　 ０．４５　 ０．０１　 ８５．３１
９　 １　 ０．１２　 ０．０９　 ５７．３２
１０　 １　 ０．６７　 ０．０４　 ４５．５６
　　注：Ｘ１表示ＭＳ培养基的大量元素量取倍数；Ｘ２表示６－ＢＡ浓度；Ｘ３表示ＮＡＡ
浓度；Ｙ为３次重复试验除去褐化及污染后的平均值统计。
２．２　诱导土沉香茎段芽的增殖培养基的筛选
当新生茎段长至约３ｃｍ时（图１Ｂ），切除基部的老
茎段，再转至设计诱导茎段芽增殖的培养基中。
通过ＤＰＳ进行二次多项式逐步回归分析得到回归
方程：Ｙ＝０．３６＋４．５４Ｘ１－２．１２Ｘ１２＋２．８１Ｘ１Ｘ２；其中
Ｆ（０．０１，３，６）＝９．７８，Ｆ 值＝３０．３６０６＞Ｆ（０．０１，３，６），Ｐ 值＝
０．０００５＜０．０１，复相关系数Ｒ＝０．９６８６，调整相关系数
Ｒａ＝０．９５２５，剩余标准差ＳＳＥ＝０．２２７４，决定系数Ｒ２＝
０．９３８２，调整决定系数Ｒａ２＝０．９０７３，表明回归方程有意
义，可用于预测。通过比较各变量显著水平值的大小，
可以知道对土沉香茎段出芽增殖倍数的影响大小顺序
为Ｘ１＞Ｘ１２＞Ｘ１Ｘ２，说明Ｘ１（ＫＴ浓度）对于结果的影响
较大，Ｘ３（ＧＡ３浓度）对于结果的影响较小。根据回归方
程求出Ｙ的最优组合为Ｘ１＝１．２７，Ｘ２＝０．２。在此组合
基础上求得最优解：ｙ＝３．３９，此解为该回归方程的解析
解。根据公式Ｙ＝ｙ±ｕα·ｓ（其中ｕα为正态分布的双侧
分位数，ｓ为剩余标准差）得到优化值区间估计为Ｙ＝
３．３９±１．３３，即２．０６～４．７２。采用最优组合加以验证，将
土沉香出芽茎段接种到７／１０ＭＳ＋ＫＴ　１．２７ｍｇ／Ｌ＋
ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ的培养基中，６０ｄ后进行观察统计，土沉
香芽的增殖倍数为３．５３，在预测的优化值区间范围，且
高于１０个组合中的最大值，表明在该试验所设计浓度
范围内诱导土沉香茎段芽增殖最佳培养基为７／１０ＭＳ＋
ＫＴ　１．２７ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ。接种后约２０ｄ，茎段
明显长高增粗（图１Ｃ），并在基部产生丛生小芽，每隔
３０ｄ用此培养基继代一次，约６５ｄ新生叶片长大（图
１Ｄ）。
表５ 土沉香茎段芽增殖的
Ｕ１０（１０３）因素及水平设计
　　Ｔａｂｌｅ　５　　 　　Ｕ１０（１０３）ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｅｓｔ　ｐｌａｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｏｒ
　　　　　ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｂｕｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
因素
Ｆａｃｔｏｒｓ／ｍｇ·Ｌ－１
Ｘ１（ＫＴ） Ｘ２（ＮＡＡ） Ｘ３（ＧＡ３）
增殖倍数Ｙ
Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ
ｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ　Ｙ
１　 ０．１５　 ０．１４　 ０．６０　 １．１０
２　 ０．３０　 ０．０６　 ０．３０　 １．７８
３　 ０．４５　 ０．１８　 ０．９０　 ２．０９
４　 ０．６０　 ０．１０　 ０．１０　 ２．１７
５　 ０．７５　 ０．０２　 ０．７０　 ２．４８
６　 ０．９０　 ０．２０　 ０．４０　 ３．３０
７　 １．０５　 ０．０８　 １．００　 ３．２９
８　 １．２０　 ０．１６　 ０．２０　 ３．４２
９　 １．３５　 ０．０４　 ０．５０　 ２．８４
１０　 １．５０　 ０．１２　 ０．８０　 ２．７０
　　注：Ｘ１表示ＫＴ浓度；Ｘ２表示ＮＡＡ浓度；Ｘ３表示ＧＡ３浓度；Ｙ为３次重复试
验除去褐化及污染后的平均值统计。
２．３　诱导土沉香茎段生根培养基的筛选
通过ＤＰＳ进行二次多项式逐步回归分析得到回归
方程：Ｙ＝－１０．１６－３４．３９Ｘ１＋５３．２０Ｘ２－２２．８４Ｘ２２＋
０．１４Ｘ２Ｘ３；其中Ｆ（０．０１，４，５）＝１１．３９，Ｆ值＝１６．１６＞Ｆ（０．０１，４，５），
Ｐ值＝０．００４６＜０．０１，复相关系数Ｒ＝０．９６３４，调整相关
系数Ｒａ＝０．９３３１，剩余标准差ＳＳＥ＝３．０３９３，决定系数
Ｒ２＝０．９２８２，调整决定系数Ｒａ２＝０．８７０７，表明回归方程
有意义，可用于预测。通过比较各变量显著水平值的大
小，可以知道对土沉香茎段生根率的影响大小顺序为
Ｘ２＞Ｘ２２＞Ｘ１＞Ｘ２Ｘ３，说明Ｘ１（６－ＢＡ浓度）和Ｘ２（ＩＢＡ
浓度）对于结果的影响较大。根据回归方程求出Ｙ的最
优组合为Ｘ１＝０．０２，Ｘ２＝１．２３，Ｘ３＝２５。在此组合基础
上求得最优解：ｙ＝２７．３４，此解为该回归方程的解析解。
根据公式Ｙ＝ｙ±ｕα·ｓ（其中ｕα为正态分布的双侧分位
数，ｓ为剩余标准差）得到优化值区间估计为Ｙ＝２７．３４±
１３．９９，即１３．３５～４１．３３。采用最优组合加以验证，将土沉
香茎 段 接 种 到 ７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ　０．０２ ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ
１．２３ｍｇ／Ｌ＋ＣＭ　２５ｍＬ／Ｌ的培养基中（图１Ｅ），利用间接
生根法，１４ｄ后将无菌苗转入空白的附加活性炭１ｇ／Ｌ，蔗
糖３０ｇ／Ｌ，琼脂７ｇ／Ｌ，ｐＨ调节至５．８左右的７／１０ＭＳ
培养基，６０ｄ后进行观察统计（图１Ｆ），土沉香茎段的生
根率为３３．３３％，在预测的优化值区间范围，且高于１０个
组合中的最大值，表明在该试验所设计浓度范围内诱导
土沉香茎段生根的最佳培养基为７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ
０．０２ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　１．２３ｍｇ／Ｌ＋ＣＭ　２５ｍＬ／Ｌ。
２０１
北方园艺２０１４（０８）：１００～１０４ ·生物技术·
表６ 土沉香茎段生根的
Ｕ１０（５×１０２）因素及水平设计
　　Ｔａｂｌｅ　６ Ｕ１０（５×１０２）ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｔｅｓｔ　ｐｌａｎ　ａｎｄ
ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｏｒ　ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ
Ｘ１（６－ＢＡ）
／ｍｇ·Ｌ－１
Ｘ２（ＩＢＡ）
／ｍｇ·Ｌ－１
Ｘ３（ＣＭ）
／ｍＬ·Ｌ－１
诱导率Ｙ
Ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ／％
１　 ０．０２　 １．００　 １０．００　 ２１．７５
２　 ０．０４　 １．８０　 ２５．００　 １６．６７
３　 ０．０６　 ０．６０　 １５．００　 １０．００
４　 ０．０８　 １．４０　 ５．００　 １８．８９
５　 ０．１０　 ０．２０　 ２０．００　 ０．００
６　 ０．１２　 ２．００　 １０．００　 １．１１
７　 ０．１４　 ０．８０　 ２５．００　 １３．４５
８　 ０．１６　 １．６０　 １５．００　 １７．７８
９　 ０．１８　 ０．４０　 ５．００　 ０．００
１０　 ０．２０　 １．２０　 ２０．００　 １７．７８
　　注：Ｘ１表示６－ＢＡ浓度；Ｘ２表示ＩＢＡ浓度；Ｘ３表示ＣＭ浓度；Ｙ 为３次重复试
验除去褐化及污染后的平均值统计。
图１　不同阶段培养基的筛选
注：Ａ：茎段的出芽；Ｂ～Ｃ：芽茎的伸长；Ｄ：继代增殖；Ｅ～Ｆ：间接生根
初期与末期的生根情况；Ｇ：移栽。
Ｆｉｇ．１　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ
Ｎｏｔｅ：Ａ：Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ｓｅｇｍｅｎｔ；Ｂ～Ｃ：Ｂｕｄｓ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ；Ｄ：
Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ；Ｅ～Ｆ：Ｒｏｏｔ　ｉｎｄｕｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ；Ｇ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ．
２．４　移栽与练苗
将长势良好的生根组培苗放置于室外，１个月后统
计移栽成活率达到８５％以上（图１Ｇ）。
３　讨论
对于土沉香的组织培养已有前人通过茎段、叶片、
胚等组织进行了研究。多数研究发现连续在以１／２ＭＳ
培养基为基本培养基，添加适当浓度激素的条件下适宜土
沉香组培苗的生长，但所报道使用的同种激素浓度却相差
较大。该研究发现，７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ　０．３５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．０１ｍｇ／Ｌ培养基对于土沉香茎段芽的诱导具有显著
的效果，其中ＭＳ培养基的大量元素对于芽的诱导影响
较大，当用ＭＳ为基本培养基时，接种的茎段在８ｈ内即
显现褐化现象，而采用该试验设计预测的７／１０ＭＳ则能
有效降低褐化的发生率。低浓度的６－ＢＡ对于土沉香茎
段芽的诱导具有促进作用，当单独将６－ＢＡ浓度提高至
２．０ｍｇ／Ｌ时，土沉香茎段出现严重褐化，材料死亡，虽偶
尔有少量未褐化或褐化较轻的茎段也能诱导出芽，但常
常伴随着畸形、玻璃化的现象发生，此现象与何旭君
等［１８］研究发现的问题相符。在研究芽的增殖时发现芽
的数量随着细胞分裂素ＫＴ浓度的提高而增加，但是过
高浓度的ＫＴ也会造成芽的长势细弱，并且ＫＴ与ＮＡＡ
之间存在相互作用，当二者浓度接近时易产生愈伤组
织，不利于芽的增殖。因此，在该试验设计浓度的范围
内诱导土沉香茎段芽增殖的最佳培养基为７／１０ＭＳ＋
ＫＴ　１．２７ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ。
木本植物组培生根困难一直是个普遍的现象，该试
验采用的间接生根法对于诱导土沉香茎段无菌苗生根
具有较好的效果，而且在接入生根培养基前先切除茎段
基部所产生的愈伤组织将更利于根的生成。因为在高
浓度生长素的培养基里诱导茎段生根往往会使其基部
膨大并产生愈伤组织，通过该试验发现，倘若不切除愈
伤组织，根虽然也能从愈伤组织中产生，但在练苗时，根
也易同愈伤组织一起脱落，造成幼苗的死亡，这可能和
根系与茎段的疏导组织不相通或连接错位有关，此结果
与顾地周等［１９］、Ｄａｎｉｅｌｅ等［２０］研究中所发现的情况相
似。采用间接生根法得到的生根苗效果明显优于直接
生根法，可能是由于无菌苗短时间内在含有较高浓度
ＩＢＡ的培养基中生长，改变了其内源ＩＡＡ的水平，从而
启动根原基的发生，而后期的根原基伸长和根的生长则
不再需要外源生长素的维持。这种方法在檀香［２１］、核
桃［２２］、烟草［２３］、扁桃［２４］、樱桃矮砧［２５］等一些温带果树和
较难诱导生根的木本植物培养中都得到了应用，或许将成
为解决木本植物生根的一种适合途径。该试验不高的生
根率可能和选取的无菌苗较为幼嫩或与不同种源的土沉
香有关［２６］，也有可能和光周期有关，具体原因有待进一步
研究。由结果和验证试验表明，该试验设计浓度范围内所
３０１
·生物技术· 北方园艺２０１４（０８）：１００～１０４
筛选出的诱导土沉香茎段生根的最佳培养基为７／１０ＭＳ＋
６－ＢＡ　０．０２ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　１．２３ｍｇ／Ｌ＋ＣＭ　２５ｍＬ／Ｌ。
近年来，虽然叶勤法等［１１－１２］、何旭君等［１８］、汪腾
越［２６］先后对于土沉香组培的研究进行了报道，但是大规
模的土沉香组培苗工厂化生产并不成熟，特别是土沉香
组培苗的生根率没有得到较好的提高。因此仍有必要
对于土沉香的组织培养进行深入研究。应用均匀设计
法对土沉香茎段诱导再生体系培养基的设计方案大大
缩短了筛选时间。该试验通过优化土沉香茎段再生体
系的培养条件，为土沉香的组培大规模工厂化生产以及
为其遗传转化体系的建立提供了技术依据。
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Ａｑｕｉｌａｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ＪＩＡ　Ｘｉａｎ１，２，ＪＩＡ　Ｒｕｉ　１，２，ＷＡＮＧ　Ｙｉｎｇ２，ＷＵ　Ｋｕｎ－ｘｉｎ２，ＣＨＥＮ　Ｘｉｏｎｇ－ｔｉｎｇ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｈａｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ　５７０２２８；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡＴＡＳ，Ｈａｉｋｏｕ，
Ｈａｉｎａｎ　５７１１０１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．ａｓ　ｅｘｐｌａｎｔｓ，ｕｓｉｎｇ　ＤＰＳ，ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｓｈｏｏｔ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｕｎｉｆｏｒｍ　ｄｅｓｉｇｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　７／１０ＭＳ＋
６－ＢＡ　０．３５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０１ｍｇ／Ｌ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｂｕｄｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｓｔａｒｔｉｎｇ　ｗａｓ　９３．３３％；ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ
７／１０ＭＳ＋ＫＴ　１．２７ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｂｕｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ　ｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｗａｓ　３．５３；
ｔｈｅ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　７／１０ＭＳ＋６－ＢＡ　０．０２ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　１．２３ｍｇ／Ｌ＋ＣＭ　２５ｍＬ／Ｌ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒａｔｅ
ｏｆ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　３３．３３％．Ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ａｑｕｉｌａｒｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．ｗａｓ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ．
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