全 文 ：第 44 卷第 4 期
2014 年 4 月
日 用 化 学 工 业
China Surfactant Detergent ＆ Cosmetics
Vol． 44 No． 4
April 2014
收稿日期:2013 － 10 － 08;修回日期:2014 － 03 － 16
作者简介:付警辉(1988 －)，女，吉林人，硕士研究生，电话:13844032863。
通讯联系人:刘文丛，教授，博士，硕士生导师，电话:13804460499，E － mail:jwlw6803@ 126． com。
落叶松中花旗松素对酪氨酸酶的抑制作用
付警辉，柴 婧，韩佳彤，刘文丛
(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)
摘要:以 L －多巴为底物，熊果苷和 2，6 －二叔丁基 － 4 －甲基苯酚(BHT)为阳性对照，研究了长白落叶松花旗松素对酪
氨酸酶的抑制作用，并与兴安落叶松花旗松素进行了对比。结果表明，质量浓度在 0. 001 ～ 0. 01 g·L －1时，长白落叶松
花旗松素对酪氨酸酶的抑制作用高于兴安落叶松花旗松素。长白落叶松花旗松素，低质量浓度时，纯度越高，对酪氨酸
酶的抑制作用越强;高质量浓度时，纯度越高，抑制作用越弱。长白落叶松花旗松素对酪氨酸酶表现为竞争性抑制，抑制
常数 KI = 0. 017。
关键词:化妆品;花旗松素;酪氨酸酶;长白落叶松
中图分类号:TQ658 文献标识码:A 文章编号:1001 － 1803(2014)04 － 0218 － 04
DOI:10． 13218 / j． cnki． csdc． 2014． 04． 049
Inhibitory effect of taxifolin in Larix olgensis on tyrosinase
FU Jing － hui，CHAI Jing，HAN Jia － tong，LIU Wen － cong
(College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China)
Abstract:Taking L － DOPA as substrate，arbutin and BHT as positive controls，the inhibitory effect on
tyrosinase of the taxifolin in Larix olgensis was studied and compared with that in Larix gmelini． Ｒesults showed
that，when the mass concentration of taxifolin is 0. 001 － 0. 01 g·L －1，the inhibitory effect of taxifolin in Larix
olgensis is higher than that in Larix gmelini on tyrosinase． For Larix olgensis，under low mass concentration
range condition，the higher purity of taxifolin，the stronger inhibitory effect on tyrosinase;while under high mass
concentration range condition，the higher purity of taxifolin，the weaker inhibitory effect on tyrosinase． Taxifolin
in Larix olgensis shows competitive inhibition mechanism for tyrosinase with an inhibition constant KI of 0. 017．
Key words:cosmetics;taxifolin;tyrosinase;Larix olgensis
酪氨酸酶又称多酚氧化酶，广泛存在于动植物体
和人体内，是生物体合成黑色素的关键酶［1 － 2］。在黑
色素合成过程中，酪氨酸酶、二羟基吲哚羧酸氧化酶和
多巴素互变酶等酶类起着重要的调节作用［3］。酪氨
酸酶的催化作用主要有 L －酪氨酸的羟化和 L －多巴
的氧化这 2 类［4］。
黑色素细胞分布在人的表皮基底层细胞间，其含
有的酪氨酸酶可以将酪氨酸氧化为多巴并继而氧化为
多巴醌，最终形成黑色素［5］。因此，抑制了酪氨酸酶
的活性，也就是抑制了黑色素的形成。随着人们对皮
肤美白化妆品及其安全性的关注，科研人员开始尝试
从天然植物中寻找具有美白作用的成分，众多的天然
酪氨酸酶抑制剂被应用于美白化妆品中［6］。
花旗松素又被称作二氢槲皮素、双氢栎精或(2Ｒ，
3Ｒ)－二氢槲皮素。花旗松素最早由 Fukui 等［7］从针
叶植物叶中提取出来，为淡黄色粉末，在体积分数为
50%的乙醇中有白色针状结晶，熔点 240 ℃;易溶于乙
酸、乙醇、沸水等，稍溶于冷水，几乎不溶于苯［8］;其分
子式为 C15 H12 O7，相对分子质量为 304. 25，分子结构
如下所示:
目前已经发现 50 多种植物中含有花旗松素，如鬼
箭羽［9］、水红花子［10 － 12］、水飞蓟［13］等，特别是在落叶
松中含量非常高［14］，但关于落叶松中花旗松素对酪氨
·812·
第 4 期 付警辉，等:落叶松中花旗松素对酪氨酸酶的抑制作用 开发与应用
酸酶抑制作用的研究还比较少。鉴于此，笔者对长白
落叶松与兴安落叶松中的花旗松素对酪氨酸酶的抑制
作用进行研究，以期为花旗松素应用于美白化妆品中
奠定一定的理论基础。
1 实验部分
1. 1 主要试剂和仪器
长白落叶松，吉林省临江地区;甲醇，色谱纯，美国
Tedia公司;L －多巴(DOPA)，w≥99%，广州齐云生物
技术有限公司;熊果苷，w = 99%，常州龙腾生物科技
有限公司;酪氨酸酶(25 kU) ，上海宝曼生物科技有限
公司;2，6 － 二叔丁基 － 4 － 甲基苯酚(BHT) ，w =
99%，成都格雷西亚化学技术有限公司;三重水，实验
室自制;柱层析聚酰胺树脂，沧州宝恩吸附材料有限公
司;兴安落叶松花旗松素，w = 92%，俄罗斯 Ametis JSC
公司;其他试剂均为市售分析纯。LC － 2010A 高效液
相色谱仪、LC solution工作站、SPD －20A紫外检测器，
日本岛津公司;FW400A高速万能粉碎机，北京科伟永
兴仪器有限公司;DPE － 2110 旋转蒸发仪，日本 Eyela
公司;SpectraMax Plus384 连续光谱扫描式酶标仪，美
国分子生物仪器公司;移液器(1 ～ 100 μL 和 100 ～
1 000 μL)，芬兰 BioHit公司。
1. 2 长白落叶松花旗松素的提取和纯化
将长白落叶松粉碎，过 40 目筛，取 40 目以下的木
屑 200 g放入圆底烧瓶中，加入体积分数为 80%的乙
醇 2 L，在 80 ℃的水浴锅中回流提取 2 h。提取液过
滤，在滤渣中再次加入 80%的乙醇 2 L，回流提取 2 h，
合并滤液，减压蒸馏回收溶剂。
将回收溶剂后的滤液过聚酰胺树脂，用体积分数
为 50%的乙醇洗脱，以薄层色谱(TLC)对洗脱液进行
检识，将含有花旗松素的洗脱液收集，减压蒸馏回收溶
剂，得到花旗松素的浓缩液。在 95 ℃下用三重水稀
释，过滤，除去不溶于水的杂质。滤液放在 4 ℃的冰箱
中结晶，重结晶 2 次后，取少量的样品，烘干，得到花旗
松素粉末 0. 2 g，经过高效液相色谱检测，纯度为
78%。将剩余的样品进行第三次重结晶，烘干，得到花
旗松素粉末 2. 1 g，经过高效液相色谱检测，纯度为
92%。2 种样品均置于干燥箱中备用。
1. 3 酪氨酸酶抑制率测试
1. 3. 1 溶液的配制
供试品溶液:将从长白落叶松中得到的纯度为
78%和 92%的花旗松素和纯度为 92%的兴安落叶松
花旗松素分别用体积分数为 70%的乙醇配制成质量
浓度为 0. 001，0. 01 和 0. 1 g·L －1的供试品溶液备用。
阳性对照品溶液:将阳性对照品熊果苷和 BHT用
70%的乙醇配制成质量浓度分别为 0. 001，0. 01 和
0. 1 g·L －1的阳性对照品溶液备用。
磷酸缓冲液:配制甲、乙2种溶液，甲溶液为 9. 200 g·
L －1的磷酸二氢钠水溶液，乙溶液为11. 864 g·L －1的
磷酸氢二钠水溶液，甲、乙 2 种溶液各取 50 mL混合搅
拌均匀，即得到 pH =6. 8 的磷酸缓冲液。
酪氨酸酶溶液:精确称取酪氨酸酶(25 kU)
0. 012 3 g，用磷酸缓冲液定容至 25 mL 的容量瓶中，
即得到 46 U·mL －1的酪氨酸酶溶液。
1. 3. 2 抑制酪氨酸酶活性的测定
测定方法参考文献［15］，稍作修改。使用 96 孔
板，4 孔设计，其中第 1，2，3 和 4 孔中含有的物质如表
1 所示。每个测试孔中首先加入 2. 5 mmol·L －1的
L － DOPA磷酸缓冲液 40 μL，待所有物质加入后，轻轻
振荡使溶液混匀。23 ℃下静置 10 min，然后在 475 nm
处测定吸光度(A) ，重复 3 次取平均值，使用 SPSS17. 0
软件处理数据。根据以下公式计算酪氨酸酶的抑制率(I):
I =［(A1 － A2)－(A3 － A4)］/(A1 － A2)× 100%
表 1 反应液组成
Tab. 1 Composition of reaction liquid
孔
编号
V /μL
L － DOPA 磷酸缓冲液 酪氨酸酶 供试样品
1 40 120 40 0
2 40 160 0 0
3 40 80 40 40
4 40 120 0 40
2 结果与讨论
2. 1 不同种类落叶松中花旗松素对酪氨酸酶
的抑制作用
考察了纯度均为 92%的不同种类落叶松花旗松
素对酪氨酸酶的抑制作用，结果如图 1 所示。由图 1
可知，在低质量浓度时长白落叶松花旗松素比兴安落
叶松花旗松素对酪氨酸酶的抑制作用强，这可能是由
不同落叶松提取物中除花旗松素外的其余成分引起
的。在兴安落叶松提取的花旗松素样品中，除了含有
花旗松素外，还含有香橙素、圣草酚、槲皮素、柚皮素、
山奈酚、松属素等黄酮类物质(结论来源于俄罗斯
Ametis JSC公司)。而从长白落叶松中提取的花旗松
素样品，除了含有花旗松素外，其余成分尚不明确，需
要进一步的实验去进行探究。
·912·
开发与应用 日 用 化 学 工 业 第 44 卷
图 1 兴安落叶松和长白落叶松中花旗松素对酪氨酸
酶的抑制作用
Fig. 1 Inhibitory effect of taxifolin in Larix olgensis and Larix gme-
lini on tyrosinase
2. 2 不同纯度的长白落叶松花旗松素对酪氨
酸酶的抑制作用
考察了不同纯度的长白落叶松花旗松素对酪氨酸
酶的抑制作用，结果如图 2 所示。由图 2 可知，低质量
浓度时，花旗松素的纯度越高，对酪氨酸酶的抑制作用
越强;而在高质量浓度时，高纯度的花旗松素对酪氨酸
酶的抑制作用较弱。这可能是在不同纯度的花旗松素
提取物中，除了花旗松素外，还含有其他提取成分，由
于它们在提取物中的含量不同所致。由于花旗松素对
酪氨酸酶有抑制作用，它可能成为美白化妆品的原料，
选择低浓度、高纯度的花旗松素对酪氨酸酶的抑制作
用更强。
图 2 不同纯度的长白落叶松花旗松素对酪氨酸酶的
抑制作用
Fig. 2 Inhibitory effect of taxifolin in Larix olgensis with different
purity values on tyrosinase
2. 3 长白落叶松花旗松素和 BHT及熊果苷对
酪氨酸酶的抑制作用
考察了长白落叶松花旗松素和 BHT 及熊果苷对
酪氨酸酶的抑制作用，结果见图 3。由图 3 可知，在花
旗松素质量浓度为 0. 001 g·L －1时，其对酪氨酸酶的
抑制作用稍弱于阳性对照品 BHT，但随着质量浓度的
增大，花旗松素对酪氨酸酶的抑制作用减弱，但还具有
抑制作用，而 BHT 对酪氨酸酶的抑制作用逐渐减弱，
在一定质量浓度后还起到了相反的促进作用;阳性对
照品熊果苷对酪氨酸酶具有很强的抑制作用，且抑制
作用随着质量浓度的升高而逐渐增强，当质量浓度为
0. 01 g·L －1时，对酪氨酸酶的抑制作用为 100%。
图 3 花旗松素、BHT和熊果苷对酪氨酸酶的
抑制作用
Fig. 3 Inhibitory effect of taxifolin，BHT and arbutin on tyrosinase
由于熊果苷和 BHT 对酪氨酸酶有抑制作用［16］，
常常被用在化妆品中。熊果苷主要是阻断多巴和多巴
醌的合成，进而遏制黑色素生成，达到使皮肤变白的作
用，但宋琦如等［17］的熊果苷对皮肤黑色素细胞的毒性
研究表明，熊果苷等物质均有破坏黑色素细胞增殖的
功能，但同时也抑制正常细胞生长，说明其细胞毒性不
容忽视。BHT 是一种化工合成物质，而非天然物质，
对于人体还是会有损害的，过量的 BHT对敏感性皮肤
有刺激［16］，并且 BHT 的抗氧化性要弱于花旗松素。
因此，花旗松素更适合作为美白化妆品的原料。
2. 4 长白落叶松花旗松素对酪氨酸酶的抑制
机理
根据酶与抑制剂的作用方式可将酪氨酸酶的抑制
类型分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和
线性混合性抑制等。采用 Lineweaver － Burk 双倒数作
图，可判断抑制剂的抑制类型。在测活体系中，将酪氨
酸酶的浓度固定在 46 U·mL －1，改变 L － DOPA 的浓
度(cs)，测定不同浓度下抑制剂反应速度(V，每分钟
A475增加值)的倒数，结果如图 4 所示，图 4 中纵轴截距
为 1 /Vmax，横轴截距为 － 1 /Km。由图 4 可知，随着花旗
松素质量浓度的增加，Km 增大，各直线相交于同一坐
标点，最大反应速度 Vmax不变，其抑制机理表现为竞争
·022·
第 4 期 付警辉，等:落叶松中花旗松素对酪氨酸酶的抑制作用 开发与应用
性抑制型。以图 4 的直线斜率对花旗松素质量浓度作
回归直线，由直线在纵轴上的截距与直线斜率的比值
可得出抑制常数 KI = 0. 017。
图 4 长白落叶松花旗松素对酪氨酸酶的
Lineweaver － Burk图
Fig. 4 Lineweaver － Burk graph of taxifolin in Larix olgensis on
tyrosinase
3 结论
落叶松中的花旗松素对酪氨酸酶具有明显的抑制
作用。质量浓度在 0. 001 ～ 0. 01 g·L －1时，长白落叶
松花旗松素对酪氨酸酶的抑制作用高于兴安落叶松花
旗松素。不同纯度的长白落叶松花旗松素对酪氨酸酶
的抑制作用:高质量浓度时，纯度低的花旗松素对酪氨
酸酶的抑制作用强;低质量浓度时，纯度高的花旗松素
抑制作用强。长白落叶松花旗松素对酪氨酸酶的抑制
类型是竞争性抑制，抑制常数 KI = 0. 017。
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160 － 162．
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