全 文 ：图 1　无患子药材含量测定HPLC图
3　讨论
无患子中含有较多的皂苷类成分 , 目前文献报道 [ 3]其药材
的含量测定方法基本都是以香草醛 -冰醋酸 -高氯酸为显色体
系 , 采用分光光度法测定无患子总皂苷含量 , 为了更好地控制无
患子药材的质量 , 在其它药材常春藤含量测定基础上 ,在国内首
次建立无患子药材 HPLC含量测定方法 , 该方法操作简便 , 重现
性高 , 是控制药材质量的有效方法。
　　通过对 12个批次药材的含量测定 , 发现除个别批次含量测
定结果差异较大外 ,大多数含量均为 1% ～ 2%, 因此本研究选取
了常春藤皂苷元作为药材含量测定的指标具有实际意义。
在研究过程中 ,对皂苷水解用酸以及浓度进行了选择。选定
以 2 mol· L-1硫酸和浓盐酸对无患子中的三萜皂苷进行水解 , 结
果以后者效果较好。同时 , 对水解时间也进行了考察 , 结果表明
5 h即可水解完全。
参考文献:
[ 1 ] 　马双成 ,刘　燕 , 毕培曦.RP-HPLC法测定金银花药材中常春
藤皂苷元及齐墩果酸的含量 [ J] .药物分析杂志 , 2006, 26(7):
885.
[ 2 ] 　王　晔 ,陈建启 ,周　刚.RP-HPLC测定分清五淋丸中齐墩果酸
和常春藤皂苷元的含量 [ J].中成药 , 2007, 29(6):923.
[ 3 ] 　魏凤玉 ,张　静 ,解　辉.无患子总皂苷含量的测定 [ J] .天然产物
研究与开发 , 2008, 20(5):81.
收稿日期:2009-10-21;　修订日期:2010-04-20
基金项目:辽宁省教育厅项目(No.2009A685);
沈阳市科技局项目(No.1091144-9-00)
作者简介:郭君阳(1982-),女(汉族),河北邢台人 ,现任沈阳药科大学药
学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药提取与药物体内代谢研究
工作.
＊通讯作者简介:孙立新(1967-), 女(满族),辽宁新宾人 , 现任沈阳药科
大学药学院副教授 ,硕士研究生导师 ,博士学位 ,主要从事抗肿瘤活性成
分的研究工作.
了哥王中西瑞香素提取工艺的正交实验设计优选
郭君阳1 ,郝桂彤 2 ,孙立新1＊
(1.沈阳药科大学药学院 ,辽宁 沈阳　110016;　2.天津怀仁制药有限公司 ,天津　300385)
摘要:目的 优选了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺。方法 以西瑞香素含量为考察指标 , 采用 L9(34)正交设计的方法
优选了哥王中西瑞香素的最佳提取条件。结果 了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺为:75%乙醇加热回流提取 4次 , 2 h/
次。结论 此提取工艺简便合理可行 ,适用于了哥王中西瑞香素的提取。
关键词:了哥王;　西瑞香素;　正交设计;　提取工艺
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.09.027
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)09-2190-02
　　了哥王学名南岭荛花 Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey,为
瑞香科荛花属植物 , 其根 、茎叶和果实均可入药 , 盛产于广东 、浙
江 、广西等地。了哥王始载于《岭南采药录》 , 其性味苦寒 , 微辛 ,
有毒 , 入肺肝经 ,具有清热解毒 、消肿散结 、通经利水等功效。了
哥王主要有香豆素类 、黄酮类 、木脂素类 、挥发油类 、甾体类 、皂苷
等成分 , 文献报道具有抑菌 、抗病毒 、抗炎镇痛 、止咳祛痰 、抗癌等
作用 [ 1] 。西瑞香素(daphnoretin)为香豆素类化合物 , 在了哥王中
含量较大 [ 2] , 具有抗病毒 [ 3] 、抗肿瘤 [ 4]等作用。了哥王中西瑞香
素的提取 , 文献中采用甲醇为提取溶剂 , 但甲醇毒性较大 ,且提取
工艺未经优化 [ 5, 6] 。本实验采用乙醇提取 , 通过正交实验考察了
影响西瑞香素提取工艺的乙醇体积分数 、提取时间 、提取次数 ,优
选了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺 ,为工业化生产提供实验参
考依据。
1　仪器 试剂与药材
1.1 　仪器 岛津 LC-6A高效液相色谱仪(日本 SHIMADZU),
ANASTAR色谱工作站(天津奥特塞恩斯仪器有限公司), 分析天
平(十万分之一 ,湘仪天平仪器厂), 旋转蒸发器(RE-52AA, 上
海亚荣生化仪器厂), SHZ-Ⅲ型 循环水真空泵(郑州长城科工
贸有限公司), KQ-100超声机(昆山市超声仪器有限公司), 恒
温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.2 　试药 西瑞香素对照品(广州来普达克生物技术有限公司 ,
纯度为 98.9%),了哥王(购自河北安国市童铃药材有限公司 , 产
地是广东 ,批号:080522);甲醇(色谱纯 , 山东禹王实业有限公司
禹城化工厂),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司), 无水乙醇 、磷
酸为分析纯;了哥王药材由沈阳药科大学孙启时教授鉴定为
Wikstroemiaindica(L.)C.A.Mey。
2　方法与结果
2.1　西瑞香素的含量测定
2.1.1　色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:DiamonsilC
18
(250
mm× 4.6mm, 5 μm);流动相:甲醇 -0.05%磷酸水溶液(49∶
51, V/V);流速 1.0ml· min-1;检测波长:345nm;柱温:40℃。在
上述色谱条件下 ,理论板数按西瑞香素计不低于 3 000。西瑞香
素与相邻峰的分离度均大于 1.5, 拖尾因子均在 0.95 ～ 1.05之
间。色谱图见图 1。
2.1.2　对照品溶液的制备 取西瑞香素对照品约 5.0 mg,精密
称定 , 置于 100ml量瓶中 , 加甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 ,即得
50.0 μg· ml-1储备液。
2.1.3　供试品溶液的制备 取了哥王药材约 10 g, 精密称定 , 置
于圆底烧瓶内 ,加 75%乙醇浸泡过夜 , 药材∶溶剂 =1∶10,次日
于 80°水浴中回流提取 4次 , 2 h/次 , 热滤 , 合并滤液 , 减压蒸干 ,
所得浸膏用甲醇溶解并转移至 100 ml量瓶中 , 甲醇稀释至刻度 ,
摇匀 , 精密吸取 1 ml于 50 ml量瓶中 , 甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 0.
45 μm滤膜过滤 ,取续滤液即得。
2.1.4　标准曲线绘制 依次精密吸取西瑞香素标准储备液 0.4,
0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0 ml, 分别置于 10 ml量瓶中 , 用甲醇稀释至
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.9
刻度 , 配成西瑞香素浓度分别为 2.0, 4.0, 8.0, 12.0, 16.0, 20.0
μg· ml-1的系列标准溶液。吸取 20 μl上述溶液依次注入高效
液相色谱仪中 , 于 345nm波长处测定峰面积。以西瑞香素标准
溶液的浓度(μg· ml-1)为横坐标(X), 峰面积(A)为纵坐标(Y),
进行线性回归。所得回归方程为 Y=6.183×104 X+ 5.492 ×
103 , r= 0.999 9 (n=6)。结果表明 , 西瑞香素在 2.0 ～ 20.0
μg· ml-1范围内呈良好的线性关系。
A-西瑞香素对照品　B-了哥王样品　 1.西瑞香素
图 1　典型色谱图
2.1.5　精密度实验 取同一对照品溶液 , 按上述色谱条件 ,重
复进样 6次 , 20μl/次。测定西瑞香素峰面积 , 其 RSD为 1.1%,
表明该方法的精密度良好。
2.1.6　 稳定性实验 取同一供试品溶液 , 分别于 0, 2, 4, 8, 16,
24 h按上述色谱条件 , 进样 20 μl测定西瑞香素峰面积 , RSD为
1.6%,表明西瑞香素在 24 h内稳定。
2.1.7　重复性实验 精密称取了哥王药材 6份 , 按 “ 2.1.3”项
下方法制备并测定 , RSD为 1.7%, 表明此方法的重复性良好。
2.1.8　加样回收率实验 称取已知含量的了哥王药材 6份 ,每
份约 5 g, 精密称定 , 分别定量加入西瑞香素对照品约 20 mg, 按
“ 2.1.3”项下方法操作 , 计算回收率。平均回收率为 98.3%, RSD
为 1.7% 。
2.2 　提取工艺的优化
2.2.1　正交实验设计 考虑到大量提取时的实际条件 , 在预实
验的基础上 , 选取提取溶剂的加入量为药材的 10倍量 , 影响了哥
王中西瑞香素提取率的主要因素为:乙醇的体积分数 、提取时间 、
提取次数。因此选取上述 3个因素为考察因素 ,每个因素设立 3
个水平(见表 1)采用 L9(34)正交设计表 , 以西瑞香素含量为指
标进行实验 , 实验安排及结果见表 2 ～ 3。
表 1　因素水平
水平 A乙醇体积分数(%)
B
提取时间 t/h
C
提取次数 /次
1 50 1 2
2 75 2 3
3 95 3 4
2.2.2　实验方法及结果 称取了哥王药材 9份 ,每份约 10 g,精
密称定 , 按表 2的设计浸泡过夜后回流提取 , 热滤 , 合并滤液 ,减
压浓缩至干 , 所得浸膏用甲醇溶解 , 转移至 100 ml量瓶中 , 甲醇
稀释至刻度 ,摇匀 ,精密量取 1 ml置 50 ml量瓶中 ,甲醇稀释至刻
度 , 摇匀 ,用 0.45 μm滤膜过滤 , 取续滤液按西瑞香素含量测定
项下测定。 9次实验结果见表 2。
2.2.3　正交实验结果分析 由表 2 ～ 3可知 , 直观分析表明 ,各因
素对西瑞香素含量影响程度依次为:A>C>B, 最佳的工艺组合
为 A2B2C3。方差分析的结果表明 , 3个因素对西瑞香素含量影响
均不显著。以西瑞香素含量为主要考察指标 ,确定最佳提取工艺
为 A2B2C3 ,即 75%乙醇 , 提取 4次 , 2h/次。
表 2　正交实验直观分析结果
水平 A B C 西瑞香素含量/mg· g-1
1 50 1 2 3.13
2 50 2 3 3.55
3 50 3 4 3.16
4 75 1 3 3.30
5 75 2 4 3.91
6 75 3 2 2.80
7 95 1 4 2.71
8 95 2 2 2.41
9 95 3 3 2.56K1 3.280 3.047 2.780K2 3.337 3.290 3.137K3 2.560 2.840 3.260R 0.777 0.450 0.480
表 3　方差分析结果
方差来源 偏差平方和 自由度 F P
乙醇体积分数(A) 1.125 2 11.719 >0.05
提取时间(B) 0.304 2 3.167 >0.05
提取次数(C) 0.373 2 3.885 >0.05
误差(D) 0.10 2
　　F0.05(2, 2)=19.00
2.2.4　方法验证实验 根据上述结果筛选的工艺进行实验 , 平
行做 6份 , 按照 “ 2.1.3”项下制备供试品溶液 , 取 20 μl续滤液进
样分析 。结果:平均西瑞香素含量为 4.030mg· g-1 , 与表 2结果
比较可见本提取工艺合理。
3　讨论
西瑞香素甲醇溶液于 200 ～ 400 nm紫外区内进行扫描 , 于
345 nm处有最大吸收 , 所以本实验采用 345 nm为最大吸收波
长。
根据预实验结果 ,了哥王药材浸泡过夜提取的更完全。经正
交设计实验直观和方差分析发现影响了哥王中西瑞香素提取的
因素依次为乙醇体积分数 >提取次数 >提取时间 ,最佳提取条件
为 A2B2C3 , 即:75%乙醇溶液提取 4次 , 2 h/次。按此最佳工艺条
件进行验证实验 ,结果表明该工艺具有重复性 , 说明该提取工艺
稳定 , 可为生产提供实验参考。
参考文献:
[ 1 ] 　陈　扬 ,孙立新.中药了哥王研究进展 [ J] .沈阳药科大学学报 ,
2009, 26(7):587.
[ 2 ] 　熊友香 ,王显武 ,尤志勉 ,等.HPLC测定不同产地了哥王药材中西
瑞香素含量 [ J] .中成药, 2009, 31(8):附 18.
[ 3 ] 　ChenHC, ChouCK, KuoYH, etal.IdentificationofaProteinKinase
C(PKC)Activator, Daphnoretin, ThatSuppressesHepatitisBVirus
GeneExpressioninHumanHepatomaCels[ J] .BiochemicalPharma-
cology, 1996, 52:1025.
[ 4 ] 　杨振宇 ,郭　薇 ,吴东媛 , 等.了哥王中西瑞香素的提取分离及抗
肿瘤作用研究 [ J] .天然产物研究与开发 , 2008, 20(3):522.
[ 5 ] 　杜智敏 ,杨振宇 ,郭　薇.西瑞香素的提取方法及含西瑞香素的药
物 [ P] .中国专利:CN101016286, 2007-08-15.
[ 6 ] 　李艳敏 ,姜建国 ,曾治平.了哥王中西瑞香素含量的 HPLC法测定
[ J] .现代食品科技 , 2009, 25(5):563.
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