全 文 ：浙江农业学报 Ae t a Ag r￡c ` l ￡。 a re Zh e加雌 e肚七 7 ( 3) :4 2卜 4 28 , 1 9 9 5
激素对旱芹胚性愈伤组织形成过程中生化变化的影响
徐根娣1 李 瑶“
( ’ 浙江师范大学生物系 ,
20 0 4 3 5 )
贾
金华
叶鸣明 2 倪德祥
复旦大学遗传所 . 上海
沈大棱2
2 0 0 4 3 3 ; 3 第二军医大学克隆公司 , 上海
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J ia L in 3
,
Y e M i n g m i n g Z
,
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关键词 : 旱芹 ; 胚性愈伤组织 ; 激素 ;
K e y w o r d s : C e l e yr ; E m b yr
o n i e e a l lu s ;
核酸 ; 蛋白质
H o r m o n e ; N u e ]e in a e id ; P r o t e in s
体细胞胚是植物组织培养中植株再生的主
要方式 。 目前虽有一些关于体细胞胚发生的
报道 〔5, 9 , ’ 的 , 但其发生机制尚不清楚 · 在
植物脱分化过程中 , 愈伤组织是否具有胚
性 , 在很大程度上关系到体细胞胚的发育 ,
而外界因素如激素 、 营养成份 、 光照 、 温度
等 , 对愈伤组织的胚性能力都有影响 .
旱芹产生的胚性愈伤组织数量多 , 疏松易
分开 , 在适宜的培养条件下 , 获得的胚状
体 , 通过测定其核酸酶和激素的含量 , 并可
用来探讨体细胞胚发生过程的基因调控和生
化变化 . Z e e 等研究 了旱芹 0一 10 天胚状体
形成前可溶性蛋白质的变化 旧 , 但未作进
一步研究 。
本文对旱芹在不同激素下胚性愈伤组织发
生过程 中的核酸 、 蛋 白质变化作 了初步分
析 , 为研究其体细胞胚的发生提供基础资
料 .
材料与方法
(一 ) 植物材料与培养方法
收稿 日期 : 19 9 5刁 2一 15
采用旱芹 (注 p i u m g r a v e o le ns L . ) 叶片 ,
愈 伤 组 织 培 养 的方 法参 阅 作者 前 文 报
道 〔 `〕 . 采 用 3 种 培养基 : ( A ) M S +
l m g / 1 2
.
4一 D : ( B ) M S + l m g / 1 2
.
4一 D
+ 0
.
s m g / 1 K T ; ( C ) M S+ 0
.
2 1n g / 1 N A A
+ 0
.
s m g 八 K T .
(二 ) 核酸 、 蛋白质含量的测定
定 期 取 样 , 每 次 称 取 愈 伤 组 织 鲜 重
1
.
59
, 参照朱治平的方法抽提核酸 、 蛋白质
及 测定总核酸 〔 2〕 , 用朱俭等 的方法测定
D N A (3)
, 用改 良 L o w yr 法测定蛋白质含
量 〔 7 ) 。
(三 ) 可溶性蛋白质 S D S一聚丙烯酞胺凝胶
电泳
用 SD S一聚丙烯酞胺凝胶电泳 , 比较胚性
愈伤组织在不同激素处理下可溶性蛋白的差
异 . 称取 lg 鲜愈伤组织加入 .() 25 ml 样品抽
提液 ( 6 2 5 m M T r i s一 H C I p H 6 , 8 , l m M 苯
甲基 磺酸氟 , 10 % 甘油 ) , 匀 浆后 离 心
( 10 o 0 0 r p m ) 15 分钟 , 取上清液加人 S D S
和 刀一疏基 乙 醇 , 使最终浓度分别为 2%
( w / v ) 和 5% (v / v ) , 在沸水 中加热 5分
钟 , 得 电泳样品 . 配胶按 L ae m m h 法 (8) 进
激素对旱芹胚性愈伤组织形成过程中生化变化的影响 · 24 7 ·
行 .
ǎ圳翁灿\“日à式之自
电泳在 4℃下进行 , 稳流 30 拜A / 板 , 电
泳 4 小时后 , 染色 2 小时 (染液为 。 . 25 %
考马斯 亮兰 R一 2 50 , 45 % 甲醇 , 1% 乙
酸 ) . 脱色过夜 (脱色液为 5% 甲醇 , 7% 乙
酸 ) . 蛋白质电泳带在波长 5 9 5 n m 一 7 2 o n m
范围扫描 .
结果和讨论
(一 ) 激素对核酸及蛋白质含量的影响
对旱芹叶片接种到含有不同激素的三种培
养基上的培养结果表明 :
培养 30 天后 , A 组长 出疏松的胚性愈伤
组织 , 原球胚少 ; B 组长 出颗粒状愈伤组
织 , 原球胚多 ; C 组只长出少量愈伤组织 ,
质地较硬 . 30 天后 , 将 愈伤组织转 人到
M S。 (无任何激素) 中 , 到第 4 0 天 , A 、 B
组胚状体有少量发育到子叶期 ; 培养到第
60 天 、 A 、 B 组生成很多幼苗 , 其中 B 组
多于 A 组 , C 组几乎无苗再生 . 培养的 60
天中 , 每隔 10 天取样一次 , 测定核酸和蛋
白质的含量 , 结果如图 1所示 。
1
. 在 2 , 4一 D 诱导下 , 愈伤组织形成过程
中 D N A 、 总核酸及蛋 白质合成增加 , 但随
着时间增长 ( 30 天 ) , 含量下降 . 当愈伤组
织转移至 M S。 中 , 核酸 、 蛋 白质的合成又
开始增加 . 可 以看 出 , A 组和 B 组 中核
酸、 蛋白质变化趋势一致 , 所以 K T 的有无
对愈伤组织核酸 、 蛋白质合成无明显影响 .
2
.
C 组无 .2 4一 D , 核酸 、 蛋 白质合成 比
A
、
B 组少 , 而且未出现合成高峰 。 C 组中
细胞分裂少 , 不能形成大量愈伤组织 , 且胚
性弱 。
从以上分析可以看出 , 胚性愈伤组织诱导
过程中伴随着核酸 、 蛋白质的变化 . 这与一
些报道是一致的 (5, ’ “ ) .
在本实验中 , D N A 、 总核酸 、 蛋白质三
者的变化曲线相似 , 在有 2 . 4一 D 诱导时 ,
核酸 、 蛋白质含量均有提高 , 而无 2 . 4一 D
时 , 其含量则无明显变化 . 说明在旱芹组织
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处理后 天数
50 亡〔)一
图 1 不 同激素时早芹愈伤组织 中 D N A (A ) 、 总
核 酸 (B ) 和蛋白质 ( C ) 的影响
F ig 1 E f (T又 t o f d ife r e n t h o r m o n e s o n D N A ( A )
,
t o 一a l
n u e l e ie a e id s (B )
a n d P r o t e in s (C )
o f e e le ry e a l l u s
培养中 , 2 . 4一 D 对基因的调控起着重要作
用 , 影响胚性愈伤组织的诱导 .
(二 ) 不同激素可溶性蛋 白质的影响
对 A 、 B 、 C 三种培养基中培养物的可溶
性蛋白质电泳扫描表明 , 电泳谱形状基本相
似 , 只存在含量和种类的差别 . A 、 B 两种
培养基相 比 , B 中多 2 个峰 , 且含量也高 ,
而 C 培养基的可溶性 蛋 白质与 A 、 B 比
较 , 在 含量 和 种类 上均 较少 . 这 也说 明
2
.
4一D 对可溶性蛋白质的种类和含量有一定
2 铭 浙江农业学报 第 7卷( 19 9) 5
影响.
不同激素诱导的胚愈伤组织 , 其可溶性蛋
日的含量和种类都有差异 , 说明在分化过程
中, 不同激素调控不同的基因表达 . 另外 ,
在含 2 、 4一 D 的培养基中 , 增加 K T 能增加
愈伤组织的鲜重和 可溶性蛋白质的合成种
岁忿。
Z c e 等 〔 6 , 以旱芹叶柄为外植体 , 观察胚
状体形成前的可溶性蛋白质 . 将培养 O一 10
天的叶柄培养物 , 取样电泳 , 发现可溶性蛋
白质的带谱发生变化 , 带谱呈现加深 、 变浅
或消失 。 本实验中 , 发现叶片培养的前 10
大可溶性蛋白质的变异较大 , 其后的培养
中, 虽然培养物的形态差异较大 , 但可溶性
蛋白质变化较小 , 证明分化时的生化变化 ,
有一部分是产生在形态发生之前 .
总之 , 愈伤组织的形成及分化 , 实质 上是
与分化有关的基因的活化 , 由于基因的活
化 , 随之可能诱发或抑制 R N A 和蛋白质的
含成 , 使蛋白质的仑成量和种类产生女化 .
有关这些蛋日质在分化过程中的作用 , 有待
红纷一步研究 ,
参考文献
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( 8〕 加 e m n 、 U U K 1 97 0 . 门 e a v a g e o f s t ur c t盯 a ] P r o et 访 s
d u n n g 山 e a s哭 m b ly o f 山 e h e a d o f b a e t e ir o Pha g e
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〔 9〕 M e w i li i a!lr 人 A 尸才 a l 19 7 4 . T h e o ir 盆in a n d d e v e了·
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