全 文 ：RP-HPLC法同时测定旱芹中绿原酸和咖啡酸的含量
杨洋 1 ,谭亮 1 ,陈晓辉 1 ,毕开顺1 ,贾英2＊
(1.沈阳药科大学 药学院 ,沈阳 110016;2.沈阳药科大学 中药学院 , 沈阳 110016)
摘要　目的:建立 RP-HPLC法同时测定不同药用部位 、不同产地 、不同季节的旱芹中绿原酸和咖啡酸的含量。 方法:采用
KromasilC18柱(5 μm, 250 mm×4.6 mm),流动相为甲醇 -0.05%磷酸水溶液梯度洗脱 , 流速 1.0 mL· min-1 , 检测波长 327
nm, 柱温 35 ℃。结果:绿原酸和咖啡酸进样浓度分别在 3.71 ～ 92.8 μg· mL-1(r=0.9999)和 0.148 ～ 3.70 μg· mL-1(r=
0.9997)范围内与峰面积呈良好的线性关系 , 平均加样回收率(n=9)分别为 100.3%和 100.2%。结论:分析方法快速 、准确 ,
重现性好 , 可用于控制旱芹的质量。
关键词:旱芹;不同部位;不同产地;不同季节;绿原酸;咖啡酸
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2010)05-0819-04
RP-HPLCsimultaneousdeterminationofchlorogenicacidand
cafeicacidinApiumgraveolensL.
YANGYang1 , TANLiang1 , CHENXiao-hui1 , BIKai-shun1 , JIAYing2＊
(1.SchoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China;
2.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China)
Abstract　Objective:ToestablishanRP-HPLCmethodforthesimultaneousdeterminationofchlorogenicacid
andcafeicacidinApiumgraveolensL.ofdiferentparts, diferenthabitatsanddiferentseasons.Methods:The
chromatographicmethodwascariedoutonKromasilC18column(5 μm, 250mm×4.6mm)andmethanol-0.05%
phosphoricacidwithgradientelutionasthemobilephasewasadopted;Theflowratewas1.0 mLmin-1;Theab-
sorbancewasmonitoredat327 nm, andthecolumntemperaturewas35 ℃.Results:Thelinearresponseranges
were3.71-92.8 μg· mL-1(r=0.9999)and0.148 -3.70 μg·mL-1(r=0.9997), respectively.Theaverage
recoveries(n=9)were100.3% and100.2%, respectively.Conclusion:Theassaydemonstratesthatthemethod
hasadequateaccuracyandselectivitytomeasuretheconcentrationofchlorogenicacidandcafeicacidinApium
graveolensL.
Keywords:ApiumgraveolensL.;diferentparts;diferenthabitats;diferentseasons;chlorogenicacid;cafeicacid
旱芹(ApiumgraveolensL.)为伞形科(Umbelif-
erae)旱芹属 , 1年或多年生草本植物 ,有强烈香气 。
现又称为药芹 、香芹。 《本草纲目》上记载:“茎:性
味 ,甘 ,平 ,无毒;主治 ,女子赤沃 ,止血养精 ,保血脉 ,
益气 ,令人肥健 ,嗜食 。花:性味 ,苦 ,寒 ,无毒;主治 ,
脉温”。全国各地均有栽培。以嫩茎 、叶 (未开花
者)供食用和药用 ,其根也作药用 ,均以鲜品为佳 ,
干品次之 。旱芹主要作为一种食用蔬菜 ,其种子
(芹菜籽)是一种常用香料。其植株和种子皆可入
药 。植株具有降压 、开胃 、利尿 、调经等功效 。在维
吾尔药中 ,芹菜籽主要用于治疗高血压 、关节炎等疾
病。研究发现 ,芹菜中含有挥发油 、黄酮类 、苯丙素
类 、萜类等多种物质 ,具有良好的抗菌 、抗氧化 、抗肿
瘤 、降压 、降脂和降低胆固醇的功效 [ 1, 2] 。绿原酸和
咖啡酸为苯丙素类成分 ,具有抗菌 、降压等多种药理
作用 ,目前已有多篇同时测定中药和中药制剂中绿
原酸和咖啡酸含量的文献报道[ 3 ～ 5] ,但作者未见旱
芹类似报道 。本文采用 RP-HPLC法对其进行定
量分析 ,为旱芹质量评价提供依据 。
—819—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(5)
＊ 通讯作者　Tel:(024)23986296;E-mail:jiayingsyphu@yahoo.com.cn
DOI :10.16155/j.0254-1793.2010.05.027
1　仪器与试药
日本岛津 LC-2010系列高效液相色谱仪;
CLASS-VP色谱工作站。 AB135 -S电子天平
(METTLERTOLEDO)。 KQ5200B型超声清洗器
(200W, 40kHz)。对照品绿原酸(批号:110753-
200212)、咖啡酸(批号:110885-20102)购自中国
药品生物制品检定所 ,自不同产地收集 18批旱芹
(2008年 7月至 2009年 2月),芹菜籽购自种子公
司 ,经沈阳药科大学药用植物教研室孙启时教授
鉴定确认为正品。样品预处理:收集的药材茎 、
叶 、根分离 ,阴干 ,粉碎成粗粉 ,置密封袋中 , 密封
保存 。甲醇和磷酸为色谱纯 ,水为娃哈哈纯净水 。
2　色谱条件
色谱柱:KromasilC18柱(5 μm, 250 mm×4.6
mm);流动相:A相为 0.05%磷酸水溶液 , B相为甲
醇 ,梯度洗脱(0 ～ 8 min, B相从 28%线性改变至
30%;8 ～ 10 min, B相从 30%线性改变至 32%;10 ～
16min, B相从 32%线性改变至 100%);流速:1.0mL
·min-1;检测波长 327 nm;柱温:35 ℃;进样量:10
μL。在上述色谱条件下取供试品溶液进样分析 ,理
论塔板数按绿原酸计算不低于 6400,绿原酸和咖啡
酸色谱峰与相邻色谱峰的分离度大于 1.5,拖尾因
子在 0.95 ～ 1.05之间。
3　溶液制备
3.1　供试品溶液 取本品粉末约 0.4g,精密称定 ,
置具塞锥形瓶中 ,精密加入 80%甲醇 20mL,称定重
量 ,超声处理 30 min,取出 ,放冷 ,用 80%甲醇补足
减失的重量 ,摇匀 ,微孔滤膜(0.45 μm)过滤后取续
滤液 ,即得。
3.2　混合对照品溶液 取对照品绿原酸和咖啡酸
适量 ,精密称定 ,分别置于 25 mL棕色量瓶中 ,加
80%甲醇使溶解 ,并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得绿原酸
对照品储备液(464.0 μg· mL-1)和咖啡酸对照品
储备液(7.400 μg· mL-1)。分别精密移取绿原酸
对照品储备液 5 mL和咖啡酸对照品储备液 12.5
mL置 25 mL量瓶中 ,加 80%甲醇定容至刻度 ,摇
匀 ,得混合对照品溶液(绿原酸:92.8 μg·mL-1 、咖
啡酸:3.700 μg· mL-1)。
4　方法学考察
4.1　线性范围的考察 分别精密移取上述混和对
照品溶液 0.2, 0.4, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0mL置 5 mL量
瓶中 ,加 80%甲醇定容至刻度 ,摇匀 ,分别取 10 μL
进样 ,在上述色谱条件下进行分析。以对照品浓度
X(μg· mL-1)为横坐标 ,峰面积 Y为纵坐标 ,绘制
标准曲线并进行回归计算 ,绿原酸和咖啡酸回归方
程分别为:
Y=3.942×104X+1.328×104 r=0.9999(n=6)
Y=6.774×104X+3.354×103 r=0.9997(n=6)
结果表明:绿原酸和咖啡酸浓度分别在 3.71 ～ 92.8
μg· mL-1和 0.148 ～ 3.70 μg·mL-1范围内线性关
系良好。
4.2　精密度试验 取混合对照品溶液 (绿原酸:
18.56 μg·mL-1;咖啡酸:0.7400 μg· mL-1),在上
述色谱条件下连续进样 6次 ,测定绿原酸和咖啡酸
峰面积的 RSD分别为 1.1%和 0.9%。
4.3　重复性试验 精密称取同一样品(沈阳 2008/
09叶)粉末 ,依 “ 3.1”项下的方法操作 ,平行制备 6
份溶液 ,在上述色谱条件下测定 。计算绿原酸和咖
啡酸的平均含量分别为 1.31%和 0.02%, RSD分别
为 2.6%和 2.8%。
4.4　稳定性试验 取沈阳 2008 /09叶的供试品溶
液 ,分别放置 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 h后 ,在上述色谱条件
下进样测定 。计算绿原酸和咖啡酸峰面积的 RSD
分别为 0.9%和 1.5%。结果表明供试品溶液在 4 h
内稳定性良好 。
4.5　加样回收率试验 称取已知含量的旱芹样品
(沈阳 2008/09叶)粉末 9份 ,每份 0.2g,精密称定 ,
按低 、中 、高浓度分别精密加入绿原酸对照品储备液
(464.0μg· mL-1)0.3, 0.6, 0.9 mL和咖啡酸对照
品储备液 (7.400 μg· mL-1)0.3, 0.5, 0.80 mL,加
入对照品量为 0.2 g样品中相应成分含有量的
50%, 100%, 150%。按 “ 3.1”项下方法制备溶液 ,
每一浓度溶液 3份 ,在上述色谱条件下进行分析。
结果绿原酸低 、中 、高浓度回收率 (n=3)分别为
101.6%(RSD=1.3%), 100.5%(RSD=3.0%),
98.7%(RSD=3.0%);平均回收率 (n=9)为
100.3%。咖啡酸低 、中 、高浓度回收率(n=3)分别
为 101.7%(RSD=2.8%), 98.4%(RSD=2.1%),
100.6%(RSD=1.3%);平均回收率 (n=9)为
100.2%。
5　样品测定
取所收集的旱芹粉末 ,按 “ 3.1”项下的方法操
作 ,制备供试品溶液 。在上述色谱条件下进样测
定 ,采用标准曲线法计算样品中绿原酸和咖啡酸
的含量 ,结果见表 1、表 2和表 3。代表性色谱图见
图 1。
—820— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(5)
表 1　不同产地样品测定结果(%, n=2)
Tab1 ContentofdifferenthabitatsinApiumgraveolensL.sample
产地
(habitat)
茎(stalk) 叶(leaf)
绿原酸
(chlorogenicacid)
咖啡酸
(cafeicacid)
绿原酸
(chlorogenicacid)
咖啡酸
(cafeicacid)
黑龙江Ⅰ (HeilongjiangⅠ )2009/02 0.82 0.04 1.40 0.03
河南 (Henan)2009 /02 0.30 - 3.33 0.08
浙江 (Zhejiang)2009 /02 0.12 0.01 0.18 0.04
山东 (Shandong)2009 /02 0.29 0.02 0.95 0.02
新疆 (Xinjiang)2009 /02 0.87 0.06 + 0.11
河北 (Hebei)2009 /02 0.15 0.01 1.49 0.05
黑龙江Ⅱ(HeilongjiangⅡ)2009/02 0.14 0.01 1.02 0.04
韩国Ⅰ (HanguoⅠ )2009 /01 - - 0.86 0.04
海南 (Hainan)2009 /01 - - 1.15 0.04
韩国Ⅱ (HanguoⅡ)2008 /12 - - 1.25 0.02
广东 (Guangdong)2008 /09 0.14 - 0.92 0.23
青海 (Qinghai)2008 /08 - - 2.18 0.04
注(note):“ -”表示未检出或低于标准曲线范围(“ -”indicatesnotdetectedorlowerthantherangeofcalibrationcurve);“ +”表示超出标
准曲线范围(“ +”indicateshigherthantherangeofcalibrationcurve)
表 2　沈阳地区不同季节样品测定结果(%, n=2)
Tab2 Contentofdifferentseasonsin
ApiumgraveolensL.sampleofShenyang
季节(season)
茎(stalk) 叶(leaf)
绿原酸
(chlorogenic
acid)
咖啡酸
(cafeic
acid)
绿原酸
(chlorogenic
acid)
咖啡酸
(cafeic
acid)
2008/07 - 0.17 - -
2008/09 - - 1.31 0.02
2008/10 0.27 0.02 2.96 0.07
2009/02 0.28 0.02 2.90 0.07
2009/01 - - - -
2009/01[冻干
(freeze-dry)]
0.36 0.02 2.02 0.06
注(note):“ -”表示未检出或低于标准曲线范围(“ -”indicates
notdetectedorlowerthantherangeofcalibrationcurve);“ +”表示超出
标准曲线范围 (“ +” indicateshigherthantherangeofcalibration
curve)
表 3　不同部位样品(陕西 2009/01)中的含量(%, n=2)
Tab3 Contentofdifferentpartsin
ApiumgraveolensL.sample(Shaanxi2009/01)
部位
(parts)
绿原酸
(chlorogenicacid)
咖啡酸
(cafeicacid)
芹菜籽(celeryseed) - -
芹菜根(celeryroot) - -
芹菜茎(celerystalk) 0.44 0.01
芹菜叶(celeryleaf) + 0.10
注(note):“ -”表示未检出或低于标准曲线范围(“ -”indicates
notdetectedorlowerthantherangeofcalibrationcurve);“ +”表示超出
标准曲线范围(“ +” indicateshigherthantherangeofcalibration
curve)
6　讨论
6.1　根据文献报道 [ 7] ,绿原酸和咖啡酸在 327 nm
附近有最大吸收 ,故选择 327 nm作为检测波长 ,使
两组分达到检测的最佳效果 。
—821—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(5)
图 1 对照品(A)和样品(山东 , 2009 /02,叶)(B)HPLC图
Fig1 HPLCchromatogramsofreferencesubstances(A)andsample
(Shandong, 2009/02, leaf)(B)
1.绿原酸(chlorogenicacid) 2.咖啡酸(cafeicacid)
6.2　本实验系自行摸索流动相的组成成分 ,选用甲
醇 -水为流动相 ,加入一定量的磷酸抑制酸解离 ,改
善峰形 。在对流动相等条件考察时发现 ,等度洗脱
分析时间较长 ,且极性相近的成分较多 ,对测定组分
有一定的干扰 ,故选用梯度洗脱 。
6.3　本实验采用了超声提取法考察了水 、乙醇 、甲
醇的提取效率 ,结果表明甲醇提取效率最高;在此基
础上考察了 40%, 60%, 80%甲醇的提取效率 ,结果
表明 80%甲醇的提取效率最佳 ,又以 80%甲醇作为
提取溶剂比较了回流提取与超声提取 2种提取方
法 ,发现回流提取效率与超声提取相当。为了操作
简便 ,且绿原酸对热不稳定[ 3] ,故选用超声提取;在
此基础上 ,考察了溶剂用量及提取时间对实验结果
的影响 ,发现用 50倍量溶剂提取 30 min,即可将两
者提取完全 。结果表明采用 50倍量的 80%甲醇超
声提取 30min,即可将旱芹中绿原酸和咖啡酸提取
完全。
6.4　除黑龙江Ⅰ来源的旱芹中茎的咖啡酸含量高
于叶外 ,其余来源的旱芹中绿原酸和咖啡酸含量均
为叶 >茎 >根 、芹菜籽 ,说明日常生活中人们经常舍
弃芹菜叶的做法是不科学的。
6.5　在测定 18批旱芹中绿原酸和咖啡酸的含量时
发现 ,不同产地的两者的含量差距较大 ,线性范围
内 ,两者的最低和最高含量分别为绿原酸 3.33%和
0.12%,咖啡酸 0.23%和 0.01%。同一产地不同季
节的旱芹 ,两者的含量差距也较大 。
6.6　2009年 1月旱芹茎和叶中未检测到绿原酸和
咖啡酸 ,原因尚待进一步深入研究 。
6.7　本实验建立了高效液相色谱同时测定不同产
地 、不同药用部位 、不同季节旱芹中绿原酸和咖啡酸
含量的分析方法 ,方法简便 、快速 、准确 ,重复性好 ,
可以为旱芹的质量控制提供依据 。
参考文献
1 ZHOUHui(周辉), LUXiang-yang(卢向阳), TIANYun(田
云), etal.Advancesinstudiesonchemicalconstituentsandphar-
macologicalactivitiesofApiumL.(芹菜成分及药理活性研究进
展).AminoAcidsBioticResour(氨基酸和生物资源), 2006, 28
(1):6
2 GUOJin-yan(高金燕), CHENHong-bing(陈红兵).Advances
instudiesonactiveconstituentsofApiumL.(芹菜中活性成分的
研究进展).FoodNutrChina(中国食物与营养), 2005, 07:28
3 YANGGang(杨刚), DUShou-ying(杜守颖), WUQing(吴
清), etal.Thedeterminationofthecontentofchlorogenicacidand
caffeicacidinbineofLonicerajaponicaThunb.byHPLC(HPLC法
测定忍冬藤中绿原酸及咖啡酸含量).DrugStandChina(中国
药品标准), 2004, 5(4):47
4 ZONGDong-sheng(宗东升), SHENChen(沈忱), LIDan(李
丹), etal.Determinationofchlorogenicacidandcafeicacidin
HerbaTaraxacibyRP-HPLC(RP-HPLC法测定蒲公英中绿原
酸与咖啡酸的含量).PractPharmClinRem(实用药物与临床),
2008, 11(4):259
5 TANXiao-jie(谭晓杰), JIAYing(贾英), CHENXiao-hui(陈
晓辉), etal.RP-HPLCdeterminationofchlorogenicacidandcaf-
feicacidinYejuhuainjection(RP-HPLC法测定野菊花注射液
中绿原酸和咖啡酸的含量).ChinJPharmAnal(药物分析杂
志), 2005, 25(6):651
6 SHENQi(沈奇), GUGong-ping(顾龚平), ZHANGWei-ming
(张卫明), etal.Reviewofcurentstatusofchlorogenicacidin
plants(植物绿原酸的研究动态).ChinWildPlantResour(中国
野生植物资源), 2005, 24(6):1
7 ZHANGYu(张宇), JINLing-yu(金玲宇), HANFei(韩飞), et
al.RP-HPLCsimultaneousdeterminationofchlorogenicacidand
caffeicacidinWuweixiaoduyinoralsolution(RP-HPLC法同时测
定五味消毒饮口服液中绿原酸与咖啡酸的含量).JShenyang
PharmUniv(沈阳药科大学学报), 2008, 25(11):856
(本文于 2009年 5月 19日收到)
—822— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2010, 30(5)