全 文 ：［收稿日期］ 20140501(011)
［通讯作者］ * 王秋月，中药师，从事中药药理研究，E-mail:yueyue-cc@ 163． com
花旗松素对 β-淀粉样肽损伤神经元的保护作用及机制
王秋月* ，高翔，王晓玲，张玲艳
(天津医科大学 第二医院，天津 300211)
［摘要］ 目的:研究花旗松素对 β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)损伤神经元的保护作用及其机制。方法:从新生乳鼠
大脑皮层中分离纯化神经元，与 Aβ(5 μmol·L －1)、不同浓度花旗松素(20 ～ 100 μmol·L －1)共同孵育 24 h，CCK8 法检测细胞存
活率，Hoechst 33258 染色和 Annexin V-FITC /PI检测细胞凋亡，分光光度法检测半胱天冬酶-3(caspase-3)活性的变化。结果:
在细胞活力实验中，与正常组相比，模型组细胞活力显著下降(49. 2 ± 1. 3)%，不同浓度的花旗松素可以提高神经元活力，其
中80 μmol·L －1花旗松素给药组细胞活力增至(68. 7 ± 3. 2)%，与模型组相比有极显著差异;细胞凋亡结果显示，与正常组相
比较，模型组细胞凋亡率为(50. 8 ± 1. 5)%(P ＜ 0. 01)，不同浓度的花旗松素给药组可以降低细胞凋亡率，其中 40 μmol·L －1
花旗松素凋亡率为(41. 5 ± 2. 7)%，与模型组比较呈显著性差异(P ＜ 0. 05);凋亡酶 caspase-3 的活性与正常组(0. 12 ± 0. 02)
U·μg －1比较，模型组的 caspase-3 的活性升高(2. 37 ± 0. 16)U·μg －1，P ＜ 0. 01)，与模型组相比，40 μmol·L －1花旗松素组
caspase-3 显著降低(1. 77 ± 0. 07)U·μg －1，P ＜ 0. 01)。花旗松素能明显提高 Aβ损伤神经元的细胞活力，抑制神经元的凋亡，
降低凋亡酶 caspase-3 的活性。结论:花旗松素对 Aβ损伤神经元具有保护作用，其机制可能与抑制 caspase-3 活性从而实现抗
凋亡作用有关。
［关键词］ 花旗松素;神经元;β-淀粉样肽;凋亡
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)24-0164-04
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014240164
Neuroprotective Effects and Mechanism of Taxifolin Against Neural
Damage Induced by Aβ
WANG Qiu-yue* ，GAO Xiang，WANG Xiao-ling，ZHANG Ling-yan
(The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the neuroprotective effects and mechanism of taxifolin against Aβ
induced neural damage． Method:Primary neurons were isolated and purified from cerebral cortex of suckling
mouse． The neurons were co-cultured with Aβ and taxifolin for 24 h． CCK8 method was used to test cell viability．
The apoptosis was examined by Hoechst 33258 nuclear staining，Annexin V-FITC /PI double staining and caspase-
3 activity． Ｒesult:In cell viability，compared with the normal group，cell viability of model group decreased
significantly (49. 2 ± 1. 3)%，different concentrations of taxifolin could improve the neuronal activity，the cell
viability of 80 μmol·L －1 taxifolin increased to (68. 7 ± 3. 2)%，compared with the model group． Compared with
the normal group，the apoptosis rate of model group was (50. 8 ± 1. 5)% (P ＜ 0. 01)，different concentrations of
taxifolin could reduce the cell apoptosis rate，40 μmol·L －1 taxifolin apoptosis rate was (41. 5 ± 2. 7)%，compared
with the model group (P ＜ 0. 05)． Compared with the normal group，in model group，caspase-3 activity was (2. 37
± 0. 16)U·μg －1 (P ＜ 0. 01)，compared with the model group，40 μmol·L －1 taxifolin group decreased the
caspase-3 activity (1. 77 ± 0. 07)U·μg －1 (P ＜ 0. 01)． CCK8 assay displayed that taxifolin obviously increased
cell viability． Hoechst 33258 nuclear staining and Annexin V-FITC /PI double staining showed that taxifolin could
significantly decrease apoptotic rate compared with the Aβ treated group． Taxifolin also inhibited caspase-3 activity
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第 20 卷第 24 期
2014 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 24
Dec．，2014
of neurons induced by Aβ． Conclusion:Taxifolin possesses the neuroprotective effects on Aβ damaged neurons，
which may be associated with inhibition of caspase-3 activity in neurons to against apoptosis．
［Key words］ taxifolin;neurons;β-amyloid peptide;apoptosis
阿尔茨海默病是一种以老年斑形成、神经纤维
缠结、神经元丢失为主要病理特征的神经系统神经
退行性疾病，主要表现为进行性的认知功能下降。
β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)的生成、代谢及
毒性作用被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer’s
disease，AD)病理机制。Aβ 的病理性聚积会激活小
胶质细胞和星形胶质细胞，诱导炎症介质释放增加，
继而将诱导型一氧化氮合酶激活，产生一氧化氮及
活性氧簇，这种过氧化物能对细胞产生很强的毒性，
从而引发细胞凋亡。花旗松素(taxifolin)是一种二
氢黄酮醇类化合物，是土茯苓、水红花子等中药的主
要成分［1-2］。近年来研究发现其对心肌缺血再灌注
损伤有显著的保护作用［3］，并且能抑制丙型肝炎病
毒、抗氧化应激、抗炎症反应达到保肝的作用［4］。
但尚未见花旗松素对神经元作用的相关报道。本实
验研究了花旗松素对 Aβ 导致的小鼠原代神经元损
伤的保护作用，并对其作用机制进行探讨。
1 材料
1. 1 动物 出生 3 d 的乳鼠(BALB /c)，SPF 级，合
格证号 SCXK(京)2012-0001，购自天津医科大学实
验动物中心。
1. 2 仪器与试剂 MＲ-96A 型酶标仪(深圳迈瑞生
物医疗电子股份有限公司)，BX61 型荧光显微镜
(日本 Olympus 公司)，流式细胞仪(美国 MilliPore
公司)。DMEM高糖培养基(批号 12491-015)、胎牛
血清(Gibco公司，批号 GUC0066);β-淀粉样肽(Aβ，
批号 919437)、4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)(批号
1886001，百灵威)、Hoechst 33258 染料(批号 B-
2883)、阿糖胞苷(批号 366272，百灵威)、多聚赖氨
酸(批号 1014318，西亚试剂);兔抗小鼠中相对分子
质 量 神 经 丝 蛋 白 (NF-M) 抗 体 (Stem-Cell
Technologies)(批号 YH03349m，上海研卉);异硫氰
酸荧光素(FITC)标记羊抗兔免疫球蛋白 G(IgG，
American Qualex)(批号 A102FN);Cell Counting Kit
(CCK-8)试剂盒(北京庄盟生物技术有限公司，批号
DV652);Bradford 蛋白浓度测定试剂盒(批号
P0006，Beyotime);半胱天冬酶(caspase-3)活性检测
试剂盒(批号 sc-65496，Santa Gruz Biotechnology);
磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS，批号
J1223A);花旗松素(纯度 ＞ 98. 9%，批号 111816-
201102，中国食品药品检定研究院)。
2 方法
2. 1 神经元原代培养［5］ 取新生乳鼠 BALB /c，常
规消毒后无菌条件下断头取脑，分离其大脑皮层，剪
碎、消化、过 70 μm细胞筛网、洗涤;加入含 10%胎牛
血清、青霉素(100 U·mL －1)、链霉素(100 mg·L －1)的
DMEM高糖培养基中，调整细胞密度为 1 × 104 /L，接
种于 96 孔培养板中(培养板预先用多聚赖氨酸浸
泡);37 ℃，5%CO2 培养，隔 3 d 换 1 次液;第 5 天加
入阿糖胞苷(终浓度为 2. 5 μmol·L －1)培养 3 d以上，
抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，至第 12 天用于
试验。
2. 2 神经元鉴定 用 4%多聚甲醛固定原代培养
的神经元 30 min，PBS洗涤 3 次。0. 1%聚乙二醇辛
基苯基醚(Triton X-100)通透 15 min，PBS 洗涤 3
次，弃去液体;加入一抗(NF-M，1 ∶ 100)4 ℃过夜。
次晨再加入 FITC标记二抗(1∶ 200，green)室温孵育
60 min，PBS 洗涤、封片，倒置荧光显微镜下观察
拍照。
2. 3 检测细胞活力 神经元培养至第 12 天成熟
时，加入 Aβ(终浓度为 5 μmol·L －1)制备神经元损
伤模型，同时加入不同浓度花旗松素(终浓度为 20，
40，60，80，100 μmol·L －1)，共同孵育 24 h，终止培
养。每孔加入 CCK8 试剂 10 μL，37 ℃孵育 1 h，酶
标仪测定 490 nm 处吸光度(A)。
细胞活力 = A给药组 /A空白组 × 100%
2. 4 检测细胞凋亡［6］ 用 Hoechst 33258 对细胞核
进行染色，可以显示细胞核的变化和凋亡小体。成
熟神经元加入 Aβ(终浓度为 5 μmol·L －1)和花旗松
素(终浓度为 20，40，80 μmol·L －1)处理，共同孵育
24 h后，PBS洗 2 遍，每次 3 min;4%多聚甲醛重悬
细胞，固定;0. 1% Triton X-100 通透;再加入 Hoechst
33258 (0. 5 mg·L －1，pH 7. 4)室温下 10 min，PBS 洗
涤，封片，倒置荧光显微镜下观察。
成熟神经元经过 Aβ(终浓度为 5 μmol·L －1)和
花旗松素(终浓度为 20，40，80 μmol·L －1)处理，共
同孵育 24 h 后，收集各组细胞，冷 PBS 洗 2 次，
Annexin V 避光染色 10 min，离心，弃上清，加入
20 mg·L －1的 PI工作液 100 μL，染色 10 min，离心，
弃上清。缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测细胞凋
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王秋月，等:花旗松素对 β-淀粉样肽损伤神经元的保护作用及机制
亡情况。
2. 5 caspase-3 酶活性测定［7］ 成熟神经元经过
Aβ(终浓度为 5 μmol·L －1)和花旗松素(终浓度为
20，40，80 μmol·L －1)处理，共同孵育 24 h 后，收集
各组细胞，冷 PBS 洗两次，提取蛋白，Bradford 法测
定蛋白的量，分光光度法检测各组 caspase-3 酶
活性。
2. 6 统计学处理 数据均以 珋x ± s 表示，采用 SPSS
16. 0 软件进行单因素方差分析，以 P ＜ 0. 05 为有统
计学意义。
3 结果
3. 1 神经元的鉴定 培养至第 12 天时，神经元已
呈成熟状态，采用免疫荧光法鉴定，显示荧光染色阳
性细胞数占总数 90%以上(图 1)。
3. 2 对神经元活力的影响 CCK8 法检测结果显
示，Aβ 处理后与空白组比较细胞活力明显降低
(49. 2 ± 1. 3)%，而花旗松素能不同程度提高细胞
活力，其中 80 μmol·L －1使细胞活力达(68. 7 ±
3. 2)%，显著高于 Aβ 造模组(P ＜ 0. 01)，说明花旗
松素对 Aβ损伤神经元具有保护作用，见表 1。
(绿色． NF-M +;蓝色． DAPI +细胞核;× 40)
图 1 花旗松素结构式(A)和神经元(B)鉴定
3. 3 Aβ诱导的神经元凋亡的影响 Aβ 处理后，以
皱缩、明亮为特征的凋亡细胞核明显增多;而花旗松
素治疗组，随着花旗松素浓度的增加，凋亡核数量逐
渐减少(图 2)。另外 Annexin V /PI凋亡检测也证实
了这个结果。Aβ 模型组的凋亡率为(50. 8 ±
1. 5)%，与空白组比较明显增加(P ＜ 0. 01)，20，40，
80 μmol·L －1花旗松素治疗组的凋亡率分别为
(47. 8 ± 3. 2)%，(41. 5 ± 2. 7)%，(32. 8 ± 2. 4)%，
表明花旗松素具有抑制 Aβ 诱导的神经元凋亡的作
用。见表 1。
3. 4 对 caspase-3 酶活性的影响 与正常组相比，
Aβ明显提高 caspase-3 酶的活性(P ＜ 0. 01);花旗松
素(40 μmol·L －1)抑制了 caspase-3 的活性，与模型
组相比差异显著(P ＜ 0. 01)。见表 1。
4 讨论
作者通过 CCK8 法对 Aβ 有效的毒性剂量进行
A．正常组;B．模型组;C． taxifloin 20 μmol·L －1;
D． taxifloin 40 μmol·L －1;E． taxifloin 80 μmol·L －1
图 2 花旗松素对 Aβ诱导的神经元凋亡的影响
(Hoechst 33258染色，×40，箭头所指是凋亡神经元)
表 1 花旗松素对细胞活力、细胞凋亡和
caspase-3 活性的影响(珋x ± s，n = 6)
分组
花旗松素浓度
/μmol·L －1
细胞活力
/%
神经元凋亡
/%
caspase-3 活性
/U·μg － 1
正常 － 100. 2 ± 1. 9 2. 5 ± 2. 1 0. 12 ± 0. 02
模型 － 49. 2 ± 1. 31) 50. 8 ± 1. 51) 2. 37 ± 0. 161)
taxifolin 20 51. 7 ± 1. 5 47. 8 ± 3. 2 2. 19 ± 0. 12
40 55. 6 ± 2. 02) 41. 5 ± 2. 72) 1. 77 ± 0. 073)
60 56. 1 ± 3. 22) － －
80 68. 7 ± 3. 23) 32. 8 ± 2. 43) 1. 57 ± 0. 093)
100 69. 1 ± 3. 63) － －
注:与正常组相比1)P ＜ 0. 01;与模型组比较2)P ＜ 0. 05，3)P ＜
0. 01。
筛选，发现 5 ～ 10 μmol·L －1的 Aβ 对神经元有明确
的毒性作用，6 ～ 10 μmol·L －1的 Aβ严重降低神经元
的成活率，因此本实验采用 5 μmol·L －1的 Aβ 用于
后续实验。
CCK8 实验结果证实花旗松素能明显改善 Aβ
损伤神经元的生长状态，使其存活率显著升高。通
过 Hoechst 33258 染色观察到了高剂量花旗松素干
预的神经元浓缩核减少，形态规则，荧光强度较弱，
从形态上证明了花旗松素可以抑制神经元的凋亡。
AnnexinV-PI 流式细胞仪检测进一步证实了花旗松
素神经保护作用是通过抑制细胞凋亡为实现的。
半胱-天冬酶(caspase)家族是参与细胞凋亡过
程一类重要的蛋白酶，其中最重要的是 caspase-
3［8］。Harada［9］通过大鼠皮质神经元的原代培养证
明 β淀粉样蛋白可以导致 caspase-3 含量升高。因此
作者检测了 caspase-3 酶的含量，验证花旗松素对神
经元是否具有抗凋亡作用。结果发现，40 μmol·L －1
花旗松素可以显著抑制 Aβ诱导神经元 caspase-3 酶
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的活性，证明了花旗松素可以抑制 AD 细胞模型中
神经元的凋亡。
综上所述，花旗松素对 Aβ 诱导神经元损伤具
有保护作用，其作用机制是通过影响 caspase-3 的活
性达到抑制神经元凋亡。
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［责任编辑 聂淑琴
檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
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