全 文 ： 基础研究
油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察*
李国平 1, 2 , 黄群策 1* , 杨鹭生 2 , 秦广雍 1
(1.郑州大学离子束生物工程省重点实验室 , 河南 郑州 450052;
2.莆田学院环境与生命科学系 , 福建 莆田 351100)
摘　要:应用激光扫描共聚焦显微镜研究了油杉小孢子的发生过程。油杉样品经曙红-H oechst 33342双染和
冬青油透明后 ,分别以 UV、 488 nm激光进行单扫描或系列扫描 ,并对系列扫描图像进行三维重建。观察结果表
明 , LSCM 图像更能清晰地展示油杉花粉母细胞减数分裂的过程。 粗线期染色体密集并缠绕成一团 , 占据核的
一部分 , 核仁靠在这一团染色体的一边;减数分裂存在扩散双线期;在减数分裂过程中胞质分裂为同时型。观察
到中期 I、Ⅱ形成的纺锤体和四分体时期胼胝质壁的沉积等 。研究结果表明 , 曙红-H oech st 33342双染法可用于
花粉发育阶段的鉴定 , LSCM是研究花粉生物学的理想工具。研究为探究其濒危机制提供有意义资料 , 为其保
护生物学和系统分类学提供胚胎学依据。
关键词:激光扫描共聚焦显微镜;小孢子发生;减数分裂;油杉
中图分类号:Q631
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2006)05-0462-09
TheObservations onM icrosporogenesis inK eteleeria for tunei
w ith Laser Scann ing Confoca lM icroscope
LIGuo-ping1, 2 , HUANG Qun-ce1* , YANG Lu-sheng2 , QIN Guang-yong1
(1. P rovincia lKey Labo ra to ry o f Ion Beam B io-eng inee ring, Zheng zhou University, Zhengzhou 450052, H enan,
China;2. Departm en t o f Env ironm ent and L ife Sc ience, Pu tian Un ive rsity, Pu tian 351100, Fu jian, China)
Abstract:Them icro spo rogenesis inKeteleeria fortunei(M urr. ) C arr. w as investiga ted using la ser scann ing confocal
m icro technic. F o llow ing Eosin /H oechst33342 doub le-staining and m e thy l salicy late c lea ring, the sam ples we re excited
re spective ly by UV and 488 nm lase r to take sing le scanning im age s and seria l scanning im age sw ith a Leica TCS SP2 la-
se r scanning confo ca lm icroscope(LSCM). The LSCM im ages w ere then reconstruc ted w ith the Le icaC on fo cal So ftw are.
The resu lts show ed that LSCM optica l sec tions and h igh contrast im ages prov ided c lea r info rm ation abou t the nuc le ar de-
ve lopm enta l stage o fm ic rospo re, wh ich had p rev iously been difficu lt to de term ine u sing conventionalm icro scopy. Du ring
pachy tene stage o f m eiosisⅠ of the po llen m o ther ce ll(PMC), the chrom osom es com pressed and tw isted toge the r into a
dough, taking up a part o f the nuc lea rw ith a nuc leo lus leaning against the dough. The re w as a d iffuse diplotene stage
during m e io sisⅠ o f PMC . Cy tokinesis a t m eiosis o f PMC w as sim u ltaneous. W ith the staining pro cedure, sp indle at
m e tapha se I、Ⅱ and callo se at te trad could a lso be de tec ted. The se results a lso sugge sted tha t the Eosin /H oechst 33342
doub le-staining technique cou ld be used to high light the deve lopm enta l stage o f po llen and the LSCM was an idea l too l to
study the po llen b io logy. The above study provided no t only the sc ien tific basis for explo ring the endange rm en tm echa-
第 15卷第 5期
2006年 10月 　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　B IOLOGY　SIN ICA　　　　　　　　　　　Vo.l 15 No. 5Oc.t 2006
* 收稿日期:2005-08-01;修回日期:2006-05-10
基金项目:国家 “十五”科技攻关项目(2001BA302B)
作者简介:李国平(1966— ),男 ,福建莆田人 , 莆田学院副教授 ,郑州大学离子束生物工程省重点实验室攻读博士学
位. 研究方向:离子束生物技术. (电话)0371-67766836;(电子信箱 ) p tlgp@ sina. com
*通讯作者
n ism o fKeteleeria fortunei, bu t a lso sign ificant em bryolog ica l ev idences fo r the conse rva tion bio logy and the system a tic bi-
o logy o fKe te leeria.
Key words:lase r scanning confocal m ic roscope;m icro spo rogenesis;m eiosis;Keteleeria fortunei(M urr. ) Ca rr.
　　激光扫描共聚焦显微镜 ( laser scanning confocal
m icroscope, LSCM )是在荧光显微镜技术的基础上发
展起来的 ,是计算机技术 、激光扫描技术 、图像采集
处理技术和显微技术相结合的产物 ,具有独特的共
轭成像装置 、无损伤连续光学切片 、图像三维重组和
多通道检测等功能 ,为生命科学开拓了一条观察细
胞或组织内部微细结构以及在亚细胞水平上观察特
定分子 、离子生物学变化的新途径 ,已成为细胞生物
学和分子生物学等领域中新一代强有力的研究工
具 [ 1-6] 。
油杉 (Keteleeria fortunei (M urr. ) C arr. )属裸子
植物亚门 (Gymnospe rm ae)松科 (P inaceae)油杉属
(Keteleeria),主要分布在我国广东 、广西 、福建 、浙江
南部沿海山地 ,为我国特有树种 ,是古老的孑遗植
物 ,对研究我国南方的植物区系有一 定学术价
值 [ 7-9] 。油杉作为易危 (VU)种 ,已载入 《中国植物
红皮书》[ 10]和《广东省珍稀濒危植物图谱》[ 11] 。为
了探究油杉自然结籽率低的原因及其生殖过程与物
种濒危的关系 ,我们已应用常规压片法和整体染色
透明法对油杉小孢子的发生和雄配子体的发育过程
进行了较详细的观察(已清稿 ,待发表),但鉴于普通
光学显微镜在分辨率 、成像清晰度和深度识别能力
等方面的局限性 ,油杉花粉母细胞减数分裂过程中
的一些主要细节及细胞结构特点仍不甚清楚 。我们
在应用 LSCM观察雪松花粉和花粉管的过程中建立
了一种快速简便的适于在 LSCM 下观察花粉结构和
发育的荧光染色制片程序—曙红-H oechst 33342双
染法 [ 12] 。本文应用此染色制片技术结合激光扫描
共聚焦显微镜术对油杉小孢子发生过程进行观察 ,
可为裸子植物保护生物学及其系统分类提供有意义
的胚胎学资料。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
取自福建省莆田市东岩山上一棵树龄约为 55
年的油杉植株。采取定点 、定株 、定向 、定时采集样
品 。采样时间为 2005年 1月 20日至 2003年 2月 15
日 ,每日上午 1次 ,每次随机采 20个-30个小孢子叶
球序 ,均取自树冠中部东南方向的枝条。仔细剥去
外部包裹的鳞片 ,迅速固定于 FAA液 (50 %酒精 ∶
冰醋酸 ∶36%甲醛溶液配成 89 ∶6∶5的溶液 ),贮存
于 4 ℃冰箱 。
1. 2　方法
1. 2. 1　荧光染色与制片 　曙红染色:材料经
50 %、30 %酒精逐级下行至蒸馏水 ,在 1 m ol盐酸
60 ℃下水解 12 m in,蒸馏水彻底洗净。加入 1 %曙
红水溶液 ,染色 6 h-12 h,倾去染色液 ,加入蒸馏水
换洗数次至水中无浮色。
H oechs t 33342染色:先用柠檬酸-磷酸氢二钠缓
冲液(0. 1 m ol /L , pH 5. 0)预处理 6 h,加入 20 μg /mL
H oechs t 33342染色 12 h-24 h ,倾去染色液 ,用上述
缓冲液换洗数次。
透明过程:经染色的材料在 30 %→ 50 %→
70 %→90 %→95 %→100 %浓度梯度酒精中各脱
水 1 h,在 100 %酒精中脱水 3次 ,每次 2 h ,最后 1次
12 h以上。经脱水的材料以冬青油透明 ,先在冬青
油和 100 %酒精的等量混合液中过渡 2 h,最后在冬
青油中换洗 3次 ,每次 2 h,最后 1次 24 h以上。经
过透明的材料保存于 4 ℃冰箱中。
制片:将透明材料置于滴有丁香油的载玻片 ,用
镊子刺破小孢子囊 ,除去小孢子囊壁等杂质 ,盖上盖
玻片 ,指甲油封片 。
1. 2. 2　激光扫描共聚焦显微镜观察　仪器:Le ica
TCS-SP2 型激光 扫描共 聚焦显 微镜 , 配置 Le ica
DM IRE2研究型电动倒置显微镜。观察参数:将制备
好的载玻片倒放在显微镜上 ,用 20倍 、40倍镜头选
取所需观察对象。启动 LSC软件 ( leica confoca l soft-
w are),选择光路参数 (Bean):Scan M ode =xyz;Scan
Form at =512 ×512 或 1 024 ×1 024;Scan Speed =
400 H z;Bean Exp =6;P inho le =1;Scan D irection =
Uni。分别用 UV激光器 、Ar /A rK r激光器的激光作光
源进行预扫描 , UV激光器激发波长 405 nm ,检测发
射光波长 410 nm-550 nm ,伪彩色采用兰色 ;A r /A rK r
激光器激发波长 488 nm ,激发值为 100 %,检测发射
光波长 492 nm-632 nm ,伪彩色采用绿色。调整
PMT、Zoom及 Position大小 ,直至获取高质量的图像。
通过单次扫描 (single scan)和连续扫描(series scan)
方式进行图像采集 。连续扫描时 ,调节光切片步距
参数及初始切片位和终止切片位 ,对所需观察区域
进行连续光切片。用 LCS操作系统中 V iew、3d、
463第 5期　　　　　　　　　　　李国平等:油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察　　　　　　　　　　
P rocess、Quantify程序 ,对所取系列光切片进行动态
图像显示 、三维重建和图像分析等处理 ,选取部分图
像制成图版 。
2　结果
油杉小孢子发生的主要阶段简述如下:
造孢细胞 　1月 23前的材料处于造孢细胞阶
段 。造孢细胞为多边形 ,彼此相互联在一起 ,体积
小 ,细 胞 核 所 占 的 相 对 体 积 较 大 , 核 仁 明 晰
(图版Ⅰ-1)。
花粉母细胞 　当造孢细胞体积增大 ,彼此间相
互分离 ,造孢细胞分化成为花粉母细胞。花粉母细
胞外形仍为多边形 ,壁薄 ,细胞质浓 ,细胞核较大 ,染
色质处于解螺旋状态 ,难于识别染色体。此时 ,核仁
特别明显 ,通过 LSCM 系列扫描并对图像进行重组 ,
可看出花粉母细胞具核仁 3个 -5个 (图版Ⅰ -2, 3)。
花粉母细胞阶段持续 3天-5天 。
减数分裂　减数分裂期从开始至四分体形成持
续约 15天 ,在减数分裂前期Ⅰ停留非常长的时间 ,
约 13天。前期 Ⅰ可分细线期 、偶线期 、粗线期 、扩散
双线期和终变期 。细线期是减数分裂的开始 ,多边
形的角变钝 ,外形趋于椭圆形或圆形 。染色质螺旋
化 ,出现染色体 ,染色体呈细长的线状结构 ,具核仁 1
个-2个(图版Ⅰ-4)。细线期的每一染色体由两条染
色单体构成 ,但在 LSCM下还难识别其结构上的双重
性 。在偶线期染色体有一定程度的增粗 ,同源染色
体联会 ,核内染色体开始聚集在一起 ,具核仁 1个 -2
个 (图版Ⅰ-5)。同源染色体联会形成二价体 ,但在
LSCM下还不能看清联会在一起的两条同源染色体 。
细线期和偶线期约持续 2天。进入粗线期 ,染色体
明显缩短变粗 ,而且染色体进一步密集并缠绕成一
团占据核的一部分 ,核仁 1个 ,靠在这一团染色体的
一边(图版Ⅰ-6)。粗线期阶段持续 4天-5天 。粗线
期以后 ,油杉的减数分裂并不直接进入典型的双线
期 ,而是进人一个特殊的扩散双线期 ,即染色体不是
继续缩短 ,而是染色体变得相当扩散 ,充满整个细胞
核 ,具核仁 1-2个(图版Ⅰ-7)。扩散双线期持续 5天
-6天。至终变期 ,染色体高度收缩变粗 ,核膜 、核仁
消失 , LSCM下可见二价体中的联会复合体 (图版Ⅰ-
8, 9, 10),但未能分辨二价体形态与交叉情况 。终变
期持续约 1天 ,并很快进入中期 Ⅰ 。中期 Ⅰ出现纺
锤体的牵引丝 ,二价体排列于赤道面上 ,形成赤道板
(图版Ⅰ-11, 12)。后期Ⅰ二价体的两条同源染色体
分开 ,分别向两极移动 (图版Ⅰ-13 , 14),每极中的染
色体数目只有原来的一半。末期 Ⅰ染色体达到两极
(图版Ⅰ-15, 图版Ⅱ-1),并逐渐解螺旋化 ,染色体变
细长(图版Ⅱ-2),核膜 、核仁重新出现 ,形成两个子
核 ,两个核之间不形成细胞壁 ,形成一双核细胞(图
版Ⅱ-3)。减数分裂 Ⅰ结束后 ,有一短暂的减数间期
和前期Ⅱ 。中期Ⅱ又出现纺锤体 ,形成两赤道板 ,染
色体排列于赤道面上 (图版Ⅱ-4, 5)。后期 Ⅱ时每一
染色体的两条染色单体分开 ,移向两极 (图版Ⅱ-6,
7)。至末期Ⅱ ,染色体解螺旋化 ,形成核膜 ,出现核
仁 ,形成 4个子核 (图版Ⅱ-8)。随后进行细胞质分
裂 ,油杉胞质分裂属同时型 ,即四个子核同时地被胼
胝质所分隔 ,形成四分体 ,完成减数分裂过程。
四分体　当减数分裂完成 ,形成的 4个小孢子
被共同的胼胝质壁包围 ,而且在各个小孢子之间也
都有胼胝质分隔(图版Ⅱ-9, 10)。在花粉母细胞减
数分裂前期 I时 ,母细细壁与质膜之间即有胼胝质沉
积 ,整个母细胞为胼胝质包围。当母细胞发育至中
期 I后 ,在减数分裂 I赤道区出现一环绕母细胞的胼
胝质带(图版Ⅱ-11), 该胼胝质环带逐渐向母细胞中
心增厚延伸;当母细胞发育至末期Ⅱ时 ,减数分裂 Ⅱ
赤道区亦形成呈向心增厚的胼胝质带 ,并逐渐向减
数分裂 I时期所形成的胼胝质环带处伸展 ,并与其相
连 ,最终将母细胞分隔为四部份(图版Ⅱ-12)。若减
数分裂Ⅱ中期所形成的两赤道板为平行排列 ,则位
于母细胞两侧的两个胼胝质带面也相互平行 ,由此
形成左右对称形四分体(图版Ⅱ-9);如两赤道板为
垂直排列 ,两侧的胼胝质带面也为相互垂直 ,由此产
生的四分体为四面体形 (图版Ⅱ-10)。当小孢子还
在胼胝质壁内的时候 , 已经开始合成它们自己的细
胞壁 ,在远极面具有略向外突起的气囊 (图版Ⅱ -
13)。四分体时期约持续 4天 -5天 。 2月中旬 ,母细
胞的胼胝质壁解体 ,释放出四个小孢子。
小孢子　刚释放出来的小孢子壁薄 ,单核居中 ,
核体积相对较大 ,具 2核仁 (图版Ⅱ-14)。小孢子具
两个气囊 ,气囊是由花粉外壁外层和内层分开形成
(图版Ⅱ-15)。
464　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 15卷
图版Ⅰ 　李国平等:油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察
P la teⅠ 　L iGuo-pin e t al:The obse rva tions on m icro spo rogenesis inKeteleeria fortuneiw ith LSCM
465第 5期　　　　　　　　　　　李国平等:油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察　　　　　　　　　　
图版Ⅱ 　李国平等:油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察
P lateⅡ　L i Guo-p in e t a l:The observ ations on m ic rosporogenesis inK eteleeria fortunei w ith LSCM
466　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 15卷
图版Ⅲ　李国平等:油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察
P la teⅢ　L i Guo-pin et a l:The observa tions on m icro spo rogene sis inKeteleeria fortune iw ith LSCM
467第 5期　　　　　　　　　　　李国平等:油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察　　　　　　　　　　
图版说明:
图版Ⅰ
图 10, 12, 14:LSCM下 UV扫描图像;其它各图:LSCM 下 488 nm扫描图像
1. 造孢组织;2. 花粉母细胞 , 具 3个核仁;3. 花粉母细胞 , 具 5个核仁;4. 前期Ⅰ 细线期;5. 前期Ⅰ偶线期;6. 前期
Ⅰ 粗线期;7. 扩散双线期;8-10.前期 Ⅰ终变期 , 8示双价体;11-12.中期Ⅰ , 11示纺锤体;13-14.后期Ⅰ ;15. 末期Ⅰ 。
图版Ⅱ
图 1, 5, 7:LSCM 下 UV扫描图像;其它各图:LSCM下 488 nm扫描图像
1-3. 末期Ⅰ , 3为双核细胞;4-5. 中期Ⅱ;6-8. 末期 Ⅱ , 8为四核细胞;9-10. 四分体 , 9为左右对称型 , 10为四面体型;
11. 示环绕花粉母细胞减数分裂 Ⅰ赤道区的胼胝质带;12. 示位于减数分裂 Ⅱ赤道区的胼胝质带将花粉母细胞一极分隔为
两部份;13.示四分体时期气囊开始形成;14.小孢子单核居中期;15. 示小孢子壁由外壁和内壁组成 , 气囊由外壁外层向
外延伸而成。
图版Ⅲ
1-2. 花粉母细胞系列扫描图像(488 nm激发), 1展示该花粉母细胞具 3个核仁;2展示该花粉母细胞具 5个核仁;3.
为图 2的三维重建图 , 并进行旋转显示。
Explanation of P late
P la teⅠ
F ig. 10, 12, 14:The fluorescence w as exc ited by UV w ith LSCM. The o thers:The fluo re scence w as excited a t 488 nm w ith
LSCM.
1. The spo rogenous tissue;2. The po llen mo the r ce llw ith 3 nuc leo li;3. The po llen m o the r ce llw ith 5 nuc leo li;4. The lep to te-
ne stage o f p rophaseⅠ ;5. The zygo tene stage o f p rophaseⅠ ;6. The pachy tene stage of prophaseⅠ ;7. The diffuse dip lo tene stage
o f propha seⅠ ;8-10. The diak inesis stage of prophaseⅠ , F ig. 8 showed b ivalent;11-12. The me taphase stage o fm e iosisⅠ , F ig.
11 ind ica ted spind le form a tion;13-14. The anaphase stag e of m e io sisⅠ ;15. The telophase stage of m eiosisⅠ .
P la te Ⅱ
F ig. 1, 5, 7:The fluo rescencew as excited by UV w ith LSCM. The o the rs:The fluorescence w as exc ited a t 488 nm w ith LSCM .
1-3. The telophase stage of me iosisⅠ , F ig. 3 show ed a b inuclea ted cell;4-5. Them e tapha se stage o fm e io sisⅡ;6-8. The tel-
opha se stage o fm e io sisⅡ , F ig. 8 show ed a quad rinucleated cell;9-10. The te trad stage, F ig. 9 ind icated isobilate ra l tetrad, F ig.
10 ind ica ted te trahed ra l te trad;11. Indicating tha t there wa s a ring-shaped ca llose band fo rm ing in the equato r reg ion of the po llen
m o ther ce ll a fte r them e taphase stage ofm e iosisⅠ ;12. Ind ica ting tha t ca llo se band at the tw o po les extended to the center o f the po l-
len m o the r ce ll and form ed the ca llo sew a ll o f the te trad a fte r te lophase Ⅱ;13. Noting that the air sac s o f po llen occurred during the
te trad stage;14. The uninuc lea tem icro spo re;15. Indicating tha t them icrosporew a ll con tained exine and in tine and the sacs of po l-
len form ed when the sex ine ex tended outwa rd.
P la te Ⅲ
1-2. The LSCM se ria l op tica l sec tions of po llen m o ther ce ll taken a t 488 nm , exhib iting 3 nuc leo li in F ig. 1 and 5 nucleo li in
F ig. 2. 3. Them ax im um projec tion o f the LSCM se ria l op tical sections in F ig. 2 , w hich w as ro ta ted to revea l the three d im ensiona l
structure of the po llen m o ther ce l.l
3　结论与讨论
从油杉小孢子的形成过程看 ,花粉母细胞减数
分裂过程中未见异常情况 ,能形成大量发育正常的
小孢子。减数分裂过程是连续的 ,期间并无休眠阶
段 。花粉母细胞间期核中具核仁 3个 -5个 ,减数分
裂期间母细胞核具核仁 1个-2个。核仁是 rRNA合
成 、加工和核糖体亚基组装的场所 ,在蛋白质合成旺
盛 、活跃生长的细胞中核仁大。花粉母细胞中具多
个核仁正说明此期进行染色质的复制和染色质蛋白
质的合成 ,为减数分裂做物质准备。前期 Ⅰ粗线期 ,
染色体收缩并密集缠绕成一团 ,核仁靠在这一团染
色体的一边;粗线期以后 ,减数分裂进人一个特殊的
扩散双线期 ,染色体变得相当扩散 ,充满整个细胞
核 。油杉减数分裂中粗线期和双线期的核相特征在
被子植物的番茄及裸子植物的侧柏 、花旗松 ( larix
decidua)和 L. occidentalis中也有类似报道 [ 13-15] 。
油杉减数分裂中的胞质分裂属同时型。胞质分
裂时胼胝质壁物质发生有规律的沉积 ,将母细胞分
隔成 4个小孢子。在减数分裂过程中整个花粉母细
胞为胼胝质所包围 ,四分体中各个小孢子之间也都
有胼胝质分隔。一些研究者认为 ,胼胝质使孢子母
468　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 15卷
细胞处于短暂的孤立状态 ,是减数分裂的先决条件 ,
也是四个减数孢子自发地转变为小孢子的前提 ,对
于启动花粉 母细胞朝 向配子 体的发 育是必 需
的 [ 16-18] 。油杉四分体中小孢子的排列有左右对称形
和四面体形两种。四分体类型取决于减数分裂 Ⅱ中
期所形成赤道板的排列 ,也即减数分裂中期 Ⅱ形成
的两个纺锤体的排列 ,若两个纺锤体是交叉的 ,则形
成四面体形四分体;若两个纺锤体平行排列 ,则形成
左右对称形四分体 。肖德兴等也曾对裸子植物杉
木 、黑松 、马尾松和水松花粉发育中胼胝质的沉积规
律与四分体类型的关系进行详细的研究 [ 19-22] 。
油杉减数分裂期从开始至结束持续约 15天 。
笔者 2003年对另一棵油杉的观察结果是 11天 ,这
种差异可能与减数分裂期间环境温度有关 。据郝
水 [ 22] ,减数分裂的持续时间对温度是敏感的 ,温度
越低减数分裂时间越长。油杉减数分裂在前期 Ⅰ停
留约 13天 ,其中扩散双线期持续 5天 -6天 ,比前期
Ⅰ其它各期长 ,而细线期 、偶线期各持续约 1天 ,这
情况与高等植物中的一般规律不同。在植物中一般
双线期比细线期 、偶线期和粗线期都短很多 ,而在人
和许多动物中 ,减数分裂在双线期常停留非常长时
间 [ 23] 。关于油杉减数分裂持续时间的有关问题有
待进一步研究。
人们通常应用醋酸洋红染色压片法和石蜡切片
法在普通光学显微镜下研究植物小孢子的发生和雄
配子体发育 ,但它们在观察效果方面均有其局限性 。
LSCM在分辨率 、灵敏度 、成像清晰度等方面大大地
提高 ,而且能观察样品的空间结构 ,产生真正具有三
维立体感的图像 ,观察效果是普通光学显微镜所望
尘莫及的。由于 LSCM 只能识别荧光信号 ,一般的生
物样品均需用荧光探针标记后才能显示出图像 ,所
以荧光染色技术是激光扫描显微镜术的重要组成部
分 。笔者在应用 LSCM研究雪松花粉结构和发育的
工作中成功地建立了一种快速简便的适于在 LSCM
下观察花粉结构和发育的染色制片技术程序 ,即样
品经曙红 -Hoechst 33342双染后以冬青油透明 [ 12] 。
本文应用此染色制片技术 ,在 LSCM下极好地再现了
油杉小孢子发生过程 ,清晰地显示了其减数分裂过
程中核相的变化 。油杉样品经曙红 -Hoechst 33342
双染 ,可以波长 405 nm的 UV扫描显示其减数分裂
过程中的染色体的动态变化 (图版Ⅰ-10, 12, 14;图
版Ⅱ-1, 5, 7),而以波长 488 nm的激光扫描能高清晰
地显示出花粉母细胞减数分裂各期的整体结构图
像 ,而且也观察到普通光镜下难以看到的一些结构
细节 ,如中期 I 、Ⅱ形成的纺锤体和四分体时期胼胝
质壁的沉积等。 UV 扫描所获取的图像是 H oechst
33342标记染 色体 DNA 后发射 出的荧光信 息;
488 nm扫描所获取的图像则是曙红-H oechst 33342
双标记荧光信息的叠加。这种 “一箭双雕 ”的观察效
果是由于 LSCM具有多通道检测功能 。
LSCM的最大优势之一图像的三维重建与显示 ,
其配置的微距步进马达可实现对样品进行无损伤光
学系列扫描 ,即所谓 “细胞 CT” ,所获得的系列扫描
图像经计算机软件处理可得到一幅能体现样品空间
形态结构且具立体感的三维图像 ,并能对三维图像
的整体结构任意旋转 ,从各个角度进行体视学分
析 [ 24] 。图版Ⅲ -1是 LSCM 对油杉一花粉母细胞的
系列扫描图像 ,经三维重建获得图版Ⅰ-2,显示此花
粉母细胞核具 3个核仁 ;图版Ⅲ -2是另一个花粉母
细胞的系列扫描图像 ,图版Ⅰ -3是其三维重建图像 ,
显示此花粉母细胞核具 5个核仁 ,而从图版Ⅲ -1, 2
中的单帧扫描图像则不能看到这个结构细节。图版
Ⅲ -3是对图版Ⅲ -2中的系列扫描图像进行三维重
建 ,并旋转显示 ,可以看出花粉母细胞中 5个核仁的
空间关系 。
LSCM可以应用于细胞及分子生物学研究的各
个领域 ,可对任何细胞结构(生物膜 、细胞器 、染色体
等 )及分子(蛋白质 、核酸 、脂类等)、离子(C a2+、K +、
H
+)进行定位 、定量 、定时 、动态的观察 。在花粉生
物学领域 , LSCM 已在花粉和花粉管骨架系统 、Ca2 +
动态变化 、信号传导等方面的研究中发挥了重要作
用 [ 6, 25-29] 。本文研究结构表明 LSCM也是研究植物
花粉发育的理想研究工具 。
油杉为我国特有树种 ,为易危 (VU)种 。本研究
可为探究其濒危机制提供有意义资料 ,为其保护生
物学和系统分类学提供胚胎学依据 。油杉小孢子发
生过程中花粉母细胞细胞器 、骨架系统和储存物质
的消长动态变化有待进一步研究。
References
[ 1] 　BLANCAFLOR E B, G ILROY S. Plan tC ell B Iology in the N ew
M illenn ium:New Too ls and New In sigh ts[ J] . Am erican Journa l
o fB otany, 2000, 87:1547-1560.
[ 2] WEBB R H. Theoretical B asis of Confocal M icroscopy[ J] .
M ethod s in E nzym ology, 1999, 307:3-20.
[ 3] 　HEPLER P K, GUNN ING B E S. C on foca lFlu orescenceM icros-
copy of Plan tC ells[ J] . P roto-p lasm a, 1998, 201:121-157.
[ 4] 　WYMER C L, BEVEN A F, BOUDONCK K , et a.l C on foca l
M icroscopy of P lant Ce lls[ J] . M ethod s in M olecu lar B iology,
469第 5期　　　　　　　　　　　李国平等:油杉小孢子发生的激光扫描共聚焦显微镜观察　　　　　　　　　　
1999, 122:103-130.
[ 5] 　LEMON G D , POSLUSZNY U. A New App roach to th e S tudy of
Ap icalM eristem Develop-m en tUsing Laser S canning ConfocalM i-
croscopy[ J] . C anad ian Journal of B otany, 1998, 76:899-904.
[ 6] 　ROSHCH INA V V, YASH IN V A , KONONOV A V. Au to fluo-
rescence of Develop ing Plan tV egeta tive M icrospores S tud ied by
ConfocalM icroscopy and M icrospectrofluorim etry[ J] . Journa l of
F luorescen ce, 2004 (14), 6745-6750.
[ 7] 　林来官. 福建植物志(第一卷)[M ] .福州:福建科学技术出
版社 , 1982:275-277.
LIN Lai-gu an. F lo ra of Fu jian (Volum e 1)[M ] . Fu zh ou:Fu-
jian S cience and Technology Pub lish ing House, 1982, 275-277.
[ 8] 　郑万钧 ,傅立国. 中国植物态(第七卷)[M ] . 北京:科学出版
社 , 1978:34-54.
ZH ENG W an-jun, FU Li-guo. F lora of Ch ina (Vo lume 7)
[M ] . Bei jing:S cien ce Press, 1978:34-54.
[ 9] 　FU L K, LI N, M ILL R R. F lora of C h ina 4[M ] . S t Lou is:
S cien ce Press, Bei jing＆M issouri Bo tan ica lGarden, 1999:42-
43.
[ 10] 　傅立国.中国植物红皮书 (第一册 )[ M ] . 北京:科学出版
杜 , 1992:72-73.
FU L i-guo. The Red Da ta Book of P lan t in Ch ina(V olum e 1)
[M ] . B eijing:Science P ress, 1992:72-73.
[ 11] 　刘玉壶 ,吴容芬 .广东植物志(第四卷)[M ] . 广州:广东科
技出版社 , 2000:12.
LIU Yu-hu, WU Rong-fang. F lora of Guangdong(Vo lum e 4)
[M ] . Guangzhou:Guangdong Science and Techn ology Pub-
lish ing House, 2000:12.
[ 12] 　李国平 ,黄群策 ,秦广雍. 用激光扫描共聚焦显微镜观察雪
松花粉和花粉管 [ J] . 激光生物学报 , 2006 15 (1):1-8.
LI Guo-p ing, HUANG Qun-ce, Q IN G uang-yong. The Obser-
vations on M icrosporogenesis in K eteleeria fortun ei w ith Laser
S cann ing C on focalM icroscope[ J] . Acta Laser B iology S in ica,
2006 15 (1):1-8.
[ 13] 　MOENS P B. A New In terpretation ofM eiotic Proph ase on Ly-
copersicon E scu len-tum (Tom ato)[ J] . Ch rom osom a, 1964,
15:231-242.
[ 14] 　曹玉芳 , 姚敦义 ,许方.侧柏小孢子的发生和雄配子体的形
成 [ J] .西北植物学报 , 1997, 17(2):163-169
CAO Yu-fang, YAO Dun-y i, XU Fang, et a.l S tud ies on the
M icrosporogen es is and th e Form ation of the Ma le Gam e tophy te
in P latycladus O rien ta lis[ J] . A cta B otanica Bore-a li-Occiden-
ta lia S in ica, 1997, 17(2):163-169.
[ 15] 　PWENS I N, MOLDER M. M eiosis in C on ifers:P ro longed
Pachytene and D iffu se Dip lotene S tage[ J] . Can JB ot, 1971,
49:2061-2064.
[ 16] 　KAP IL R N , TIWARI S C. P lan t Em b ryo log ical Investiga tions
and Flu orescence M icroscopy: an Assessm en t of Integrat ion
[ J] . In tRev C yto l, 1978, 55:29 l-331.
[ 17] 　 JOHRI B M. Em bryology ofAng iosp erm s[M ] . Berlin:Spring-
er-V erlag, 1984.
[ 18] 　胡适宜. 被子植物胚胎学 [M ] . 北京:高等教育出版社 ,
1983:30-37.
HU Sh i-y.i Emb ryology of Angiosperm s[ M ] . Bei jing:The
H igh er Edu cation Pub lish ing H ouse, 1983:30-37.
[ 19] 　肖德兴.杉木小孢子发生和花粉发育中的淀粉粒和胼胝体
[ J] .江西农业大学学报 , 1990, 12(4):73-778.
XIAO De-x ing. S tarch G rain and C allose of M icrosporogensis
and Pollen Form ation in C un-n inghania Lan ceolata (Lam b)
HOOK [ J ] . Acta A gricu ltu rae Universitatis Jiangxiensis,
1990, 12(4):73-77.
[ 20] 　肖德兴 ,陈祖铿. 黑松花粉个体发育的研究 [ J] . 植物学
报 , 1990, 32(11):847-851.
XIAO De-xing, CHEN Zu-keng. Investigation on the On togeny
of Pollen in P inus Thunb erg iiPARL[ J] . A cta Botan ica S in ica,
1990, 32(11):847-85.l
[ 21] 　肖德兴.马尾松花粉中的淀粉粒和胼胝体 [ J] . 实验生物学
报 , 1994, 27(1):37-43.
XIAO De-x ing. S tarch G rain and C allose of Pollen in P inus
m asson ian a LAMB[ J] . A cta B iologiae E xperim en talis S in ica,
1994, 27(1):37-43.
[ 22] 　肖德兴.水松花粉中的淀粉粒和胼胝体 [ J] . 江西农业大学
学报 , 1997, 19(3):107-111.
XIAO De-xing. S tarchG rain and C allu s ofPo llen inG lyp tos tro-
bu s pen silis(S taun .t )Koch[ J] . A cta Agricu ltu rae Un ivers itatis
Jiangx iensis, 1997, 19(3):107-111.
[ 23] 　郝水.有丝分裂和减数分裂 [ M ] . 北京:高等教育出版社 ,
1982:150-159.
HAO Shu .i M itos is andM eiosis[M ] . B eijing:The H igh er Ed-
u cation Pub lish ing House, 1982:150-159.
[ 24] 　李楠 , 尹岭 , 苏振伦. 激光扫描共聚变显微微术 [M ] . 北
京:人民军医出版社 , 1997.
LI N an, Y I Ling, SU Zh eng-lun. Laser S canning C on focalM i-
cro techn ic[ M ] . Bei jing:The Peop le M ilitary Su rgeon P ress
H ou se, 1997.
[ 25] 　FRANKLIN-TONG V E. S ignaling and theM odu lation of Pollen
Tube G row th[ J] . P lan t Ce ll, 1999, 11:727-738.
[ 26] 　李岩 ,阎隆飞 ,徐是雄. 百合花粉及花粉管内微丝和微管的
分布 [ J] . 植物学报 , 1998, 40(10):890-894.
LI Yan, YAN Long-fei, XU Sh i-xiong. D istribu tion of F-actin
andM icrotubu les in Pollen and Pollen Tube of Li lium d avid ii
[ J] . A cta Botan ica S in ica, 1998, 40(10):890-894.
[ 27] 　CAMPBELL W F, SALISBURY F B, BUGBEE, et a.l C om-
p arative F lora lDevelopm ent o fM ir-grown and E thylene-treated,
Earth-grow n Super Dw arfW heat[ J] . J P lan t Phys io l, 2001,
158(8):1051-1060.
[ 28] 　MALHO R, READ N D, PA IS M S, et a.l Role of Cy tosolic
Free C alcium in the Reorien ta-t ion of Po llen Tub e G row th[ J] .
The Plan t Jou rnal, 1994 , 5(3):331.
[ 29] 　H ICKS G R, ROJO E, HONG S, et a.l Gem in ating Pollen h as
Tubu lar Vacuoles, D isp laysH igh ly Dyn am ic V acu ole B iogen e-
sis, and Requ iresV acuo less1 for Proper Fun ction1[ J] . P lant
Physio l, 2004, 134:1227-1239.
470　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 15卷