全 文 ：书第29卷第10期
2 0 1 2年 1 0 月
精 细 化 工
FINE CHEMICALS
Vol． 29，No． 10
Oct． 2 0 1 2
中药现代化技术
收稿日期: 2012 － 06 － 26;定用日期: 2012 － 09 － 03
基金项目:卫生部科学研究基金 －福建省卫生教育联合攻关计划资助项目( WKJ2008 － 2 － 55)
作者简介:罗开梅( 1977 － ) ，女，讲师，硕士，电话: 13695998146，E － mail: luokaimei@ yahoo． com． cn。
紫背天葵黄酮的体内外抗氧化作用
罗开梅1，张国广1，陈 凡1，黄轶群2
( 1．漳州师范学院 生物科学与技术系，福建 漳州 363000; 2．福建医科大学附属漳州市医院 血液科，福建 漳州 363000)
摘要:采用体积分数 80%的乙醇提取紫背天葵中的总黄酮并测定其含量，将粗提液萃取，经 AB － 8 型大孔吸附
树脂纯化，以 Vc为对照，测定紫背天葵总黄酮粗提液、纯化液对二苯代苦味酰基自由基( DPPH·) 、羟基自由基
( ·OH) 和超氧阴离子自由基( O2
－·) 的清除能力，并考察紫背天葵黄酮纯化物的体内抗氧化效果。结果表明，
紫背天葵中粗黄酮含量为 13. 928 mg /g，纯化比率为 32. 79% ; 紫背天葵总黄酮粗提液、纯化液对 3 种自由基均有
不同程度的清除作用，且清除作用随黄酮质量浓度的升高而增强，纯化液的清除作用强于粗提液;低剂量紫背天
葵黄酮纯化物实验组小鼠肝脏和脑组织中超氧化物歧化酶( SOD) 活力和肝脏过氧化氢酶( CAT) 活力显著高于
对照组( p ＜ 0. 05) ，而脑中的丙二醛( MDA) 含量显著低于正常对照组( p ＜ 0. 05) 。
关键词:紫背天葵; 黄酮;纯化;自由基; 体内外抗氧化性; 中药现代化技术
中图分类号: R284． 2; Q946． 91 文献标识码: A 文章编号: 1003 － 5214( 2012) 10 － 0937 － 05
Antioxidant Activity of the Flavonoids of Gynura in Vitro and in Vivo
LUO Kai-mei1，ZHANG Guo-guang1，CHEN Fan1，HUANG Yi-qun2
( 1． Department of Biological Sciences and Biotechnology，Zhangzhou Normal University，Zhangzhou 363000，Fujian，
China; 2． Department of Hematology，Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Medical University，Zhangzhou 363000，
Fujian，China)
Abstract: The total flavonoids in Gynura were extracted in volume fraction 80% alcohol and purified，
and their antioxidant activity in vitro and in vivo was studied． After removing impurities，the crude extracts
were purified with type AB － 8 macroporous adsorption resin． The content of the total flavonoids was
determined by spectrophotometry． The antioxidant activity of the total flavonoids in vitro was analyzed by
using different assays with Vc as cross reference，for example，DPPH radical ( DPPH·) scavenging
assay，hydroxyl radical ( ·OH) scavenging assay，superoxide radical ( O2
－ ·) scavenging assay． The
antioxidant activity of the purified flavonoids in vivo was also investigated． The content of total crude
flavonoids from Gynura was 13. 928 mg /g，and the purification ratio was 32. 79% ． The radical scavenging
effect was enhanced with increasing flavonoid concentration． The scavenging effect of the purified
flavonoids was greater than the crude extracts． The level of superoxide dismutase( SOD) activity in the
brain and liver of mice was significantly higher in low doses groups than in normal control groups( p ＜
0. 05) ，so was the level of catalase( CAT) activity in liver． The brain malondialdehyde ( MDA) content
was obviously lower than that of the normal control groups( p ＜0. 05) ．
Key words: Gynura; flavonoids; purification; free radical; antioxidant activity in vitro and in vivo;
modernization technology of traditional Chinese medicines
Foundation item: Supported by Fujian Province Health Education Joint Research Program( WKJ2008
－ 2 － 55)
DOI:10.13550/j.jxhg.2012.10.001
人体内清除自由基的防御体系主要有两套: 一
是酶防御体系，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷
胱甘肽过氧化物酶 ( GPX) 等; 二是非酶防御体系，
如黄酮类、多糖类、维生素 C、维生素 E、维生素 A和
还原型谷胱甘肽( GSH) 等活性肽类［1］。近年来，探
索、筛选具有阻断自由基形成或抑制细胞膜过氧化
活性的药物研究越来越受到人们的关注，其中对天
然黄酮类化合物的寻找更是自由基清除剂研究中的
热门领域之一。
紫背天葵( Gynura bicolor) ，为菊科三七草属多
年生宿根草本植物，因其病虫害少，用药少，是一种
无公害蔬菜。不仅具有润肺止咳、凉血止血、散癌消
肿、消暑除热、助消化等功效［1］，还具有降血糖［2 － 3］、
降血压［3］、降血脂［4］的作用，富含黄酮类化合物、生
物碱、红色素和多糖等多种天然产物和金属微量元
素［2 － 5］。鲁晓翔等研究了紫背天葵中粗黄酮的提取
工艺并对其体外抗氧化性进行了初步评价［6］，本研
究考察了黄酮粗提液和纯化液在体外对多种自由基
的清除作用以及黄酮纯化物在小鼠体内的抗氧化作
用，以期为紫背天葵的利用和合理开发提供参考依
据。
1 实验部分
1. 1 材料与试剂
紫背天葵嫩叶( 2011 年 4 月购于漳州市芗城区
北桥市场) ，雄性昆明小白鼠〔SPF级，购于厦门大学
医学院实验动物中心，动物生产许可证号: SCXK
( 闽) 2008 － 0001〕。
芦丁( 中国药品生物制品检定所，批号: 100080
－ 200707) ; AB － 8 型大孔吸附树脂( 天津南开化工
厂生产) ;二苯代苦味酰基自由基( DPPH) ( 东京化
成工业株式会社) ;超氧化物歧化酶( SOD) 试剂盒、
过氧化氢酶 ( CAT) 试剂盒、丙二醛 ( MDA) 试剂盒
( 南京建成生物工程研究所 ) ; 维生素 E ( Sigma，
USA) 。其他试剂均为 AR。
1. 2 仪器与设备
UFZ － UV － 2102 PC 型紫外可见分光光度计
( 尤尼柯上海仪器有限公司) ; 台式高速冷冻离心机
( Eppendorf) ; Forma － 86 CULT Freezer 型超低温冰
箱( Thermo Scientific Forma) ; BSZ － 100 自动部分收
集器( 上海泸西分析仪器厂有限公司) 。
1. 3 方法
1. 3. 1 紫背天葵粗黄酮的提取
将新鲜紫背天葵嫩叶洗净、沥干，于恒温干燥箱
70 ℃烘干 48 h，冷却后粉碎，过 40 目筛，取紫背天
葵粉末 200 g，按每克紫背天葵粉末加入 20 mL溶剂
的比例加入体积分数 80%的乙醇，于 70 ℃回流提
取 90 min，抽滤，残渣重复提取 2 次。滤液合并，于
70 ℃旋转蒸发浓缩，体积分数 80%乙醇定容至 400
mL。
1. 3. 2 紫背天葵粗提液总黄酮含量的测定
芦丁标准曲线的绘制和样品测定按文献［7］进
行，以芦丁质量浓度 x( g /L) 为横坐标，吸光度 y 为
纵坐标制作标准曲线。准确吸取稀释 100 倍后的样
品提取液 1 mL，按标准曲线相同的方法测定吸光
度，根据芦丁标准曲线计算样品中的黄酮含量。
1. 3. 3 紫背天葵黄酮的纯化
纯化流程按文献［8 － 9］，针对水析加水量、3 种
萃取剂( 石油醚、四氯化碳、乙醚) 、沉降 pH 和时间
的选择以及上样液的 pH，探索得以下纯化工艺: 400
mL粗提液抽滤→1. 5 BV水析→离心→上清液旋转
蒸发浓缩至 200 mL→等体积 CCl4 萃取→水溶性成
分调 pH =8 ～ 9→沉降 6 h→离心→调 pH = 3 ～ 4→
上清液加 6 mL 0. 1 mol /L( NH4 ) 2SO4→乙酸乙酯反
复萃取→有机相浓缩→真空冷冻干燥→200 mL 体
积分数 80%的乙醇溶解，调 pH =6→过 AB －8 大孔
树脂层析柱，体积分数 95%乙醇洗脱→收集洗脱液
→旋转蒸发浓缩。
1. 3. 4 紫背天葵粗黄酮和纯化液对 DPPH·的清
除作用
按文献［10］的方法测定并计算清除率。
1. 3. 5 紫背天葵粗黄酮和纯化液对·OH 的清除
作用
参照 Fenton反应的方法建立反应体系模型，利
用 H2O2 与 Fe
2 +混合产生·OH，邻二氮菲 － Fe2 +水
溶液经·OH 氧化为邻二氮菲 － Fe3 +后，其最大吸
收峰消失，然后测定其吸光度的变化，参照文献
［11］的方法进行测定并计算清除率:
清除率 /% =〔( A2 － A1 ) / ( A0 － A1 ) 〕× 100
式中: A0 为未损伤管的吸光度，A1 为损伤管的吸光
度，A2 为加样品的吸光度。
1. 3. 6 紫背天葵粗黄酮和纯化液对 O2
－·的清除
作用
用邻苯三酚自氧化法测定清除 O2
－·的活性，
按文献［7］的方法进行测定，每组测定 3 次，取平均
值。根据下式计算清除率:
清除率 /% =〔A0 － ( A1 － A2 ) 〕/A0 × 100
式中: A0 为不加样品的对照值，A1 为加样品的测定
值，A2 为样品在体系中的吸光值。
1. 3. 7 体内抗氧化实验
购 180 d 雄性昆明小白鼠 60 只 ( 体重 50 ～ 55
g) ，随机分为 5 组，紫背天葵低中高剂量组每日分别
·839· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第 29 卷
灌胃紫背天葵黄酮纯化物 91. 34、182. 68、274. 02
mg / ( kg·d) ，阳性组每日灌胃维生素 E 100 mg / ( kg
·d) ，对照组每日灌胃 0. 5 mL蒸馏水，经口灌胃 30
d结束后，按文献［12 － 13］方法处理，测定 SOD 和
CAT的活性以及 MDA 的含量，实验数据用 SPSS
13. 0 软件进行统计分析，并进行 LSD多重比较分析
( p ＜ 0. 05) 。
2 结果与讨论
2. 1 粗提液总黄酮含量
测得稀释 100 倍后样品液的吸光度为 0. 064，
根据线性回归方程 y = 11. 764x － 0. 179 ( R2 =
0. 995 4; x为质量浓度，g /L; y 为吸光度) ，计算得出
样品液的总黄酮质量浓度为 6. 964 g /L，由此算出紫
背天葵按此方法提取的总黄酮为 13. 928 mg /g，高
于鲁晓翔等［6］报道的黄酮提取率。
2. 2 黄酮的纯化工艺及纯化比率
纯化过程中水析、萃取，可除去烷基酚、蜡质、叶
绿素等脂溶性杂质，3 种萃取剂中四氯化碳萃取效
果优于石油醚和乙醚。选 pH = 8 ～ 9 进行沉降，可
有效离心除去原花青素、蛋白质、高分子单宁等杂
质，放置 6 ～ 8 h，杂质沉降最彻底。通过柱层析浓缩
后得到黄酮质量浓度为 18. 268 g /L，纯化比率为
32. 79%，在这个过程中黄酮损失了 67. 21%。因本
研究主要考察黄酮粗提物和纯化物的抗氧化性，因
此，样品过柱纯化的工艺还有待进一步优化。
2. 3 体外抗氧化
2. 3. 1 清除 DPPH·的作用
紫背天葵黄酮粗提液和纯化液对 DPPH·的清
除作用见图 1。
图 1 紫背天葵黄酮粗提液、纯化液、Vc对 DPPH·的清除作用
Fig． 1 Comparison of scavenging action against DPPH· of crude
flavonoids，purified flavonoids from Gynura and Vc
由图 1可以看出，紫背天葵总黄酮粗提液、纯化
液、Vc均能清除 DPPH·，且三者的清除能力均随着
质量浓度的升高而增强。紫背天葵黄酮纯化液对
DPPH·的清除能力略低于相同质量浓度的 Vc，但
高于紫背天葵黄酮粗提液。在实验范围内，紫背天
葵黄酮粗提液、纯化液和 Vc 对 DPPH·的清除率分
别达到了 71. 68%、90. 71%和 95. 35%。
2. 3. 2 清除·OH的作用
紫背天葵黄酮粗提液和纯化液对·OH 的清除
作用结果见图 2。由图 2 可知，紫背天葵黄酮粗提
液、纯化液和 Vc对 H2O2 /Fe
2 +通过 Fenton反应产生
的·OH均具有一定的清除能力。随着质量浓度的
升高，三者对·OH 的清除作用均增强，且增大的幅
度大致相同。其中，紫背天葵黄酮纯化液对·OH
的清除能力高于相同质量浓度的 Vc 和黄酮粗提
液。在实验范围内，紫背天葵黄酮粗提液、纯化液、
Vc对·OH的清除率分别达到了 58. 72%、93. 90%
和 77. 62%。
图 2 紫背天葵黄酮粗提液、纯化液、Vc对·OH的清除作用
Fig． 2 Comparison of scavenging action against ·OH of crude
flavonoids，purified flavonoids from Gynura and Vc
2. 3. 3 清除 O2
－· 的作用
紫背天葵黄酮粗提液和纯化液对 O2
－·的清除
能力，实验结果见图 3。
图 3 紫背天葵黄酮粗提液、纯化液、Vc对 O2
－·的清除作用
Fig． 3 Comparison of scavenging action against O2
－· of crude
flavonoids，purified flavonoids from Gynura and Vc
结果表明，三者的清除能力均随质量浓度的增
·939·第 10 期 罗开梅，等: 紫背天葵黄酮的体内外抗氧化作用
大而增大，即清除率与质量浓度之间存在一定的量
效关系。紫背天葵黄酮粗提液和纯化液在一定范围
内其质量浓度与清除率呈显著的线性关系，这可能
是在提取液中黄酮量增加，即有效成分增加，发挥的
抗氧化作用增强。在实验范围，紫背天葵黄酮粗提
液、纯化液和 Vc对邻苯三酚自氧化产生的 O2
－·清
除率分别达到了 79. 82%、96. 33%和 86. 24%，在相
同质量浓度条件下比较，紫背天葵黄酮纯化液对
O2
－·清除率始终最高，Vc次之，粗提液最低。
2. 4 体内抗氧化
2. 4. 1 SOD和 CAT活力
机体抗氧化酶的活力高低反映了机体清除自由
基能力的强弱［13］。SOD 是体内清除 O2
－·的主要
酶，催化 O2
－·歧化为 H2 和 O2，对机体的氧化与抗
氧化平衡起重要作用。SOD 活力的高低可间接反
映机体清除自由基能力的强弱。因体外抗氧化性作
用表明，黄酮纯化液清除自由基能力强于粗提液，所
以进行体内实验时，采用纯化物进行灌胃，SOD 活
力测定结果见表 1，结果显示，5 组小鼠脑和肝的
SOD活力呈抛物线状变化，低剂量组的 SOD活力显
著偏高( p ＜ 0. 05 ) ，与阳性组( 维生素 E) 提高 SOD
活力的水平相当。表明适当剂量的紫背天葵黄酮纯
化物可以显著提高小鼠大脑和肝脏的 SOD 活力水
平。
表 1 紫背天葵黄酮纯化物对小鼠脑、肝 SOD活性的影响( x
± S)
Table 1 Effect of the purified flavonoids from Gynura on the
level of SOD in the liver and brain of mice( x ± S，n =
10)
组别 脑 SOD活力 / ( U /mg) 肝 SOD活力 / ( U /mg)
对照组 42. 51 ± 17. 86a 72. 42 ± 9. 84a
阳性组 166. 9 ± 34. 40b 122. 45 ± 23. 27b
低剂量组 178. 81 ± 38. 38b 115. 51 ± 22. 15bc
中剂量组 84. 14 ± 22. 77c 85. 94 ± 22. 146a
高剂量组 87. 47 ± 14. 28c 93. 26 ± 18. 86ac
注:同列数据后标有不同英文小写字母表示经 LSD 多重比较后
组间差异显著( p ＜ 0. 05) ，标有相同字母者表示组间差异不显著 ( p
＞ 0. 05) ，以下同。
CAT与 SOD一样，属于酶类自由基清除剂，它
可促使过氧化氢( H2O2 ) 分解为分子氧和水，清除体
内的 H2O2，从而使细胞免遭 H2O2 的毒害，是生物防
御体系的关键酶之一。CAT 活力测定结果见表 2，
结果显示，脑的阳性组、中高剂量组和肝的阳性组、
低剂量组 CAT活力显著高于对照组( p ＜ 0. 05 ) ，且
阳性组 CAT 活力最高，但是与 CAT 活力最高的实
验组差异不显著，表明适当剂量的紫背天葵黄酮纯
化物与维生素 E 可以显著提高小鼠大脑和肝脏的
CAT活力水平。但是，其提高抗氧化酶活力的量效
关系、作用机理和有效活性成分还有待进一步研究。
表 2 紫背天葵黄酮纯化物对小鼠脑、肝 CAT活性的影响( x
± S)
Table 2 Effect of the purified flavonoids from Gynura on the
level of CAT in the liver and brain of mice( x ± S，n =
10)
组别 脑 CAT活力 / ( U /mg) 肝 CAT 活力 / ( U /mg)
对照组 4. 11 ± 1. 67a 107. 00 ± 11. 37a
阳性组 10. 20 ± 2. 85b 131. 34 ± 13. 79b
低剂量组 4. 29 ± 0. 96a 123. 22 ± 12. 32bc
中剂量组 9. 94 ± 1. 74b 111. 41 ± 9. 07ac
高剂量组 8. 96 ± 2. 91b 97. 21 ± 9. 99a
2. 4. 2 MDA浓度
MDA是动物体内多元不饱和脂质氧化的终产
物之一，其浓度的高低可以反映体内不饱和脂质的
过氧化程度，间接地反映出细胞膜的损伤程度［13］。
紫背天葵黄酮对小鼠体内 MDA浓度的影响见表 3。
由表 3 可知，脑中空白对照组和其他 4 组 MDA的浓
度差异显著( p ＜ 0. 05 ) ，表明紫背天葵黄酮纯化物
可以显著降低小鼠大脑中脂质过氧化的程度，但降
低肝脏脂质过氧化的作用不明显，不如阳性药物维
生素 E，其降低 MDA 浓度的量效关系、作用机理还
需进一步研究。
表 3 紫背天葵黄酮纯化物对小鼠脑、肝 MDA 浓度的影响
( x ± S)
Table 3 Effect of the purified flavonoids from Gynura on the
level of MDA in the liver and brain of mice( x ± S，n
= 10)
组别 脑 MDA浓度 / ( μmol /L) 肝 MDA浓度 / ( μmol /L)
对照组 3. 69 ± 2. 42a 0. 77 ± 0． 11a
阳性组 1. 08 ± 0. 26b 0. 575 ± 0. 13b
低剂量组 1. 25 ± 0. 47b 0. 71 ± 0． 22ab
中剂量组 1. 47 ± 0. 40b 0. 66 ± 0． 13ab
高剂量组 1. 69 ± 0. 44b 0. 61 ± 0． 15ab
3 结论
( 1) 本文紫背天葵黄酮提取率约为 1. 39%，纯
化比率为 32. 79%。
( 2) 紫背天葵黄酮纯化液具有较强的清除自由
基的能力，对 DPPH·、·OH、O2
－·3 种自由基的清
除能力均随质量浓度的增大而增大，在所试质量浓
度范围内，清除率最大分别达到了 90. 71%、
93. 90%、96. 33%，除了对 DPPH·的清除能力略低
·049· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第 29 卷
于 Vc，对·OH和 O2
－·的清除率强于相同质量浓
度的 Vc和粗提液。紫背天葵黄酮粗提液对各种自
由基的清除能力由大到小依次为 O2
－· ＞ DPPH·
＞·OH，而紫背天葵黄酮纯化液对各种自由基的清
除能力基本相当。
( 3) 适当剂量的紫背天葵黄酮纯化物对小鼠脑
和肝脏组织中 SOD 水平和 CAT 活力有显著的提高
作用( p ＜ 0. 05 ) ，可以显著降低小鼠大脑组织的脂
质过氧化程度 ( p ＜ 0. 05 ) ，有助于增强机体清除自
由基的能力，所试剂量在体内抗氧化活性总体上略
低于维生素 E，紫背天葵黄酮在体内抗氧化活性的
最佳剂量还有待进一步研究。
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·149·第 10 期 罗开梅，等: 紫背天葵黄酮的体内外抗氧化作用