全 文 ：·基础研究 ·
长苞铁杉 nrDNAITS区假基因化
拷贝的克隆及序列分析研究＊
阚显照 1, 2 , 乔才元 1 , 朱国萍 2 , 杨福生 1
(1.中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室 ,北京 100093;
2.安徽师范大学生命科学学院生物大分子进化重点实验室 ,安徽 芜湖 241000)
摘　要:NrDNA作为一个重要的工具 , 在许多分类等级上被广泛地应用于系统发育的分析。 以长苞铁杉
(Nothotsugalongibracteata)为实验材料 , 通过 nrDNAITS区特异拷贝的克隆及假基因化分析 , 在序列水平上探讨
假基因化的特征 , 进而探讨引起多拷贝基因家族假基因化的分子机制 。实验结果表明:假基因化拷贝的序列长
度为 1 745bp, 比其它拷贝短 11 bp～ 12 bp;GC含量明显偏低 , 特别是 5.8 S区和 ITS2区的 GC含量分别比其它
克隆低 6.15 % ～ 6.17%和 5.75% ～ 6.15 %;5.8 S区和 ITS2区序列变异大 , 遗传距离(d)分别为 0.0718+
0.0221和 0.0691+0.0178;在系统发育的分析中出现异常的长枝现象。
关键词:长苞铁杉;核 rDNA;假基因;克隆;序列分析
中图分类号:Q349.55;Q949.66
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2007)02-0208-08
MolecularCloneandSequencingAnalysisonPseudogenizedCopyof
nrDNAITSRegioninNothotsugalongibracteata
KANXian-zhao1, 2 , QIAOCai-yuan1 , ZHUGuo-ping2 , YANGFu-sheng1
(1.StateKeyLaboratoryofSystematicandEvolutionaryBotany, InstituteofBotany, ChineseAcademyof
Sciences, Beijing100093, China;2.TheKeyLaboratoryofBio-macromolecularEvolution,
CollegeofLifeScience, AnhuiNormalUniversity, Wuhu241000, Anhui, China)
Abstract:NuclearribosomalDNA(nrDNA)hasbeenconsideredasanimportanttoolforinferringphylogeneticrela-
tionshipsatmanytaxonomiclevels.BasedonmolecularcloneandsequencinganalysisononeuniquecopyofnrDNAITS
regioninNothotsugalongibracteata, thestructuralcharacteristicsofpseudogenewerestudied.Moreover, wediscussed
themolecularmechanismofpseudogenization.Theresultsshowedthatthelengthofpseudogeniccopywas1 745 bp,
andwas11 bp～ 12 bpshorterthanthatofothers.TheGCcontentofpseudogeniccopywassignificantlylower.Especial-
ly, GCcontentwere6.15 % ～ 6.17 % in5.8 Sregionand5.75 % ～ 6.15 % intheITS2 regionlowerthanthatof
others.Themarkedsequencedistancebetweenpseudogeniccopyandotherswere0.0718 +0.0221 in5.8 Sand
0.0691+0.0178 inITS2 respectively.Phylogeneticanalysesindicatedthatauniquepositionwasinthephylogenetic
treeswithlongterminalbranchlength.
第 16卷第 2期
2007年 4月 　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA　　　　　　　　　　　Vol.16 No.2Apr.2007
＊ 收稿日期:2006-12-04;修回日期:2007-01-09
基金项目:国家自然科学基金 (30400023);国家自然科学基金(30500300);教育部科学技术研究重点项目
(206066);安徽省引进海外留学人才基金(2005Z032)
作者简介:阚显照(1968— ), 男 , 安徽巢湖人 , 中国科学院植物研究所在读博士生 , 安徽师范大学生命科学学院讲
师.主要研究方向:系统与进化生物学.(电子信箱)xianzhao@ibcas.ac.cn;(电话)010-62836641
Keywords:Nothotsugalongibracteata;nrDNA;pseudogene;clone;sequenceanalysis
　　我国特有濒危物种长苞铁杉 (Nothotsugalongi-
bracteataHuexPage)是松科中一个重要类群 ,关于其
系统位置曾经存在一些争论 [ 1] 。研究长苞铁杉 rD-
NA的分子演化机制对于我们理解松科 rDNA演化及
长苞铁杉自身演化特点具有十分重要的意义 。
多拷贝基因是新基因产生 、基因组比较研究中最
基本的研究材料 [ 2-3] 。 rRNA是核糖体重要组成部分 ,
真核细胞则有 4种 rRNA基因 ,即 5 S、5.8 S、18 S和
26 SrDNA。 rDNA基因家族通常被归类为中等重复序
列 , 它的拷贝数从几百到几千 ,位于一个到几个染色
体位点。 45 SrDNA(18 S-5.8 S-26 SrDNA)由转录
单位和非转录的间隔区组成一个重复单位。染色体荧
光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)证
实了 45 SrDNA定位于染色体的核仁组织区(nucleolar
organizingregion, NOR)[ 4] , 但 5 SrDNA作为一个独
立的基因家族 ,它在染色体上的定位与 NORs没有联
系。绝大多数真核细胞转录单位内有 2个内转录间隔
区(ITS1和 ITS2)将 18 S、5.8 S和 26 S基因分开 , 1个
外转录间隔(ETS)位于 18 S的上游 ,转录间隔包含了
加工 rRNA前体的信息。 rDNA相邻重复单位之间由
非转录间隔区 (nontranscribedspacer, NTS)分隔着 ,
NTS也称基因间隔区(intergenicspacer, IGS)。因此 ,
45 SrDNA片段中既包含了重要的功能基因又包含了
不受功能约束的间隔序列。由于其重要的生物学意义
和特殊的序列演化特征 , 45 SrRNA基因序列在分子
进化和系统发育研究中受到极其广泛的关注 [ 5-6] 。
rRNA基因的多项研究表明 ,它的多拷贝不是独
立进化的 ,而是以致同的方式进化 [ 7-12] 。致同进化
就是指由于不等交换或基因转换等机制 ,同一生物
种内或同一基因簇内的基因拷贝发生序列均质化的
进化过程 [ 6, 13-15] 。
如果多基因家族的某个功能基因拷贝在进化的
过程中发生了较多的突变 ,可能产生的结果有 :1.该
拷贝序列被从基因组中删除;2.该拷贝序列和其它
拷贝间发生致同进化作用 ;3.该拷贝失去功能 ,变成
假基因。利用假基因化的拷贝序列进行系统发育重
建是非常危险的。
本研究通过对长苞铁杉 nrDNAITS区一特异拷
贝的假基因化分析 , 在序列水平上探讨裸子植物多
拷贝基因假基因化的特征 ,进而探讨引起多拷贝基
因家族假基因化的分子机制 , 为基因家族在系统发
育重建中的应用提供理论和实践指导意义 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
长苞铁杉(NothotsugalongibracteataHuexPage),
采集地为湖南省新宁 ,凭证标本保存在中国科学院
植物研究所标本馆 ,标本号为 9913。
1.2　总 DNA提取
采用改进的 CTAB法 [ 14] ,材料为硅胶干燥的叶
片 。
1.3　PCR扩增
目的片段的扩增通过聚合酶链式反应 (PCR,
polymerasechainreaction)在热循环仪 Tgradient96 U
thermocycler(Biometre, Gotingen, Germany)上进行。
PCR反应体系 (25 μL):10 ng～ 50 ngDNA模板 , 6.
25 pmol正反向引物 , 0.2 mMdNTP, 2.0 mMMgCl2 ,
0.75 UnitsExTaqDNA聚合酶 (TaKaRa, Dalian, Chi-
na)。扩增引物为位于 18 S末端的 ITS5＊和位于 26
S始端的 26S25R,引物序列及来源参照表 1,引物在
表 1　本研究用于 PCR扩增及测序的引物序列及来源
Tab.1　ThebasecompositionandsourcesofthePCRandsequencingprimersusedinthisstudy
引物 用途 方向 序列 来源
ITS5＊ 基因扩增 正向 5 -GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3 Liston等 , 1996[ 17]
26S25R 基因扩增 反向 5 -TATGCTTAAACTCAGCGGGT-3 Nickrent等 , 1994[ 18]
T7 两端测序 正向 5 -ATTTAGGTGACACTATAG-3 质粒测序通用引物
SP6 两端测序 反向 5 -TAATACGACTCACTATAGGG-3 质粒测序通用引物
NloR 中间测序 反向 5 -CAACCGCGACACACGTGCAAAAC-3 本研究
P2N 中间测序 反向 5 -GAGAGCCGAGATATCCGTTG-3 Wei等 , 2003 [ 28]
209第 2期　　　　　　　　　阚显照等:长苞铁杉 nrDNAITS区假基因化拷贝的克隆及序列分析研究　　　　　　　　　
DNA上的位置见图 2。 PCR反应程序为 :70 ℃ 4
min, 94 ℃变性 40 min, 52 ℃退火 20 s, 72 ℃延伸 2
min30 s, 4个循环;94 ℃变性 20 s, 52 ℃退火 20 s,
72 ℃延伸 2 min30 s, 36个循环 ;72 ℃终延伸 10
min。
1.4　产物的纯化及克隆
PCR产物经 1.5 %琼脂糖凝胶电泳后 ,切下目
的片段并用 GFXTM PCRDNAandGelBandPurifica-
tionKit(Pharmacia)纯化 ,采用 pGEM -TEasyVector
SystemI(Promega)TA克隆试剂盒对目的片段进行
克隆 ,实验步骤按相关试剂盒的说明书进行 。
1.5　质粒的提取及阳性克隆的鉴定
挑取 30 个白 斑 克隆 , 用 含 Amp+ (终 浓 度
50 μg/mL)的 LB液体培养基 37 ℃、260 r/min振荡
培养 10 h-16 h。采用小量碱法进行质粒 DNA的提
取 。用限制性内切酶 EcoRI(TaKaRa, DaLian, Chi-
na)鉴定阳性克隆。对于阳性克隆 ,进一步用四碱基
限制性内切酶 MspI区分不同拷贝类型。
1.6　测序反应
两端测序引物为 T7和 SP6 ,中间测序引物为
P2N和 NloR,序列及来源见表 1,引物在 DNA上的位
置见图 2。 T7和 SP6的序列在载体上分别为正向和
反向 ,但测序产物的方向随外源片段的插入方向不
同而改变。测序反应体系为 10 μL:测序引物 5
pmol, 依目的片段长度加入足量模板 , ET(DYEnam-
icEnergyTransferTerminatorReagentPremixKit, Am-
ershamBiosciences)2.0 μL, 不足体积用双蒸水补
齐 。测序反应程序 :95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s, 53 ℃ ～
57 ℃ 15 s, 60 ℃ 2 min, 30个循环 。退火温度依所测
序列引物的最适退火温度不同而有改动。
采用 95 %乙醇和 3MNaAc(pH5.2)对测序反
应的产物进行纯化 , 避光风干后的产物加入 3 μL
Loadingbufer,在 MegaBACE1000自动测序仪 (Amer-
shamBiosciences, Buckinghamshire, UK)上收集数据
(毛细管电泳 220 V, 145 min)。
1.7　数据处理
ITS1、5.8 S、ITS2区域的边界确定参照其它已有
的序列 [ 19] ;SSR(短亚重复单位 )区域通过其核心
序列(5 -GGCCACCCTAGTC),允许有 20 %序列变
异来界定 [ 20] 。序列校正及拼接用 ContigExpress
(acompomentofVectorNTISuite6.0, InformaxInc.,
2000), 校正好的序列用 ClustalXv.1.81[ 21]进行对
位排列 ,然后用 BioEdit进行手工调整 。 GC含量的
测定用 MEGAv.3.1[ 22]完成 。核苷酸替代模型用
Kimura stwo-parametermodel[ 2 3] , 遗传距离用 DAM-
BEv4.1.19 (XiaandXie2001)完成。
2　实验结果
2.1　异质性 ITS克隆的获得
对长苞铁杉 nrDNAITS区阳性克隆用四碱基限
制性内切酶 MspI区分不同拷贝类型 (图 1), 共获
得四种序列异质性的克隆 , 分别为 Nlo-7、Nlo-9、Nlo-
10和 Nlo-16(注 :Nlo为 Nothotsugalongibracteata的缩
写 ,后面的数字为克隆编号)。
图 1　长苞铁杉 nrDNAITS区阳性克隆的 MspI酶
切图谱
Fig.1　 Restrictionenzyme(MspI)analysisofthe
positiveclonesofnrDNA ITSregioninNothotsuga
longibracteata
2.2　ITS区结构的分析
本研究对长苞铁杉的 4个拷贝类型进行了完全
测序和结构分析 ,序列序列已提交至 GenBank, Gen-
Bank接受号见表 2。
其中克隆 Nlo-7的 ITS全序列见图 2。 IT1区 3
个亚重复单位(subrepeat, SR)的长度分别为 202 bp、
203 bp和 99 bp,它们在 DNA上的具体位置如图 2。
长苞铁杉 ITS区的结构示意如图 3所示 ,可看出长苞
铁杉的 ITS1区由 3个亚重复单位构成 ,每个亚重复
单位都包含一个 13 bp的核心保守序列 (conserved
motif)(5 -GGCCACCCTAGTC)。
210　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 16卷
211第 2期　　　　　　　　　阚显照等:长苞铁杉 nrDNAITS区假基因化拷贝的克隆及序列分析研究　　　　　　　　　
注:图下面为 DNA长度标尺(bp), SR代表亚重复单
位。
Note:Thescale(inbasepairs)atthebottom indicates
relativelengths, SRisabbrevationforsubreapet.
图 3　长苞铁杉 nrDNAITS区的结构及引物在 DNA上
的位置示意图
Fig.3　Schematicrepresentationandprimerpositionfor
theITSregioninNothotsugalongibracteata
2.3　ITS区长度变异的分析
从表 2可看出 , ITS的长度变异范围为 1 745 bp
～ 1 757 bp。我们发现同一基因组内的 4个克隆中 ,
Nlo-7存在着较明显的变异 ,它的 ITS1比另 3个克隆
少 8 bp～ 9 bp, ITS2部分少 12 bp,只有 5.8 S保持
162 bp不变。而 Nlo-9、Nlo-10和 Nlo-16的长度变异
非常小 ,仅一个碱基的差别 。
2.4　ITS区 GC含量的分析
从 GC含量的分析可看出 (表 2), Nlo-9、 Nlo-10
和 Nlo-16三者的 ITS、ITS1、5.8S及 ITS2的 GC含量
的变异都非常小 , 变异辐度分别为 59.02 % ～
59.51 %、59.36 % ～ 59.93 %、51.83 % ～ 51.85 %
和 61.85 % ～ 62.25 %。特异克隆 Nlo-7的 ITS全长
的 GC含量和其它 3个克隆相比相差不大 ,仅低 1.48
% ～ 1.97 %, 但 5.8 S和 ITS2部分却相差很大 ,分
别低 6.15 % ～ 6.17 %和 5.75 % ～ 6.15 %。
2.5　ITS区序列变异的分析
对长苞铁杉四种类型的序列进行比对 ,序列矩
阵全长为 1 761 bp, 其中 1 bp～ 1 350 bp为 ITS1,
1 351 bp～ 1 512 bp为 5.8 S, 1 513 bp～ 1 761 bp为
ITS2。
从序列变异位点的分析 (图 4)可知 , Nlo-9、 Nlo-
10和 Nlo-16三个克隆的突变位点集中在 ITS1区。
以 Nlo-9的序列为参照 , Nlo-10有 32个突变位点 ,其
中有 30个位点在 ITS1区 , 1个位点在 5.8 S区 , 1个
在 ITS2区;在这 32个突变位点中 , 10个为插入或缺
失 , 19个为 CT或 GA转换 , 3个为 CA或 GT颠换。
Nlo-10有 27个突变位点 ,其中 26个在 ITS1区 , 1个
在 ITS2区 , 5.8 S无突变位点;在这 27个突变位点
中 , 9个插入或缺失 , 15个 CT或 GA转换 , 3个 CA或
GT颠换。这 3个克隆的颠换突变均发生在 ITS1区 ,
且占变异位点总数的比例极小。
特异克隆 Nlo-7有 67个突变位点 ,其中有 36个
在 ITS1区 , 12个在 5.8 S区 , 20个在 ITS2区;在这
67个突变位点中 , 17个插入或缺失 , 40个 CT或 GA
转换 , 10个 CA或 GT颠换;在 5.8 S发生 3个颠换 ,
ITS2有 2个颠换 ,这和另 3个克隆的颠换突变均发
生在 ITS1区是明显不同的。
212　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 16卷
表 3　长苞铁杉 4个克隆间的 ITS、ITS1、5.8 S和
ITS2的序列分化(每个基因区域的左下矩阵)及
标准差(每个基因区域的右上矩阵)
Tab.3　Sequencedivergence(lower-leftmatricesof
eachgeneregion)ofITS, ITS1 , 5.8 S, andITS2 a-
mongfourdivergentclones, upper-rightmatricesof
eachgeneregionarestandarderors
基因区域
Generegion
克隆
Clones Nlo-9 Nlo-10 Nlo-16 Nlo-7
ITS Nlo-9 ——— 0.0027 0.0024 0.0042
Nlo-10 0.0126 ——— 0.0014 0.0041
Nlo-16 0.0103 0.0034 ——— 0.0040
Nlo-7 0.0292 0.0280 0.0268 ———
ITS1 Nlo-9 ——— 0.0034 0.0031 0.0035
Nlo-10 0.0151 ——— 0.0017 0.0040
Nlo-16 0.0128 0.0037 ——— 0.0032
Nlo-7 0.0159 0.0159 0.0136 ———
5.8 S Nlo-9 ——— 0.0062 0.0000 0.0234
Nlo-10 0.0062 ——— 0.0062 0.0221
Nlo-16 0.0000 0.0062 ——— 0.0234
Nlo-7 0.0789 0.0718 0.0789 ———
ITS2 Nlo-9 ——— 0.0040 0.0040 0.0185
Nlo-10 0.0040 ——— 0.0000 0.0178
Nlo-16 0.0040 0.0000 ——— 0.0178
Nlo-7 0.0738 0.0691 0.0691 ———
　　另外从 ITS、ITS1、5.8 S和 ITS2的序列分化(表
3)看 , Nlo-9、 Nlo-10和 Nlo-16三个克隆之间的遗传
距离最小 ,有的在 5.8 S或 ITS2部分遗传距离为 0 ,
而特异性克隆 Nlo-7和其它 3个克隆间的遗传距离
较大。 5.8 S区和 ITS2区序列变异大 ,遗传距离 (d)
分别为 0.0718 ±0.0221和 0.0691±0.0178。
2.6　ITS区系统发育的分析
以铁 杉 属 铁 杉 (Tsugachinensis)为 外 类 群
(Tch-4 , GenBankaccessionno.DQ975358 , KanX.-
Z.＆ WangX.-Q.2006), 对长苞铁杉四个 ITS克隆
及的序列进行系统树的构建。图 5为 N-J树 , Nlo-7
存在异常的长枝 ,由于长枝吸引现象 ,从而影响树图
拓扑结构的稳定性 。
图 5　长苞铁杉 ITS克隆序列的 N-J树(以铁杉为
外类群)(枝上数字显示 1 000次 bootstraprepli-
cates支持率)
Fig.5　 Neighbor-joiningtreeconstructedfrom se-
quenceanalysisofITSinNothotsugalongibracteata
withTsugachinensisastheoutgroup(Numbersabove
thebranchesdenotebootstrappercentageswith1 000
replicates)
3　讨论
多拷贝基因的演化途径通常有三种:多功能化 、
亚功能化和假基因化 。一系列的研究 [ 6, 20, 24-30]表明
nrDNAITS区假基因化拷贝有如下特征 :碱基替代率
增加 、GC含量的降低 、二级结构的稳定性下降 、甲基
化位点的减少以及在系统发育树上出现异常枝长的
213第 2期　　　　　　　　　阚显照等:长苞铁杉 nrDNAITS区假基因化拷贝的克隆及序列分析研究　　　　　　　　　
特别位置。NrDNAITS区的假基因最早在玉米中发
现 [ 29] ,和其它正常拷贝相比 ,序列的变异(%)分别
为 6.98 ±4.75(ITS1)、3.27 ±2.38(5.8 S)、11.31 ±
7.56(ITS2),而正常拷贝之间序列变异 (%)辐度为
(1.99 ±1.20)～ (2.64 ±1.42)(ITS1)、(0.41 ±0.
41)～ (1.89±1.20)(5.8 S)、(1.80 ±1.14)～ (2.
26 ±1.23)(ITS2)。可以看出 ,玉米的 ITS假基因在
ITS1和 ITS2两个区域序列的变异较大。在仙人掌
科鸡冠柱属 (Lophocereus)植物中发现的 ITS假基因
在 5.8 S编码区有显著的变异 [ 28] 。在芸苔科 7个属
10个种共 27条 ITS序列中发现有 4个为假基因 [ 31] 。
另外在乌头属 (Aconitum)[ 27] 、栎属 (Quercus)[ 25-26]等
被子植物中均有报道。在裸子植物中 ,松属 、落叶松
属中有报道 [ 20, 24] 。
假基因对系统发育重建的稳定性有重要的影
响 。最著名的例子是对栎属系统发育的研究 , Samuel
等 (1998)和 Manos等(1999)两个独立的研究组利
用 ITS数据对栎属进行系统发育重建 ,这两组研究结
果不相吻合 。 Mayol＆ Rosselo(2001)从 GC含量 、
长度变异 、碱基替代率 、二级结构的稳定性等几个方
面对这二组数据进行分析 ,发现系统发育树的不吻
合主要是因为在 Samuel等的数据中有非功能的并系
拷贝 -假基因的存在。
引起 rDNA家族假基因化拷贝产生的主要原因
是致同进化速率的降低。在进化的历程中 ,某些拷
贝在一些影响功能的重要位点上发生突变 ,包括碱
基的插入 、缺失和替换 ,由于致同进化速率低 ,突变
的拷贝难以通过不等交换或基因转换等分子机制和
其它拷贝均质化 。由于不受功能约束的影响 ,会更
加加快假基因化拷贝的变异 。
引起假基因化的另一个原因是嵌合序列(chime-
ricgene)的出现。有功能的基因片段间发生重组而
导致嵌合序列 ,这种嵌合序列是继续保守原有功能
还是发生假基因化主要取决于功能片段重组的程
度 ,如果这种重组使某些重要功能位点发生改变 ,这
些位点有可能在对 RNA编辑有重要作用的两个转
录间区 ,也可能在保守性很强的 5.8 S区。这些将会
影响基因的表达 ,导致功能的失活而发生假基因化 。
另外 ,重组现象对系统发育的分析也带来一些问
题 [ 6] 。
由于 nrDNAITS区具有拷贝数丰富 、易扩增和演
化速率快等特点 ,被广泛用于系统发育重建 [ 5-6] 。然
而 ,由于基因的多功能化 、亚功能化和假基因化的作
用 ,多拷贝基因用于系统发育重建常常引起诸多混
乱 。在本研究中 ,从 GC含量 、长度变异 、碱基替代率
等指标显示 Nlo-7为一个假基因 。正如我们前面研
究所显示的系统树 ,假基因存在时获得的系统发育
关系是不稳定的。结果表明 ,在利用 nrDNAITS区进
行裸子植物系统发育重建时 ,假基因现象是一个不
可回避的问题 ,应当引起足够的重视。
一系列的研究 [ 10, 18, 22-23, 25-29] 表明 nrDNAITS区
假基因化拷贝有如下特征 :碱基替代率增加或颠换
偏选 、GC含量的降低 、二级结构的稳定性下降 、甲基
化位点的减少以及在系统发育树上出现异常枝长的
特别位置 。
本研究在长苞铁杉中发现的 ITS特异拷贝 ,它的
序列长度为 1 745 bp,比其它拷贝短 11 bp～ 12 bp;
GC含量明显偏低 ,特别是 5.8 S区和 ITS2区的 GC
含量分别比其它克隆低 6.15 % ～ 6.17 %和 5.75 %
～ 6.15 %;另外 5.8 S区和 ITS2区序列变异大 ,与
其它克隆序列间的遗传距离分别为 0.0718 ±0.0221
和 0.0691 ±0.0178;在系统发育的分析中也出现异
常的长枝现象。明显地 ,这是一个 rDNAITS的假基
因拷贝。
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215第 2期　　　　　　　　　阚显照等:长苞铁杉 nrDNAITS区假基因化拷贝的克隆及序列分析研究