全 文 ：Cd
2+ 、Al3+作用下蚕豆 UDS与微核相关性分析及
高等植物 UDS技术初探*
常学秀* * 文传浩 王焕校 (云南大学生物系, 昆明 650091)
摘要 为探讨金属离子对高等植物非按期 DNA合成( Unscheduled DNA Syt hesis,简称 UDS)和微核( MCN )的
诱导作用、二者之间的关联性以及利用高等植物 UDS 技术检测环境诱变物的可行性, 利用3HTdR前体掺入法
研究了 Cd2+ 、Al3+ 作用下蚕豆的 UDS 效应. 结果表明, Cd2+ 、Al3+ 均能不同程度地诱导蚕豆 UDS 和 MCN 的发
生; UDS 量与微核率( MCNF)之间呈负相关( r< 0) ,但相关不显著( | r | < r0. 05) , 且二者间的相关程度在 Cd2+ 和
Al
3+ 两种金属离子作用下没有显著差别( P> 0. 05) ; 利用高等植物 UDS 技术检测环境诱变物质, 在一定受检物
剂量范围内是可靠的, 但超过这个剂量范围, UDS 技术无法检出.
关键词 金属离子 UDS 微核 相关分析 高等植物 UDS 技术
Correlation analysis between UDS and MCN in Vicia faba treated with Cd2+ and Al3+ and UDS technique in higher
plants. Chang Xuex iu, Wen Chuanhao and Wang Huanxiao ( Biology Depar tment, Yunnan Univ ersity , K unming
650091) . Chin . J . A pp l . Ecol . , 1999, 10(5) : 596~ 598.
With the method of inserting 3HTdR into DNA , this paper studied the induct ive effect of Cd2+ and Al3+ on unsched
uled DNA synthesis ( UDS) and micronucleus ( MCN ) in V icia f aba, the correlation betw een UDS and MCN, and
the feasibility of using higher plant UDS test as the indicator to detect environmental mutagens. The r esults indicated
that both Cd2+ and Al3+ could induce UDS and MCN in V icia f aba. There was a negative relat ionship betw een UDS
and MCN , but it w as not significant. T he relationship between UDS and MCN was similar under the treatments of
Cd2+ and A l3+ respectively . It was reliable using higher plant UDS test as the indicator to detect env ironmental muta
gens w ithin certain dosage range.
Key words Metal ion, UDS, MCN , Cor relation analysis, Higher plant UDS test.
* 国家自然科学基金资助项目( 39360020) .
* * 通讯联系人.
1997- 11- 20收稿, 1999- 03- 18接受.
1 引 言
目前,植物微核技术和细胞非按期 DNA 合成( un
scheduled DNA sythesis,简称UDS)技术都已成为检测
环境诱变物的重要手段. 蚕豆根尖微核技术自创建以
来, 由于其简单易行且灵敏度高而一直受到广泛应
用[ 5, 8, 10, 19] .自 80年代以来, UDS试验方法在筛选化
学物质的致癌性、诱变性方面显示出其灵敏度高, 特异
性强等优点[ 11] . 国内外已有许多人利用此方法鉴定多
种环境化学物质的致突变作用[ 6, 22] . 国外亦有不少关
于联合使用 MCN 技术和 UDS 技术监测环境诱变物
的报道[ 15, 20] .研究表明, M CN 和 UDS都与 DNA损伤
有关. 但迄今为止, 尚未见有关二者相关性分析的报
道.另外,目前 UDS 测试方法多用离体培养细胞为材
料,以高等植物为材料者很少. 本文以蚕豆为材料, 研
究了金属离子 Cd2+ 、Al3+ 作用下高等植物 UDS 与
MCN之间的相关性,试图阐明二者间的内在联系. 并
对高等植物 UDS技术检测环境诱变物的可行性进行
初步探讨.
2 材料与方法
2. 1 供试材料
蚕豆( Vicia f aba)品种 8363,由云南省农业科学院豆科研
究所提供.
2. 2 蚕豆培养
选择饱满、大小均匀的蚕豆种子, 蒸馏水冲洗后放在垫有
滤纸的培养皿中(每皿 10 颗种子) , 24 ! 无光培养. 待多数胚根
突破种皮(培养 30h)后 ,用不同浓度金属离子进行染毒处理. 对
照组( CK )用蒸馏水培养.染毒 40h 后将种子冲洗干净, 接着用
蒸馏水恢复培养,待测.
2. 3 蚕豆 UDS 的测定
参照孟祥栋等[ 3]、周晓强等[ 4]、王浩丹等[ 1]的实验方法并
加以改进,将恢复培养了 3h 的萌发种子换至 10mmol∀L - 1 (共
50ml)羟基脲溶液中连续培养 2h. 然后取胚分别置于装有 1ml
标记液的青霉素小瓶中(标记液配方 : 3HTdR 3Ci∀ml- 1 ,青霉
素 G50g∀ml- 1 ,硫酸链霉素 50g∀ml- 1 ,羟基脲10mmol∀L- 1 ) .
24 ! 暗中保温 3h,中间经常摇动通气. 保温后的材料先用自来
水冲洗表面标记物, 再用冷无水乙醇冲洗. 用滤纸吸水后置于
应 用 生 态 学 报 1999 年 10 月 第 10 卷 第 5 期
CH INESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Oct. 1999, 10( 5)#596~ 598
- 20 ! 冰箱中冰冻 20h 以终止细胞活动. 然后用冷无水乙醇在
冰上研磨, 提取定容至 3ml, 2000r∀min- 1离心 20min, 弃上清,
沉淀部分用无水乙醇反复洗涤, 直至游离标记物冲洗干净. 沉
淀加 2ml5% 高氯酸, 70! 水解 40min, 50! 水解过夜. 再加
NaOH中和, 取上清液 0. 5ml, 加 5ml 闪烁液 ( 5gPPO, 0. 3g
POPOP ,溶于 1L 甲苯) . 暗中静置 24h, 于 FJ2101 双道液闪仪
上测定 CPM 值,作为3HTdR 对 DNA 的掺入,其大小表示 UDS
量的大小.
2. 4 蚕豆根尖细胞微核率的测定
材料培养及染毒处理同上.切取恢复培养 8h 的胚根根尖,
放入酒精盐酸离析液 (无水乙醇#盐酸= 1#1 V / V ) 中解离
28min(室温 11 ! ) , 改良品红染色, 常规压片,镜检观察并统计
蚕豆根尖细胞微核率. 每组处理至少观察 1000 个细胞,计算出
微核千分率( MCN∃ ) .
3 结 果
3. 1 Cd2+ 、Al3+ 引起的蚕豆 UDS量与微核率
各处理组引起的蚕豆 UDS量及微核率列于表 1.
3. 2 对数据的方差分析
在表 1的基础上进行的单因素方差分析,结果列于
表 2.其 F检验结果差异极显著, 表明金属离子浓度处
理引起的 UDS量和 MCNF数据与对照组显著不同.
表 1 Cd2+、Al3+诱导蚕豆 UDS及 MCN 的效应
Table 1 Inductive effects of Cd2+ , Al3+ on UDS and MCN in Vicia f aba
L .
离 子
M etalions
浓 度
Con cent rations
( mg∀L- 1)
UDS量( CPM)
Quant ity of
UDS ( CPM)
微核率
MCN
( ∃ )
Cd2+ CK 269 % 12 2. 09 % 0. 11
1 368 % 17 7. 44 % 1. 06
5 369 % 20 16. 18 % 1. 53
10 328 % 19 19. 82 % 0. 86
20 272 % 19 18. 82 % 1. 03
50 263 % 13 14. 36 % 0. 01
Al3+ CK 340 % 13 2. 58 % 0. 08
10 555 % 49 3. 99 % 0. 03
20 680 % 35 9. 09 % 0. 23
50 492 % 25 13. 31 % 0. 32
100 331 % 24 13. 49 % 0. 47
200 325 % 16 11. 14 % 0. 8
表 2 UDS量及 MCNF数据的方差分析
Table 2 Variance analysis of data of UDS quanti ty and MCNF
离 子
M etal ions
指标
Indices
F值
F count F0. 01
Cd2+ UDS 43. 18* * 7. 52
Cd2+ MCNF 98. 00* * 7. 52
Al3+ UDS 77. 04* * 7. 52
Al3+ MCNF 36. 99* * 7. 52
* * P< 001.
3. 3 Cd2+ 、Al3+ 处理下 UDS与 MCNF 相关性分析
在表 1的基础上进行相关分析,结果如下:
等式为: Y = - 0. 1556X+ 65. 9556 ( Y 表示 UDS
量, X 表示 MCNF)
相关系数( rCd) = - 0. 5568
等式为: Y = - 0. 0587X+ 40. 3925 ( Y 表示 UDS
量, X 表示 MCNF)
相关系数( rAl) = - 0. 5259
结果表明, 金属离子作用下, UDS量与 MCNF 之
间呈负相关( r< 0) ,但相关不显著( | r| < r0. 05) .为了探
讨UDS量与 MCNF 在 Cd2+ 作用下的相关程度( rCd)
和Al3+ 作用下的相关程度( rAl )是否具有显著差异,经
对此 2相关系数差数显著性的检验, 结果表明二者差
异不显著( P> 0. 05) ,可认为 UDS量与 MCNF 之间的
相关程度,在 Cd2+ 、Al3+ 两种金属离子作用下没有显
著差别.
4 讨 论
4. 1 UDS与 MCN 的内在联系
结果表明, U DS 量与 MCNF 之间在总体上呈负
相关. 环境诱变物对生物 DNA产生各种方式的损伤,
生物为了维持遗传信息的正确和完整, 在进化过程中
形成了几种酶促 DNA 修复过程(切除修复、复制后修
复、光修复、SOS修复) [ 12] .如果诱变剂诱发的 DNA损
伤能在固定之前被修复, 净效应就等于零. 但是,生物
的这种自我保护机制并非十全十美, DNA损伤可能出
现修复不完全. 染色体断片和 MCN可反映出剩余的、
没有重接的主链断裂, 即 DNA的净损伤[ 2] . 在切除修
复或复制后修复过程中均发生 UDS, UDS 现已作为
DNA修复能力的一项指标[ 9] . 其值的变化说明 DNA
修复能力强弱的不同, 数值高, 表明修复能力强,则所
剩余的未被修复的净损伤就少. 而微核是 DNA 净损
伤在细胞学上的可见标志之一. 从这个意义上来说,
U DS与 MCN 的形成是两个相对立的过程, 二者之间
呈负相关.它反映了环境对生物的胁迫和生物的反胁
迫效应,其内在的逻辑层次关系大体上可表示为:
环境诱变物 引起 DNA 损伤
诱导 DNA 修
复(发生 UDS) 修复不完全 MCN.
结果还表明, U DS 量与 MCNF 之间的这种负相
关并不显著, 说明 DNA 修复作用能部分减少微核的
产生,但这种作用并不明显.其原因是: DNA修复有多
种类型,有的类型修复过程中并不发生 UDS, 如光复
合修复和 SOS 修复, 这些修复不能通过 UDS 技术检
测到, 尽管它们可能存在; 微核不是 DNA 净损伤的唯
一表现形式,基因突变、染色体断裂等都和 DNA净损
伤有关,但大量的染色体畸变不会在细胞间期以微核
的形式表现出来[ 13, 18] ; 微核的产生是多元的, 引起
5975 期 常学秀等: Cd2+ 、Al3+ 作用下蚕豆 UDS 与微核相关性分析及高等植物 UDS 技术初探
DNA损伤的染色体畸变固然是其主要来源,但因纺锤
体受损而在有丝分裂后期滞留的染色体也可形成微
核,经这种途径形成的微核不与 DNA 损伤相联系,因
而也与 DNA 修复无关; UDS 与 MCN 是在不同的生
物学层次上检测 DNA损伤, 它们之间的联系较复杂.
4. 2 高等植物 UDS技术检测环境诱变物的可行性
UDS既是 DNA修复能力的一项指标,又是 DNA
损伤的一项指标,因为如果没有 DNA 的损伤,就不会
有 UDS的发生,只要发现 UDS量的增加,就表明曾经
发生了 DNA 损伤[ 21] . 基于这样一种认识基础而建立
起来的 UDS作为一种筛检化学物质致突变性的遗传
毒理学实验方法,现已广泛应用于医学卫生学实践,国
内外已有许多学者利用此方法鉴定多种环境化学物致
突变作用6, 11, . 20, . 22] .
目前所用的 UDS 检测技术多以动物或人体骨髓
细胞、肝细胞、淋巴细胞等为指示材料[ 15] . 虽然 70年
代开始对高等植物 DNA 修复的研究得到很大发
展[ 14] ,但以高等植物 UDS技术检测环境诱变物质的
方法在国内外尚不多见. 重金属被认为是遗传毒性物
质[ 7, 17] , 我们以蚕豆为材料, Cd2+ 、Al3+ 为受检物质的
UDS研究表明, 高等植物(例如蚕豆)具有发生 UDS
的能力, 并且可以通过 3HTdR 掺入法检测到, 而且
UDS量与 MCNF 在总体上有一定相关性, 说明高等
植物 UDS 技术检测环境诱变剂是可行的. Jackson等
的研究工作早已证明了这一点[ 17] . 不过不同的是, 他
们是以矮牵牛花粉为材料的.
值得注意的是, 利用高等植物 UDS技术检测环境
诱变物时要注意可靠的收检物剂量效应区.从表 1可
见,诱变物浓度过高,产生的损伤数量超出生物自身修
复能力的限度, 同时过高的诱变物会使参与修复过程
的酶等失活[ 16] , UDS 结果呈阴性, 最终会导致漏检.
因此,为了加强检测结果的可靠性,最好将 UDS技术、
微核技术、染色体畸变技术等结合起来使用. 这些技术
各有其优缺点, 任何一种都不能完全替代其余的指标.
可视供试材料的不同而选用适合的方法. 本文仅对高
等植物为材料的 UDS技术作一初步探讨,至于各类受
检物的可靠剂量检测范围以及这种技术在更大范围内
的外推,都需作进一步研究.
致谢 在实验和写作过程中,得到云南大学生物系段昌群教授
的悉心帮助,谨此致谢!
参考文献
1 王丹浩. 1995.生物医学标记示踪技术.北京:人民教育出版社. 21
~ 45.
2 朱任宗、刘 永等. 1987. 辐射生物学. 北京:科学出版社. 703~
717.
3 孟祥栋、李曙轩. 1997.菜用大豆种子活力与 DNA、RNA 及蛋白质
合成的关系.植物生理学报, 18( 2) : 121~ 125.
4 周晓强、傅家瑞. 1993.花生种子萌发早期胚轴细胞 DNA 合成的特
点.植物生理学报, 19( 1) : 77~ 81.
5 金 波等. 1992.蚕豆细胞微核技术监测农业土壤污染研究.环境
科学, 13( 3) : 74~ 77.
6 金炯林、楚建军. 1997. UDS方法评价厨房污染物致突变性作用. 环
境与健康杂志, 14( 1) : 28~ 29.
7 段昌群、王焕校. 1995.重金属对蚕豆的细胞遗传学毒理作用和对
蚕豆根尖微核技术的探讨.植物学报, 37( 1) : 14~ 24.
8 杨 辉、嵇 庆、张锡然等. 1997.蚕豆根尖微核试验法监测土壤污
染的研究.农业环境保护, 16( 1) : 20~ 23.
9 顾瑞琦. 1991.植物 DNA 的损伤修复.见:张德颐等主编.植物分子
生物学和植物基因工程.北京:科学出版社. 180~ 196.
10 嵇庆等. 1994.蚕豆根尖细胞微核法检测 10种脂溶性面霜的致突
变性.环境与健康杂志, 11( 3) : 137~ 139.
11 蔡永庆等. 1988.简化人全血细胞 DNA 非程序合成法检测化学致
癌物研究.肿瘤, 8( 2) : 77~ 78.
12 戴维∀布鲁西克. 1985.遗传毒理学原理.上海:复旦大学出版社. 39
~ 43.
13 Evans, H. J. 1988. Mutation cytogenetics for harzadous matters in
spectat ion . Mutat . Res . , 240: 355~ 363.
14 Gudkov, I. N , , Grodzinsky, D. M . et al . 1976. Induct ion by rradia
t ion of DNA synthesis in radicle cells of germinat ing seeds of Pisum
sat iv um. I nt . J. Radiat . Biol . , 29: 455~ 463.
15 Heidemann, A. , Voelkn er, W. et al . 1996. Genotoxicity of
aloeemodin in vit ro and in vivo. Mu tat . Res. , 367( 3) : 123~ 133.
16 How land, G P. , Hart , R. W. et al . 1975. Repair of DNA strand
breaks af ter gammairradiat ion of protoplast s isolated from cultured
w ild carrot cells. Mu tat . Res. , 27: 81~ 89.
17 Jackson, J. F. , L inskens, H. F. et al . 1982. Metal ion induced un
scheduled DNA synth esis in Petunia pollen. Mol . Gen . Genet . ,
187: 112~ 115.
18 Kihlman, B. A. 1977. Root t ips for studying th e effect s of chemicals
on chromosomes. In: Hollaender, A. ( ed) . Chemical Mutagens. New
York: Plenum Press. 2: 489~ 514.
19 Ma, T. H. , Xu, X. e t al . 1995. The improved Al liumVicia root t ip
micronucleus assay for clastogenicity of environmental pollutants. M u
tat . Res. , 344( 2) : 185~ 195.
20 Ngomuo, A. J . , Jones, R. J. et al . 1996. Genotoxicity studies of
quercetin and shikimate in v iv o in the bone marrow of mice and gastric
mucosal cells of rats. Veterinary and Human Toxici ty , 38( 3) : 176~
180.
21 Penkel, D . , Markus, P. I. et al . 1986. Cytogenet ic analysis using
quant itative high sensit ive fluorescence hybridizat ion. Proc. Natt . A
cad . S ci . UDS . , 83: 2934.
22 Rueff , J , C hiapella, C. et al . 1996. Development and validat ion of
alternative m etabolic systems for mutagenicity testing in short- term
assays. Mutat . Res. , 353( 1~ 2) : 151~ 176.
作者简介 常学秀,女, 27 岁,在读博士研究生, 现从事污染生
态学及环境毒理学研究. 发表论文 4 篇. Email: changxx@ ynu.
edu. cn
598 应 用 生 态 学 报 10卷