全 文 ：CdCl2对质粒的生态效应及质粒在其宿主
抗镉性中的作用*
孟 玲* * 王焕校 谭德勇 (云南大学生物系, 昆明 650091)
摘要 用 CdCl2 处理体外或大肠杆菌体内质粒 pWH58 后, 通过琼脂糖电泳和限制性内切酶分析,研究了 Cd
对质粒 DNA结构的影响. 通过比较带质粒与不带质粒大肠杆菌在含不同浓度 CdCl2 的氨苄 LB与无抗 LB 培养
液中的生长量, 研究了 Cd 对大肠杆菌体内质粒的影响及质粒在其宿主 Cd 耐性的作用. 结果表明, 体外、体内
CdCl2处理对质粒 pWH58 DNA 结构无明显诱变性. Cd 胁迫下大肠杆菌体内质粒 pWH58 可进行复制传代和基
因表达. 质粒 pWH58降低了其宿主 ! ! ! 大肠杆菌HB101的 Cd 耐性, 使其宿主 Cd 耐性最高从 75g∀ml- 1降至
50g∀ml- 1 . Cd驯化处理可提高大肠杆菌HB101的 Cd 耐性, 但经修复培养后其 Cd 耐性趋于回复原有水平, 表
明大肠杆菌 HB101 的 Cd耐性是可诱导的,但此诱导的 Cd 耐性尚无遗传基础.
关键词 CdCl2 质粒 大肠杆菌 耐性
Ecological effect of CdCl2 on plasmid and role of plasmid in Cdtolerance of its host. MENG Ling, WANG Huanx iao
and TAN Deyong ( D epar tment of Biology , Yunnan University , K unming 650091) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2000, 11
(1) : 146~ 148.
After treating the plasmid of Escher ichia coli HB101 by CdCl2 in vitr o or in vivo , the effect of Cd on the structure of
plasmid pWH58 DNA w as studied through arg arose gel electrophesis and restriction fragment length polymorphism
analysis. By comparing t he g rowth o f E. coli w ith and w ithout plasmid cultured in the medium w ith Amp LB and non
anti LB under different concentrations of CdCl2, t he effect of Cd on plasmid E. coli of in vivo and the r ole of plasmid
in Cdtolerance of its host w er e studied. Cd tr eatments of E . coli in v itr o or in v iv o didn# t cause an obv ious change of
the structur e of plasmid pWH58 DNA . Plasmid pWh58 could r eplicate for regeneration and gene express under Cd
stress. Plasmid pWH58 of E . coli in v ivo lowered Cdtolerance of its host fo rm 75mg∀L- 1 to 50mg∀L - 1. Cdtolerance
of E. coli ascended markedly after Cd taming, but had a tr end of reversing to or iginal level after restoration, indicating
that Cdtolerance of E. coli could be tamed, but the tamed Cdtolerance still had no genetic basis.
Key words CdCl2 , Plasmid, Escher ichia coli , Tolerance.
* 云南省应用基础研究基金资助项目( 95C144M ) .
* * 通讯联系人.
1998- 02- 17收稿, 1998- 08- 21接受.
1 引 言
Cd是重要的环境污染物质,对生物有致突、致癌、
致畸的∃三致%作用, 对 Cd的生态毒理, 特别是 Cd的
遗传毒理机制研究一直是生态学家和环境生物学家研
究的热点之一[ 1, 2, 4] . 质粒是一种存在于细菌染色体
外、裸露的双链环状 DNA 分子, 是独立于细菌染色体
外进行复制和遗传的辅助性遗传单位. 质粒含编码某
些酶的基因,这些酶在一定环境下对细菌宿主有利,如
许多质粒上存在的氨苄青霉素抗性基因( amp r ) ,该基
因编码一个酶可催化内酰胺环水解, 从而解除氨苄
青霉素的毒性. 此外,一些质粒的存在也常会干扰其宿
主的生理生化代谢,改变宿主的某些特性[ 5, 7] . 质粒分
子较小,便于研究,质粒为遗传毒理的研究提供了理想
的分子模型.同时,以质粒为实验材料对研究质粒与宿
主的生态关系也具有重要意义.
2 材料与方法
2. 1 质粒与宿主菌
重组质粒 pWH58 以质粒 pBR322 为载体, 从小麦核 DNA
中克隆获得,将此质粒转入大肠杆菌 HB101 中扩增后, 采用碱
裂解法[ 7] 提取出来作为实验材料. 宿主菌为大肠杆菌 ( Es
cher ichia coli) HB101 取自华西医科大学生化教研室.
2. 2 大肠杆菌的培养条件及生长量的测定
大肠杆菌培养采用 LB 液体培养基( LB: NaCl 10g∀L- 1 , 牛
肉膏 10g∀L - 1, 酵母粉 5g∀L - 1, pH 7. 2~ 7. 4) [ 7] ,大肠杆菌接种
量为 1l∀ml- 1, 于 37 & , 100r∀min- 1振荡培养.大肠杆菌生长量
的测定采用 721A 型分光光度计,测定其 OD600值.
2. 3 CdCl2处理
2. 3. 1 CdCl2 处理体外质粒 CdCl2 处理浓度为 0、0. 01、0. 10、
1. 00、10. 00(g∀g - 1 DNA) , 质粒 DNA 样品用消毒三蒸水配
应 用 生 态 学 报 2000 年 2 月 第 11 卷 第 1 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Feb. 2000, 11( 1)∋146~ 148
制,加入相应浓度 CdCl2 后,混匀, 37 & 温育过夜. 然后, 用此质
粒直接进行琼脂糖电泳和限制性内切酶分析.限制性内切酶为
EcoRI 和 TaqI, 电泳和酶切方法见文献[ 7] .
2. 3. 2 CdCl2 处理大肠杆菌体内质粒 将质粒 pWH58 转入大
肠杆菌HB101, 并将带此质粒的大肠杆菌接种于含 50g∀ml- 1
CdCl2 的 LB培养液中, 振荡培养 24h 后, 采用碱裂解法[ 7]将其
抽提出来,抽提出来的质粒立即进行琼脂糖电泳和限制性内切
酶分析.
2.3. 3 CdCl2 处理大肠杆菌 取同一批保种储藏的带质粒
pWH58 的大肠杆菌和不带质粒的大肠杆菌 HB101 经划板、挑
单菌落摇瓶活化后,分别同时接种于含不同浓度 CdCl2 ( 50、75、
100、125g∀ml- 1 )的 LB 培养液中,带质粒的大肠杆菌还被同时
接种于含不同浓度 CdCl2 的氨苄 LB( Amp: 50g∀ml- 1 )培养液
中,振荡培养 24h 后, 测定各处理大肠杆菌生长量. 首先将活化
后的带质粒或不带质粒的大肠杆菌接种于 50g∀ml- 1CdCl2 的
培养液中, 培养 24h 后, 再分别转接于含 75g∀ml- 1CdCl2 的培
养液.以此类推, 最后转接于含 125g∀ml- 1CdCl2 的培养液中.
每一梯度 CdCl2 处理 24h 后, 均测定大肠杆菌生长量. 经连续
CdCl2 浓度梯度处理、在含 125 g∀ml- 1CdCl2 的培养液中培养
24h后的带质粒和不带质粒的大肠杆菌被分别转接于不含任
何污染物的 LB 培养液, 连续修复 12h(修复 6h 后转接一次 ) ,
然后,又被分别同时接种于含不同浓度 CdCl2 的培养液中, 培
养 24h, 测定各浓度 CdCl2 处理后大肠杆菌的生长量.
3 结果与分析
3. 1 CdCl2对质粒 DNA结构的影响
从图 1a可见, 经不同浓度 CdCl2 体外处理后, 质
粒 pWH58的超螺旋状、线状、缺口环状 DNA 的电泳
迁移率和泳带的强度均无明显变化, 且电泳带位置集
中无拖尾现象.处理后的质粒经限制性内切酶 EcoRI
和 TaqI酶切后, 在处理与对照间、不同浓度处理间的
酶切片段数和片段的迁移率均无明显改变, 酶切效果
在各处理间也无明显差异. 图 1b显示质粒 pWH58在
大肠杆菌体内经 50g∀ml- 1CdCl2连续处理 24h 后,其
DNA琼脂糖电泳和限制性内切酶 EcoRI 和 TaqI酶切
结果与对照相比也无任何明显变化.
通过质粒DNA的琼脂糖电泳可检测质粒的受损
图 1 CdCl2 处理质粒 pWH58 DNA 的琼脂糖电泳和限制性内切酶图谱
Fig. 1 Pat tern of argarose gel elect rophesis and RFLP of plasmid pWH58 DNA af ter CdCl2 treatm ent.
a)CdCl2 体外处理 Treatment of C dCl2 in v i tro. 1~ 5: 琼脂糖电泳 Argarose gel elect rophesis; 6~ 10: EcoRI 酶切( 0. 7% : 琼脂糖胶) EcoRI Digest ion
( 0. 7% argarose gel) ; 11~ 15: TaqI 酶切( 2% :琼脂糖胶) TaqI digest ion( 2%argarose gel ) . 1, 6, 11: CK; 2, 7, 12: 0. 01; 3, 8, 13: 0. 10; 4, 9, 14: 1. 00; 5,
10, 15: 10. 00 (g∀g- 1DNA) . b) CdCl2 大肠杆菌体内处理T reatment of CdCl2 of E. col i in v i v o . 1, 2:琼脂糖电泳 Argarose gel elect rophesis; 3, 4: EcoRI酶切( 0. 7% :琼脂糖胶 ) EcoRI digest ion ( 0. 7% argarose gel ) ; 5, 6: TaqI 酶切 ( 2% :琼脂糖胶: ) T aqI digest ion( 2% argarose gel) . 1, 3, 5: CK; 2, 4, 6:
T reatment .
情况, 如果质粒 DNA 发生单、双链断裂或解链, 则琼
脂糖电泳后, 质粒 DNA 的超螺旋带会减弱, 线状、缺
口环状带会增强,如果 DNA 链断裂严重, 电泳带还会
发生拖尾现象. 限制性内切酶酶切结果直接反映 DNA
的结构信息, 如果质粒 DNA 的 1级结构发生改变或
高级结构发生粘链、缩合等异常现象时, DNA 切酶后
会出现多态性且酶切效果会改变. 由此可以推断, Cd
Cl2不能直接造成质粒 DNA 链的随机断裂, 对质粒
DNA结构的诱变性也不强.
3. 2 Cd对大肠杆菌体内质粒 pWH58的效应及质粒
在大肠杆菌 Cd耐性中的作用
质粒 pWH58为一以 pBR322为载体的重组质粒,
载体部分含原核生物可以识别的复制起点( ori) ,氨苄
抗性基因( ampr)和四环素抗性基因( tet r) , 外源 DNA
正好插入载体的四环素抗性基因部位使其失活.此质
粒的外源插入子部分为一小麦核 DNA 片段, 其上不
含原核生物转录启动子, 故不能在大肠杆菌中表达.因
此,质粒 pWH58只具有在大肠杆菌中复制并表达氨
苄抗性基因的能力, 可使宿主菌在氨苄培养基中生长.
从表 1、2可见, 在各种 Cd处理情况下, 生长在氨
苄与无抗培养基的带质粒大肠杆菌的生长量相比均无
明显差异,说明氨苄青霉素存在与否不影响大肠杆菌
在含 Cd培养基中生长.根据此结果可推断 Cd 处理不
能消除大肠杆菌体内质粒, 质粒可在 Cd 胁迫下进行
复制传代并表达其上氨苄抗性基因, 它表明质粒可在
Cd胁迫下维持一定的活性和功能, 也表明 Cd对质粒
DNA结构的破坏性和诱变性不太强,因为结构与功能
是统一的.
1471 期 孟 玲等: CdCl2 对质粒的生态效应及质粒在其宿主抗镉性中的作用
从表 1可见, 大肠杆菌 HB101可在含 75g∀ml- 1
Cd的培养基中生长, 但带质粒 pWH58 的大肠杆菌只
能生长于含 50g∀ml- 1Cd的培养液中. 大肠杆菌 Cd
浓度梯度耐性驯化实验结果也显示, 带质粒大肠杆菌
的Cd驯化效果低于不带质粒大肠杆菌, 质粒 pWH58
的存在降低了宿主菌对 Cd诱导适应性(表 2) . 以上结
果表明质粒pWH58可降低宿主菌 ! ! ! 大肠杆菌的 Cd
表 1 Cd处理大肠杆菌 HB101的 OD600值
Table 1 OD600 of E. coli HB101 under Cd treatment
Cd浓度
Cd concent rat ion
( g∀ml- 1)
H B101 HB101+
pWH58
HB101+
pWH58+ Am p
50 1. 448 1. 524 1. 506
75 1. 465 0. 075 0. 083
100 0. 053 0. 094 0. 062
125 0. 035 0. 075 0. 086
耐性.
胡彦民[ 5]报道质粒的存在使大肠杆菌对某些噬
菌体产生抗性, 并认为其原因可能是质粒改变了大肠
杆菌细胞壁上噬菌体附着的识别位点或者质粒可能影
响到噬菌体在大肠杆菌内的复制和装配环节.从本实
验结果来看, 在 Cd 胁迫下, 质粒 pWH58在大肠杆菌
体内可保持一定的结构和功能完整性, 但质粒 pWH58
的功能比较单一,可进行复制,基因产物只有氨苄青霉
素降解酶. 从实验结果推测,质粒 pWH58可能不是主
要以其 DNA产物,而是以质粒 DNA 分子本身干扰大
肠杆菌的代谢过程, 可能在与宿主细菌争夺复制位点,
竞争 DNA 合成原料和酶等方面干扰了宿主的生长代
谢,进而降低宿主菌 Cd耐性,但质粒降低宿主细菌 Cd
表 2 Cd耐性驯化时大肠杆菌 HB101的 OD600值
Table 2 OD600 of E. coli HB101 in the taming of Cdtolerance
Cd浓度 Cd conc.
( g∀ml- 1)
Cd驯化T aming of Cd
HB101 H B101+ pWH58 HB101+ pWH58+ Am p
修复后 Cd处理 Cd treatment after restorat ion
HB101 HB101+ pWH58 HB101+ pWH58+ Amp
50 1. 514 1. 495 1. 506 1. 510 1. 504 1. 498
75 1. 450 1. 385 1. 429 1. 470 0. 458 0. 324
100 1. 150 0. 673 0. 868 0. 067 0. 062 0. 058
125 0. 783 0. 468 0. 412 0. 072 0. 041 0. 065
耐性的内部机理有待进一步深入研究.
3. 3 大肠杆菌 Cd耐性驯化
由表 2可见,大肠杆菌经低浓度至高浓度连续 Cd
浓度梯度处理后, 其 Cd 耐性从 75g∀ml- 1提高至
125g∀ml- 1,但经 12h 的修复培养(约 36代)后, Cd耐
性又趋于回复原有水平, 表明大肠杆菌对 Cd 胁迫的
诱导适应只是一种生理适应, 尚缺乏遗传基础.这一结
果与杨居荣等[ 3]在植物细胞培养得到的结果相似. 生
物对环境的生理适应往往是其遗传适应的前奏, Cd耐
性诱导实验结果显示了大肠杆菌对胁迫环境的快速生
理适应能力,此结果与微生物适应性强、生态进化速度
快的特性吻合, 与一些在植物上的研究结果相似[ 3, 6] .
参考文献
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豆根尖微核技术的探讨.植物学报, 37( 1) : 14~ 24
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Press.
作者简介 孟玲, 女, 33 岁, 讲师, 现为中国科学院昆明植物研
究所植物化学博士研究生,研究方向为分子生态学与化学生态
学,已发表论文 10 篇. Email: lingmeng@ ynu. edu. cn
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