全 文 ：苏云金芽孢杆菌质粒的检测及功能的初步研究*
李 林* 王 征 喻子牛 (华中农业大学农业微生物农业部重点实验室, 武汉 430070)
摘要 用改进的酶碱综合法检测了苏云金芽孢杆菌 4个亚种 11 个野生菌株的内生质粒, 获得良好的制备结
果和重现性. 对野生菌株 YBT1463 及其无质粒突变株 BMB171 的形态和生理生化特性的比较研究结果表明,
YBT1463 的内生质粒携带杀虫晶体蛋白基因, 但不携带抗生素的抗性基因, 且与该菌株对 19 种 C 源和 12 种
N 源的利用无关.
关键词 苏云金芽孢杆菌 质粒 检测 功能
文章编号 1001- 9332( 2001) 06- 0879- 04 中图分类号 Q343 4 文献标识码 A
Detection of Bacillus thuringiensis plasmids and preliminary studiy on their functions. LI L in, WANG Zheng and
YU Ziniu ( Key L aboratory of Agr icultural M icr obiology , M inistry of Agr icultur e, H uaz hong Agr icultural Univer
sity , Wuhan 430070)Chin. J . A pp l . Ecol . , 2001, 12( 6) : 879~ 882.
The plasmids carr ied in 11 Bacillus thuringiensis w ildtype str ains of 4 subspecies w ere detected using t he improved
lysozymealkaline pr eparat ion procedure, and an effect ive preparation r esult and r ecovery was found. By comparing the
morpholog ical, physio logical and biochemical proper ties between w ildtype strain YBT1463 and its plasmidfr ee mu
tant strain BMB171, it was indicated that t he plasmids of YBT1463 carried insecticidal cr ystal protein genes, but no
resistance genes. Ther e was no relat ionship between resident plasmids and utilising of 19 sources of carbon and 12
sources of nitrogen in the wildtype str ain YBT1463.
Key words Bacillus thur ingiensis , Plasmid, Detection, Funct ion.
* 国家! 863计划资助项目( 101030101) .
* * 通讯联系人.
1999- 07- 12收稿, 1999- 11- 11接受.
1 引 言
苏云金芽孢杆菌 ( Bacil lus thur ingiensis ) 是一种
土壤芽孢杆菌, 其在芽孢形成过程中合成的杀虫晶体
蛋白能包装成特征性的伴孢晶体[ 1, 17, 20] . 编码这些杀
虫晶体蛋白的基因通常定位于内生质粒上[ 7~ 9, 11] , 少
数定位于染色体上[ 10, 11] . 此外,该菌的质粒一般还携
带伴孢晶体合成的调节基因[ 1, 18] , 或与苏云金素、细
菌素的产生等有关[ 6, 12, 13] .通常可采用质粒消除和质
粒转移两种途径来研究苏云金芽孢杆菌质粒的功能,
而对质粒的有效检测是研究质粒功能时所必需的. 已
报道的质粒检测方法有碱法[ 4, 5]、裂解法[ 8, 11]和酶碱
综合法[ 16]等.但在研究中发现,这些方法提取并检测苏
云金芽孢杆菌质粒的效率不高,重现性也较差.为此,本
文对酶碱综合法进行了改进,并用该方法检测了该菌 4
个亚种 11个野生菌株的质粒,然后通过完全消除野生
菌株YBT1463的质粒,以及无质粒突变株与出发菌株
的部分形态及生理生化特性的比较,对野生菌株 YBT
1463携带的内生质粒的功能进行了初步的研究.
2 材料和方法
21 供试材料
211 供试菌株 苏云金芽孢杆菌野生菌株 HD1 属库斯塔
克亚种 ( subsp. kur staki ) , 菌株 HD2 属苏云金亚种 ( subsp.
thur ingiensis ) , 均由法国巴斯德研究所 de Barjac博士惠赠; 菌
株 BMB173、YBT1221、YBT1354、YBT1463、YBT1520、YBT
1535 和 YBT9603 属库斯塔克亚种, 菌株 YBT1416 属鲇泽亚
种( subsp. aizawai) , 菌株 YBT9601 属拟步行岬亚种 ( subsp.
tenebr ionis ) ,均由本室分离保存.
212 培养基 1) LB 培养基: 用于质粒检测和菌种培养, 其
成分见文献[ 15] ; 2) SCG培养基: 用于质粒消除实验, 成分参见
文献[ 8] ; 3 ) 芽孢杆菌基本培养基: MgSO 4∀ 7H2O 002% ,
NaH2PO4 0 05% , CaCl2∀2H2O 0 01% , K2HPO4∀3H2O 0 5% ,
pH 70~ 7 2, 用于对 C 源和 N 源物质的利用实验.
22 研究方法
221 苏云金芽孢杆菌质粒的制备 将待检菌株在 LB 平板
上划线,置 30 # 过夜培养后, 取单菌落接种于 5ml试管( 18mm
∃ 180mm)培养液,倾斜 45%固定于恒温摇床上, 于 30# 、190r∀
min- 1振荡培养至 OD600的值为 0 3~ 05 时,离心收集菌体, 以
STE 溶液[ 15]离心洗涤菌体 1 次, 加入 100l 溶液 I[ 15]悬浮菌
体,再加 30mg∀ml- 1的溶菌酶 20l, 混匀后于冰浴放置 1h 以
上,其余操作见文献[ 15] .
222 苏云金芽孢杆菌质粒的检测 用 065%琼脂糖凝胶电
泳来检测质粒谱带,参照文献[ 15]进行.
223 苏云金芽孢杆菌质粒的消除 将野生菌株 YBT1463 逐
级升温到 42# 、44# 和 46# 培养,并在46# 条件下,在SCG培养基
中加入005%十二烷基磺酸钠( SDS)进行点种培养,抽提转接物内
生质粒,并电泳检测质粒谱带,直至内生质粒被完全消除.
应 用 生 态 学 报 2001 年 12 月 第 12 卷 第 6 期
CH INESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Dec. 2001, 12( 6)&879~ 882
224 扫描电镜观察 将培养物置碎盖玻片上进行离子溅射,
40 kV下用 JEOLJEM 1200EX型扫描电镜进行观察并拍照.
225 抗药性的测定 配制含系列浓度的抗生素 (购自华美
公司)的 LB平板 ,接种待检菌株并置 30# 培养 48h 后, 观察生
长情况.
226 对 C 源和N 源利用的测定 将碳源和氮源物质配成贮
备液, 经 0 55 ∃ 105Pa灭菌 15 min 后, 配制含有芽孢杆菌基本
培养基成分的平板,使 C 源和 N 源物质的终浓度为 0 5% . 将
待检菌株培养物用灭菌生理盐水洗涤 2~ 3 次后, 接种于相应
C、N 源平板, 于 30 # 培养 48h 后观察生长情况, 并分别以接种
基本培养基和 LB 培养基的培养物作阴性和阳性对照.
3 结果与分析
31 苏云金芽孢杆菌质粒的检测
用改进的酶碱综合法制备了 4 个亚种 11个野生
菌株的质粒,其电泳检测的制备物的电泳图谱见图 1.
图 1 苏云金芽孢杆菌 11株野生菌株的质粒电泳图谱
Fig. 1 Electrophoret ic profile of plasm ids isolated from w ildt ype strains of
11 Baci llus thuringiensis .
1YBT9601, 2YBT1520, 3YBT9603, 4YBT1221, 5YBT1345,
6YBT1354, 7YBT1416, 8YBT1463, 9YBT1535, 10HD1,
11HD2.
由图 1可见, 11株苏云金芽孢杆菌野生菌株的质
粒谱带在质粒带数与大小上存在明显差异. 如拟步行
岬亚种的 YBT9601仅有 6 条质粒带, 苏云金亚种的
HD2有 8 条质粒带, 鲇泽亚种菌株 YBT1416 有 11
条质粒带, 而库斯塔克亚种菌株 YBT1221、YBT1463
和HD1的质粒带数达 14条. 从质粒分子量上看, 最
小的仅 15 kb(如 YBT1463) , 最大的在 150kb 以上
(如 YBT1221) .另外,图 1也反映出采用改进的酶碱
综合法具有较好的制备效果, 除个别质粒带( 大于
150kb)带型稍弱外,其余质粒带均清晰可见.
通过检测菌株BMB173分8批制备的总质粒的电
泳谱带,考察了该方法的重现性(图 2) .由图 2 可见, 8
批苏云金芽孢杆菌菌株 BMB173 质粒制备物的电泳
谱带完全一致, 反映出改进的酶碱综合法具有良好的
重现性.
图 2 苏云金芽孢杆菌菌株 BM B173的 8批质粒制备物的电泳图谱
Fig. 2 Elect rophoret ic prof ile of 8 batch of plasmid preparat ions isolated
f rom Baci llus thuringiensis st rain BMB173.
Lane 1~ 8 plasmids of 8 batches of preparat ions of st rain BMB173.
32 苏云金芽孢杆菌野生菌株 YBT1463内生质粒
的消除
将野生菌株 YBT1463逐级升温到 42 # 、44 # 和
46 # 进行培养,并在46 # 培养条件下进一步用005%
图 3 苏云金芽孢杆菌野生菌株 YBT1463和无质粒突变株 BMB171
的质粒电泳图谱
Fig. 3 Electrophoretic prof ile of plasmids isolated from w ild type strain YBT
1463 of Bacil lus thuringiensis and it s plasmidfree mutant strain BMB171.
1YBT1463, 2BMB171; 3HD2(作为质粒分子量标准参照物 As the
plasm id mol .w t . marker) .
880 应 用 生 态 学 报 12卷
SDS 进行处理, 以完全消除其内生质粒,结果得到 1株
无质粒突变株 BMB171. BMB171 和出发菌株 YBT
1463的质粒电泳图谱见图 3.
33 苏云金芽孢杆菌质粒的功能
331 质粒与伴孢晶体形成之间的关系 将野生菌
株YBT1463和无质粒突变株分别接种于LB培养液,
于 30 # 以 190r∀min- 1振荡培养至孢晶分离,其培养物
的扫描电镜观察结果见图 4.由图 4可见,无质粒突变
株 BMB171的芽孢形态和大小与出发菌株 YBT1463
未见明显差异, 但 BMB171 不形成伴孢晶体, SDS
PAGE 电泳结果也显示该突变株不产生杀虫晶体蛋白
(未显示图片) , 这反映出野生菌株 YBT1463的杀虫
晶体蛋白基因定位于其内生质粒上.
332 质粒与宿主菌抗药性的关系 野生菌株
图 4 扫描电镜观察的苏云金芽孢杆菌野生菌株 YBT1463 与无质粒
突变株 BMB171培养物的形态 ( 9000∃ )
Fig. 4 Elect ron micrographs of cultures from wildtype strain YBT1463 of Bacil
lus thuringiensis and it s plasmidfree mutant st rain BMB171 (9000∃ ) .
1YBT1463, 2BMB171,PC伴孢晶体 Parasporal crystal, S 芽孢 Spore.
YBT1463和无质粒突变株 BMB171在含不同浓度 10
种抗生素的 LB平板上的生长情况见表 1.
表 1表明, 除对氨苄青霉素具有抗性外, 野生菌株
YBT 1463及无质粒突变株BMB171对其它抗生素均
表 1 苏云金芽孢杆菌野生菌株 YBT1463和无质粒突变株 BMB171对 10种抗生素的敏感性
Table 1 Sensi tivity of wi ld type strain YBT1463 of Baci llus thuringiensis and its plasmid free mutant strain BMB171 to antibiotics
抗生素
Ant ibiot ics
菌株
St rains
生长情况1)Grow th condit ion
012) 05 10 15 20 25 50 75 100 125 250 500 1000
红霉素 YBT1463 + - - - - - - - - - - - -
E rythromycin BMB171 + - - - - - - - - - - - -利福平 YBT1463 + + + - - - - - - - - - -
Rifam picin BMB171 + + + - - - - - - - - - -四环素 YBT1463 + + + + + + - - - - - - -
T et racycline BMB171 + + + + + + - - - - - - -氯霉素 YBT1463 + + + + - - - - - - - - -
Chloramphen icol BMB171 + + + + - - - - - - - - -卡那霉素 YBT1463 + + + + + + - - - - - - -
Kanamycin BMB171 + + + + + + - - - - - - -链霉素 YBT1463 + + + + + + + + - - - - -
S treptom ycin BMB171 + + + + + + + + - - - - -庆大霉素 YBT1463 + + + - - - - - - - - - -
Gentamycin BMB171 + + + - - - - - - - - - -新霉素 YBT1463 + + + + + + - - - - - - -
Neomycin BMB171 + + + + + + - - - - - - -壮观霉素 YBT1463 + + + + + + + + + + + - -
Spect inomycin BMB171 + + + + + + + + + + + - -氨苄青霉素 YBT1463 + + + + + + + + + + + + +
Ampicillin BMB171 + + + + + + + + + + + + +
1) ! + ∋ : 拮抗 Resistant; ! - ∋ : 敏感 S ensitive. 2)浓度单位 Concent ration unit (g∀mL- 1) .
敏感,且敏感的浓度完全相同. 由此可见, 野生菌株
YBT1463的质粒与该菌株对供试抗生素的敏感性无
关.
333 质粒与宿主菌 C源和 N源利用的关系 野生菌
株YBT1463和无质粒突变株 BMB171对葡萄糖等19种
C源和谷氨酸等12种N源利用的测定结果见表 2.
表 2 苏云金芽孢杆菌野生菌株 YBT1463和无质粒突变株 BMB171对 C、N源的利用
Table 2 Uti lity of 19 carbon sources and 12 nitrogen sources by wildtype strain YBT1463 of and Bacillus thuringiensis its plasmid free mutant strain BMB171
碳源/氮源
Carbon/ Nitrogen sources
YBT1463 BMB171 碳源/氮源
Carbon/ Nitrogen sources
YBT1463 BM B171
葡萄糖 Glucose + 1) + 山梨酸 Sorbic acid - -果糖 Fructose + + 柠檬酸 Cit ric acid + +
蔗糖 Sucrose + + 丁二酸钠 Sodium succinate - -
乳糖 Lactose - - 谷氨酸2) Glutamic acid + +半乳糖 Galactose + + 精氨酸 Arginine + +
棉子糖 Raff inose - - 苯丙氨酸 Phenylalanine + +
阿拉伯糖 Arabinose - - 酪蛋白 Tyrosine + +
海藻糖 T rehalose + + 色氨酸 T ryptophan + +
蜜二糖 Melibiose - - 天门冬氨酸 Aspartic acid + +
L岩藻糖 Lfucose - - 甘氨酸 Glycine + +木糖 Xylose + + 尿素 Urea + +
麦芽糖 Maltose + + 干酪素 Casein + +
淀粉 Starch + + NaNO 3 + +纤维素 Cellulose - - NaNO 2 + +甘露醇 Mannitol - - ( NH4) 2SO 4 + +肌醇 Insitol - -
1) ! + ∋ :可利用 Available; ! - ∋ :不可利用U navailable. 2)以下为氮源物质 The following are nitrogen sources.
8816 期 李 林等:苏云金芽孢杆菌质粒的检测及功能的初步研究
由表 2 可见, YBT1463 与 BMB171 能利用和不
能利用的 C、N 源完全相同, 表明野生菌株 YBT1463
的质粒与该菌株对供试 C、N源的利用能力无关.
4 结 语
作为革兰氏阳性菌, 苏云金芽孢杆菌具有厚而坚
硬的细胞壁,因此质粒制备的技术关键之一就是如何
有效地破壁.通常采用溶菌酶处理来破壁,其酶解温度
在30~ 37 # 之间[ 11, 16] , 这样处理虽然破壁效率较高,
但裂解物也处于各种核酸酶的最适作用范围之内. 迄
今尚未见有在 0 # 进行酶解的报道.研究结果表明,在
0 # 时进行溶菌酶破壁处理可以获得良好的制备效果.
这样一方面可以有效破壁,同时又可以将核酸酶的影
响降至最低限度.另外,本文发现在 0 # 时破壁的酶解
时间不应短于 30m in,合适的溶菌酶浓度为 2mg∀ml- 1
左右.过低的酶浓度将会影响破壁的效果,而溶菌酶浓
度过高则会增加质粒纯化的难度, 并可能影响制备质
粒的质量.
苏云金芽孢杆菌野生菌株大多含有较多的质粒,
这些质粒通常在细胞内是稳定存在的. 研究表明, 该菌
杀虫晶体蛋白的结构基因和调节基因一般仅定位于 1
~ 2个内生质粒上,那么,其它众多的质粒具有什么功
能呢? 这引起了人们较大的研究兴趣.在部分近缘种
如蜡状芽孢杆菌( Baci llus cer eus )中, 已发现某些质粒
(如 pBC16)携带有抗生素抗性基因[ 3] . 另已证实苏云
金芽孢杆菌的某些亚种或菌株对一些抗生素或药物具
抗性, 如库斯塔克亚种部分菌株对吖啶黄素 ( acri
f lavin)、氨苄青霉素、新霉素、壮观霉素和磺胺 ( sul
fanilamide)等抗生素和药物具抗性[ 14] , 但研究发现这
些抗性与该菌内生质粒的存在无关[ 2, 19] , 本文也得到
了类似的结果.
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作者简介 李 林,男, 1965 年生,博士, 副教授,主要从事杀虫
细菌的研究工作,已发表论文 20 余篇. Email: lilin@ mail. hzau.
edu. cn
882 应 用 生 态 学 报 12卷