全 文 ：黑曲霉生产β2葡萄糖苷酶发酵条件的研究 3
李 平 3 3 宛晓春 (安徽农业大学轻工业学院 ,合肥 230036)
陶文沂 丁霄霖 (无锡轻工大学 ,无锡 214036)
【摘要】 经多项式回归分析 ,研究了不同浓度 N 源、C 源、无机盐等对酶产量的影响 ,确定出最佳培养基配方
为 :麸皮 4. 9 % , (NH4) 2 SO4 0. 4 % , KH2 PO4 0. 29 % ,CaCl2 0. 05 % ,MgSO4·7H2O 0. 04 % ,FeSO4·7H2O 5mg·L - 1 ,
ZnCl2 1. 4mg·L - 1 ,0. 2 %油酸钠. 并对培养温度、时间、培养基初始 p H、通气量、接种量、接种方式等培养条件进
行优化 ,使黑曲霉生产β2葡萄糖苷酶的产量由 17U·ml - 1增至 21. 3U·ml - 1 .
关键词 多项式回归 发酵条件 β2葡萄糖苷酶酶活
Fermentation conditions ofβ2glucosidase production from Asp. niger . Li Ping , Wan Xiaochun ( A nhui A gricultural
U niversity , Hef ei 230036) , Tao Wenyi and Ding Xiaolin ( W uxi L ight Indust ry U niversity , W uxi 214036) . 2
Chin. J . A ppl . Ecol . ,1999 ,10 (6) :732～734.
Through multinomial regression , the effects of different concentrations of carbon source , nitrogen source and inorganic
salts onβ2glucosidase production were studied. The optimum components of mediums consisted of bran 4. 9 % ,
(NH4) 2 SO4 0. 4 % , KH2 PO4 0. 29 % , CaCl2 0. 05 % , MgSO4·7H2O 0. 04 % , FeSO4·7H2O 5mg·L - 1 , ZnCl2 1. 4mg
·L - 1 , and sodium oleate 0. 2 %. The fermentation conditions (including temperature , time , p H , aeration , and
inoculation rate and pattern) were also optimized. Under the optimized conditions , the activity of β2glucosidase
produced from Asp. niger was increased from 17U·ml - 1 to 21. 3U·ml - 1 .
Key words Multinomial regression , Fermentation condition ,β2glucosidase activity.
3 国家“八五”科技攻关项目 (85 - 609 - 02 - 03) .
3 3 通讯联系人.
1999 - 02 - 01 收稿 ,1999 - 05 - 25 接受.
1 引 言
β2葡萄糖苷酶作为食品风味酶有广阔的应用前
景[2 ] .供试菌株黑曲霉是对数株出发菌经原生质体技
术[3 ] 、等离子注入技术改良后获得的高产菌 (酶活力
为 17U·ml - 1) . 考虑到发酵条件既关系到菌的生长、
繁殖 ,也影响酶的合成 ,参照有关报道[4 ] ,本文运用单
因子多项式回归分析对供试菌株的培养基组成及培养
条件进行优化 ,使酶活最终达 21. 3U·ml - 1 ,高于目前
国内报道水平.
2 材料与方法
2. 1 菌种
黑曲霉 L23.
2. 2 培养基
斜 面 培 养 基 PDA ; 对 照 发 酵 培 养 基 : 麸 皮 3 % ,
(NH4 ) 2 SO40. 2 % , KH2 PO40. 2 % , CaCl20. 04 % , MgSO4 ·7H2O
0. 04 %.
2. 3 方法
菌株培养及酶活力测定参见文献 [1 ] .
3 结果与讨论
3 . 1 培养基 C 源、N 源、无机盐等的确立及其多项式
回归分析
3 . 1 . 1 C 源 以玉米淀粉、土豆粉、豆渣、米糠、微晶纤
维素、大麦粉等替代对照培养基中的麸皮 ,经发酵产酶
如表 1 所示. 从表 1 可见 ,最优 C 源仍为麸皮 ,这可能
与麸皮的组成成分有关 ,即麸皮中 C 源含量较低
(9. 0 %) ,易利用的糖类含量更低 ,不致产生分解代谢
产物阻遏 ,故麸皮利于该酶的产生. 进一步对麸皮 C
源含量 (0. 5 %～6 %)作多项式回归分析 ,结果见图 1 ,
实验数据经微机处理 ,求出其回归方程为 y = - 6 . 09
x
2 + 59 . 61 x - 32 . 32 , F = 24 . 88 3 > F0. 05 ( 2 , 4 ) =
6 . 94 ,经 F 值比较可知 ,C 源是酶产量高低的显著因
素 ,经计算得 C 源最佳浓度为 4. 9 %.
3 . 1 . 2 N 源 以含 0. 2 % (N H4) 2 SO4 N 源为对照 ,对
各类 N 源及有机氮与无机氮的协同作用研究 (表 2)表
明 , (N H4) 2 SO4 为 N 源效果最佳 ,且添加部分有机氮
并未促进酶的生产. 分析其原因 ,一方面可能是由于微
生物对 N 源的要求不同所致 ,如桔青霉生产 5’2磷酸
二酯酶 ,其生长和产酶都以有机氮效果为好 ;黑曲霉生
产淀粉酶却倾向利用无机氮 ,用硝酸盐可使其产酶率
显著提高 ;还有的菌生长和产酶要求不同者 ,如有机氮
应 用 生 态 学 报 1999 年 12 月 第 10 卷 第 6 期
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Dec. 1999 ,10 (6)∶732～734
表 1 各种碳源对酶活力的影响
Table 1 Effect of carbon source onβ2glucosidase activity
C 源
Carbon source
添加量
Additional
amount
( %)
相对酶活
Relative
enzyme activity
( %)
玉米淀粉 Corn starch 1 77
2 79
3 82
土豆粉 Potato starch 1 71
2 74
3 70
小麦粉 Wheat starch 1 63
2 60
3 57
微晶纤维素 1 73
Microcrystalline cellulose 2 74
3 71
米糠 Rice bran 2 85
3 95
4 92
稻壳 Rice hull 2 87
3 90
4 86
豆渣 Bean dregs 1 79
2 82
3 82
麸皮 Bran (CK) 3 100
图 1 麸皮浓度与酶活力回归分析图
Fig. 1 Regression ofβ2glucosidase activity in different concentration of bran.
Ⅰ.实际酶活 Real enzyme activity , Ⅱ. 预测值 Forecast value. 下同 The
same below.
可促进绿色木霉生长 ,而铵盐或硝酸盐却有利于其纤
维素酶的合成 ;烟曲霉生产β2葡萄糖苷酶时需添加适
量有机氮 ( 0. 05 %的酵母浸膏) 才能维持其高酶活
力[6 ] ;本试验说明供试菌株利用无机氮最利于生长及
产酶. 另一方面可能是由于麸皮含有一定量的有机氮
(蛋白质含量达 16. 4 %) ,可以满足微生物对有机氮的
生长需要 ,以麸皮为 C 源 (3 %) ,添加适量 (N H4) 2 S04
后已产生有机氮与无机氮的协同作用 ,进一步分析
(N H4) 2SO4 使用浓度 (0. 02 %～0. 6 %) 对酶产量的影
响 ,经回归分析 (图 2) 得出其回归方程为 y = -
233 . 47 x 2 + 185 . 39 x + 69 . 84 , F = 14 . 18 3 3 > F0. 05
(2 ,5) = 13 . 27 ,通过 F 值的比较 ,说明 N 源是酶产量
的极显著因素 ,且最佳 N 源浓度为 0. 4 %.
3 . 1 . 3无机盐 对微量元素的考察表明 ,添加Zn2 + 、
表 2 N源对酶活力的影响
Table 2 Effect of nitrogen source onβ2glucosidase activity
N 源
N source
相对酶活
Relative enzyme activity
( %)
0. 2 %(NH4) 2SO4 100
0. 2 %(NH4) 2CO3 93
0. 2 %(NH4) 2C2O4 90
0. 2 %NH4Cl 95
0. 2 %NaNO3 71
0. 2 %KNO3 73
0. 2 %酵母浸膏 Yeast extract 56
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 03 %尿素 Urea 93
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 01 %尿素 Urea 92
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 01 %酵母浸膏 Yeast extract 85
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 15 %酵母浸膏 Yeast extract 82
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 1 %蛋白胨 Peptone 78
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 15 %蛋白胨 Peptone 77
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 1 %豆饼粉 Soybean cake 95
0. 2 %(NH4) 2SO4 + 0. 15 %豆饼粉 Soybean cake 90
图 2 以 (NH4) 2SO4 为 N 源的回归分析图
Fig. 2 Regression of β2glucosidase activity in different concentration of
(NH4) 2SO4.
Fe2 +利于产酶 ,添加 Co2 + 、Mn2 + 对产酶影响不大 ,而
Cu2 + 、Al3 + 、Fe2 + 抑制产酶. 由此而得 ,Zn2 + 、Fe2 + 可能
是供试菌株生产β2葡萄糖苷酶的激活剂 ;也可能是该
酶辅助因子组成部分 ,或是生长必需营养因子 ,对酶活
提高起促进作用 , 可使酶活提高近 6 %.
除微量元素外 ,常量元素 Ca2 + 、Mg2 + 、K2 + 、P 等
对微生物的生长与产酶也有较大影响 , 本文选取
CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2 PO4 3 种物质进行考察 ,用
多项式回归法分析它们对菌株产酶的影响 ,并确定出
它们各自的最佳浓度.
实验结果 (图 3) 表明 , CaCl2 回归方程为 y = -
10021 . 03 x 2 + 1092 x + 75 . 38 , F = 8 . 54 3 > F0. 05 (2 ,5)
= 5 . 79 ;MgSO4·7H2O 回归方程为 y = - 9117 . 06 x 2 +
761 . 53 x + 83 . 07 , F = 11 . 16 3 > F0. 05 ( 2 , 5) = 5 . 79 ;
KH2 PO4 回归方程为 y = - 274 . 48 x 2 + 160 . 53 x +
72 . 36 , F = 11 . 71 3 > F0. 05 (2 , 5) = 5 . 79 . 经 F 值检验
CaCl2、MgSO4·7H2O、KH2 PO4 3 种物质均对产酶有显
著影响 ,为供试菌株生产β2葡萄糖苷酶的必不可少的
营养物质组成成分 ,且各自最佳浓度分别为 : CaCl2 为
0. 05 % ,MgSO4·7H2O 为0. 04 % , KH2 PO4 为0. 29 %.
3376 期 李 平等 :黑曲霉生产β2葡萄糖苷酶发酵条件的研究
图 3 不同 CaCl2 (a) 、MgSO4·7H2O (b) 和 KH2PO4 (c) 浓度的酶活力回
归分析图
Fig. 3 Regression ofβ2glucosidase activity in different concentration of CaCl2
(a) ,MgSO4·7H2O (b) and KH2PO4 (c) .
3 . 1 . 4 产酶促进剂 通过 C 源诱导物及表面活性剂吐
温 40、吐温 80、吐温 100 ,聚乙二醇 ,油酸钠、有机酸等
对酶产量影响考察 ,发现添加各种糖类 C 源均抑制产
酶 ,且添加浓度越大 ,抑制作用越强 ,这说明高浓度的
糖对该酶有阻遏作用 ,可能是高浓度的糖产生分解代
谢物阻遏 ,抑制了该酶的合成. 而添加适量油酸钠和不
饱和脂肪酸对该酶有一定促进作用 ,即添加 0. 2 %的
油酸钠最利于产酶 ,可使酶活提高近 10 % ,原因可能
是适量的油酸钠可促进胞外蛋白质的分泌 ,而其它物
质作用效果不明显或有轻微抑制作用.
3 . 2 培养条件对酶活力的影响
3 . 2 . 1 温度 培养温度不仅影响菌的生长 ,也影响酶
的合成. 经试验验证了 30 ℃条件下菌株酶产量最高.
3 . 2 . 2 初始 p H 培养基的酸碱度对产酶往往有很大
的影响 ,将供试菌株分别接种于初始 p H 为 4. 0、4. 5、
5. 0、5. 5、6. 0、6. 5 的发酵培养基中 ,经 6d 培养测酶活
力 ,发现初始 p H 为 5. 5 时产酶量最高.
3 . 2 . 3 通气量 由于大多数产酶菌是好气菌 ,因此通
气量对提高酶产量往往有直接意义. 经试验得出 140r
·min - 1的摇床转速最利于产酶.
3 . 2 . 4 接种量及接种形式 将供试菌株分别以孢子悬
液 (5 ×107～7 ×107 个·ml - 1) 和培养菌丝方式接种于
发酵培养基中 ,发现酶活差异不大 ,故选取孢子形式接
种.当接种量在 1 %～4 %时 ,酶活随接种量增大呈增
长趋势 ,而当接种量 > 4 %时 ,再增大接种量 ,对酶产量
影响不大.
3 . 2 . 5 验证试验 以回归分析的结果为依据 ,并结合
其它最佳培养条件 ,进行实际验证实验 ,通过 5 组实验
结果的平均值 (表 3) ,求得酶活力单位达 21. 3U ·
ml - 1 ,最高达 25. 7U·ml - 1 ,由此得出该方法用于培养
基优化是有效的.
表 3 5 组验证实验结果
Table 3 Results of f ive group experiment
组号 No.
1 2 3 4 5
酶活 19. 5 20. 8 25. 7 18. 8 21. 6
Enzyme activity (U·ml - 1)
3 . 2 . 6 液态发酵过程 以上述优选培养基为发酵培养
基 ,并采用最佳培养条件 ,经 1～6d 发酵 ,分别测定每
天的发酵培养基 p H、培养基中还原糖含量、菌体生长
情况、产物β2葡萄糖苷酶的酶活力 (图 4) ,从图 4 可
见 ,供试菌株的β2葡萄糖苷酶生物合成的模式为滞后
合成型[5 ] ,故该菌株产酶高峰期为第 6d.
图 4 黑曲霉产β2葡萄糖苷酶的液态发酵过程
Fig. 4 Fermentation process ofβ2glucosidase from Asp. niger.
参考文献
1 李 平等. 1998. 黑曲霉β2葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质. 安
徽农业大学学报 ,25 (3) :304～309.
2 宛晓春等 . 1997.β2葡萄糖苷酶菌种选育. 安徽农业大学学报 , 24
(1) :77～80.
3 宛晓春、李 平. 1998. 无花果曲霉原生质体形成与再生条件的探
讨. 应用生态学报 , 9 (4) :440～442.
4 官家发. 1992. 芽孢杆菌 E2 菌株纤维素酶形成条件的研究. 微生物
学报 ,32 (2) :412～471.
5 郭 勇主编. 1994. 酶工程. 北京 :中国轻工业出版社. 35～50.
6 Michael ,J . R. and Alan , D. E. 1973. Glycoprotein enzyme secreted
by aspergillus fumigatus. J . Biol . Chem . , 248 (18) :6506～6513.
作者简介 李 平 ,女 ,1968 年出生 ,工学硕士 ,讲师 ,主要从事
食品与发酵工程学科方面的研究工作 ,发表论文多篇. E2mail :
zhwzhang @mail. hf . ah. cn
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