全 文 ：细菌卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥菜中的高效表达 3
郝　林 3 3 　(沈阳师范学院生物系 ,沈阳 110034)
John Mundy 　(Copenhagen University ,Φster Farimagsgade 2A ,1353 Copenhagen K , Denmark)
【摘要】　报道了细菌 Xanthobacter autot rophicus 编码卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥菜中的高效表达. 以土壤农
杆菌介导将该基因整合到拟南芥菜基因组中 ,经数代筛选得到了转基因纯合种子 ,Northern 印迹和气相色谱检
测表明 ,转基因的表达程度很高 ,酶量占细胞总可溶性蛋白的 8 % ,酶活力达 7. 8mU·ml - 1提取物. 转基因植株
在含二氯乙烷的培养基上不能生长.
关键词 　卤代烷烃脱卤酶基因 　拟南芥菜 　基因表达 　土壤农杆菌
Eff icient expression of bacterial haloalkane dehalogenase gene in Arabidopsis thaliana . Hao Lin ( Biological Depart2
ment , S henyang Norm al College , S henyang 110034) and John Mundy ( Institute of Molecular Biology , Copenhagen
U niversity , Φster Farim agsgade 2A , 1353 Copenhagen K , Denmark) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . , 1999 , 10 (1) :83～
85.
This paper dealt with efficient expression of haloalkane dehalogenase gene ( dhlA ) from Xanthobacter autot rophicus in
A rabidopsis thaliana. The dhlA was transferred and integrated into genomes of A . thaliana mediated by A grobac2
terium tumef aciens , and homozygous dhlA seeds were obtained after several generations selection on a special medi2
um. Northern blotting and gas chromatography ( GC) assay shows that the dhlA was expressed efficiently , the amount
of the enzyme accounted for 8 % of total cellular soluble protein , and the enzyme activity reached 7. 8 mU·ml - 1 cellu2
lar extract . The transgenic plants could not grow on the medium with 1 ,22dichloroethane.
Key words 　Haloalkane dehalogenase gene ( dhlA ) , A rabidopsis thaliana , Gene expression , A grobacterium tumef a2
ciens .
　　3 丹麦国家自然科学基金资助项目.
　　3 3 通讯联系人.
　　1998 - 05 - 26 收稿 ,1998 - 09 - 10 接受.
1 　引 　　言
　　由具毒废物排放所引起的环境污染已成为全球关
注的热点问题 ,然而对污染物处理的有效方法不多. 因
此 ,研究和发展对废物处理的新方法十分迫切. 近年利
用基因工程改良的生物有机体对污染环境进行生物修
复 (Bioremediation)就是一种前景十分看好的方法. 如
耐受重金属污染的基因工程植株可在体内大量积累重
金属离子 ,因此可被用来除去污染土壤中的重金属. 我
国在这方面的应用也取得了一定进展[2 ] . 卤代烷烃是
一类人工合成的化合物 ,由于偶然的渗漏溢出或作为
工业合成原料 ,在使用过程中会随废水和废气而扩散 ,
导致严重的环境污染. 尽管这是一类非生物物质 ,但某
些细菌培养物能以卤代烷烃作为其生长的唯一碳源.
如细菌 Xanthobacter autot rophicus 可将二氯乙烷 (或
二溴乙烷)分解成烃基乙酸 ,并进入生物体中心代谢循
环[3 ] . 我们将卤代烷烃脱卤酶基因 ( dhlA ) 转入拟南芥
菜中 ,目的是发展一种对卤代烷烃类污染的土壤进行
生物修复的工程植株系统 ,利用植物根系发达 ,穿透能
力强等特点 ,除去土壤和地下水中的污染物. 现将研究
结果报道如下.
2 　材料与方法
2. 1 　植物材料
　　选取饱满的拟南芥菜生态型 ( W assilewskija) (简称 WS) 种
子 ,种在花盆中 ,置于短日照 (10h 以下) 温室中培养 3 周 ,以获
得强壮的植株 ,然后置于长日照条件下 (光照 12h 以上) 诱导抽
苔开花. 用剪刀在莲座叶以上切去主花轴 (此时植株高约
10cm) ,以促进次生花轴的抽苔. 剪切后 7～9 天即可用于转化
实验 ,此时植株高约 10～15cm ,最大花序已产生了第一个角
果. 在转化实验的前一天停止浇水.
2. 2 　表达载体的构建
　　细菌 Xanthobacter autot rophicus GJ10 中的 dhlA 基因 (由
D. B. Janssen 赠送)的编码区域经 PCR 扩增后顺向克隆到植物
表达型载体 p KYL X71235S2 的 Xho I 和 XbaI 位点内. 这种双元
载体含有 CaMV35s 双启动子 ,即 35S 启动子部分序列是重复
的 ,它可提高表达活性 ,含有植物能识别的终止子 ,以及转座子
Tn10 的卡那霉素抗性基因 ,供做植物转化的选择标记. 将这些
构建好的载体用电穿孔法转入到土壤农杆菌 C58 菌株内 ,用抽
真空法转化拟南芥菜 WS型植株.
应 用 生 态 学 报 　1999 年 2 月 　第 10 卷 　第 1 期 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb. 1999 ,10 (1)∶83～85
2. 3 　土壤农杆菌介导的转化
　　用抽真空法[1 ]将含有目的基因和选择标记基因的载体转
入拟南芥菜的花序中. 将含有载体的土壤农杆菌在含有卡那霉
素的培养基中培养至 O. D600为 1. 2～1. 8 ;分装至 400ml 的烧杯
中 ,置于真空罐中 ,抽真空至培养液冒泡 ;将准备好的拟南芥菜
植株倒过来插入培养液中 ,确保所有的花都浸入农杆菌培养液
中 ,以莲座叶与培养液之间留有 2cm 的距离为好 ,抽真空
30min 即可 ,用一塑料袋将植物 (连同花盆) 套住 ,并封口 ,然后
侧面平放于培养室中 ,两天后将花盆直立 ,并去掉塑料袋 ,生长
约 4 周 ,此时角果变黄 ,用纸袋将植株套住 ,侧放 ,1 周后将植株
剪下 ,收种子 ,干燥 1 周后放到 4 ℃的冷室中 ,1 周后用于转化
体的筛选.
2. 4 　Northern 印迹
　　选择了 7 个独立转化的 dhlA 纯合植株 ,分别编号为 1 ,2 ,
⋯7. 总 RNA 的提取、转移及与探针杂交采用常规方法 [6 ] ,稍加
改动. 杂交探针的制备是以 dhlA 基因的 PCR 产物为模板 ,采
用缺口平移法合成 , 操作方法见所用试剂盒 (Boehringer
mannheim)中的产品使用说明书.
2. 5 　dhlA 酶活性的气相色谱检测
　　用待测转基因植株的细胞提取物作为酶供体 ,以二溴乙烷
为反应底物 ,按有关方法测定提取物中的酶活力 [7 ] . 在制备无
细胞提取物时 ,为了稳定酶活力 ,在提取缓冲液中加入 25mmol
·L - 1 HEPES ,p H8. 0 ,1mmol·L - 1 EDTA ,5mmol·L - 1DTT ,20 %
甘油 ,1 %Triton X2100 , 5μg·ml - 1 leupeptin , 5μg·L - 1 antipain.
实验中所用的试剂购自于 Sigma ,Amersham Corp. 和 Pharmacia
Biotech. Inc. .
3 　结果与讨论
3 . 1 　dhlA 基因纯合体的筛选
　　将转化后所得到的种子经常规方法消毒后接种于
MS + 50mg·L - 1卡那霉素培养基上 ,先置于 4 ℃冷室
中 2 天 ,然后转到培养室中 (21 ℃,连续光照) ,约 1 周
后就可将转化植株与未转化植株分开. 将叶片为深绿
色并具有强壮根系的小苗移入土壤中 ,供收获种子. 由
于拟南芥菜为自花受粉 ,所以产生的种子为自交一代 ,
将种子接种于选择培养基上 ,后代植株产生了分离 ,选
择 3 ¬1 分离群体中的抗性植株做进一步的筛选 ,在这
些抗性植株中 , T2DNA 的拷贝数只有一份 ( Southern
印迹图略) . 选择至自交第四代 ,每一个独立的转化体
都得到了 dhlA 基因纯合的植株 ,由此收获的种子做
为转基因纯合体供基因表达的测试材料.
3 . 2 　dhlA 基因的转录
　　Northern 杂交结果如图 1 ,与正对照 (a) 相比较 ,
可看出 dhlA 的转录活性很高 ,但不同的转化体之间
表现出了不同的强度 ,如 4 号转化体中的 dhlA mR2
NA 积累的量很低 ,只有在 X 感光片曝光 24h 后才能
清晰地看到 ,而此时其它样品的曝光量已显过足. 由于
不同转化体之间的载体结构是一样的 ,它们也都是以
单拷贝插入到受体细胞的染色体上 ,启动子又都是组
成型的 ,那么这种表达活性上的明显差异主要是由于
T2DNA 在染色体上的插入位点不同所引起的 ,即位置
效应 ( Position effect) ,它在转基因的表达调控方面具
有广泛的普遍性. 当然 ,不同植株的生理差异也会或多
或少影响转基因的表达. 这种 T2DNA 插入的位置效
应可用近年来发现的基因共抑制 ( Cosupression) 或转
基因的沉默 ( Gene silencing) [4 ]来解释. 这些现象发生
的原因之一就是转基因在染色体上的插入位点不同 ,
从而使基因的甲基化程度有差异 ,甲基化程度越高 ,基
因的表达就越受到抑制[5 ] .
图 1 　dhlA 基因在拟南芥菜中转录的 Northern blot 分析
Fig. 1 Northern blot analysis of dhlA mRNA level in A rabidopsis
thaliana.
a)正对照 ,样品为 1ng dhlA PCR 产物 Positive control ,1ng PCR product
of dhlA ;b)负对照 ,样品为 10μg 野生型 WS 的总 RNA Negative control ,
10μg total RNA of wild - type WS ;1～7) 分别为独立的转化体 ,样品分
别为 10μg 总 RNA. 曝光时间为 6h. 杂交探针为缺口平移法制备的α-
P32标记的寡聚 DNA 片段 Different transformants ,10μg of total RNA/
lane. The autoradiograph is exposed for 6h. Theα- P32 labelled probe is
made by nick translation.
3 . 3 　dhlA 的酶活性
　　以转基因植株 2、4、6 号及野生型 WS 的无细胞提
取物作为酶供试液 ,以 1 ,22二溴乙烷为底物进行酶活
力测定. 先将底物加到 50mmol·L - 1 Tris. SO4 缓冲液
(p H8. 2)中 [7 ] ,使其终浓度为 5mmol·L - 1 . 测试开始时
取 100μl 酶提取液 (可溶性蛋白 0. 5mg·ml - 1) 倒 3ml
底物溶液中 ,分别在 0 ,1 和 2h 取 0. 5ml 反应混合液 ,
用气相色谱测定反应产物 22溴乙醇的生成量 (图 2) .
酶活性最高为 6 号转基因植株 ,2h 后 22溴乙醇的生成
图 2 　dhlA 酶活力的气相色谱测定
Fig. 2 dhlA enzyme activities assaied by gas chromatography( GC) .
a ,b ,c ,d 分别代表野生型 WS 和转基因植株 4 ,2 及 6 号的酶活力. a ,b ,c
and d represent wild - type WS ,transgenic plants 4 ,2 and 6 ,respectively.
48 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　10 卷
量达 300μmol·L - 1 ,酶活力达 7. 8mU·ml - 1提取物. 根
据提取物的 SDS - PA GE ,估计酶蛋白量可达细胞总
可溶性蛋白的 8 %. 从图 1 与图 2 比较来看 ,结果完全
一致 ,即 mRNA 积累量高 ,酶的活力也高.
3 . 4 　转基因植株生长状况
　　dhlA 酶的作用底物较广 ,如二氯乙烷、二溴乙烷、
二溴丙烷、二溴甲烷等. 将 dhlA 表达活性和酶活力均
为最高的转基因植株 6 的种子接种到含不同浓度二氯
乙烷的 MS 培养基中培养 ,当培养基中的二氯乙烷达
到 50mmol·L - 1时 ,转基因种子不能萌发 ,而作为对照
的野生型 WS 种子在 250mmol·L - 1的二氯乙烷培养
基上仍能正常生长. 这一结果从活体植株水平上进一
步证明了 dhlA 基因具有高水平的表达. 经过对二氯
乙烷在细菌 Xanthobacter autot rophicus 中代谢过程中
间物的比较 ,结果发现二氯乙烷被分解后的代谢中间
产物要比它本身对植物体的毒害更大. 这些中间产物
有氯乙醇、氯乙醛和氯乙酸 ,尤其是氯乙酸的毒害最
大. 在 Xanthobacter autot rophicus 中 ,氯乙酸在卤代乙
酸脱卤酶的催化下转变为羟基乙酸进入生物体中心代
谢循环. 经试验 ,植物体内不含有这种酶 (未附测定结
果) ,因此 ,要得到能完全代谢卤代烷烃的工程植株至
少还需将这种脱卤酶基因一同转入目标植物中. 将一
个以上的目的基因转入同一植株并不困难 ,问题是几
个转基因能否在一个植株中协同表达 ,完成一个代谢
过程 ,有待进一步研究.
致谢 　本文完成于哥本哈根大学分子生物学实验室. 中国科学
院沈阳应用生态研究所张成刚研究员对本文提出宝贵的修改
意见 ,特此感谢.
参考文献
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作者简介 　郝 　林 ,男 ,36 岁 ,副教授 ,在读博士生 ,学科方向为
分子生物学与生物工程 ,在国内外学术刊物上发表论文 30 余
篇.
581 期 　　　　　　　　　　　　郝 　林等 :细菌卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥菜中的高效表达