全 文 ：铝毒胁迫诱导菜豆柠檬酸的分泌与累积*
沈 宏* * 严小龙 郑少玲 王秀荣
(华南农业大学植物营养遗传实验室和根系生物学研究中心,广州 510642)
摘要 水培试验结果表明, 铝毒诱导菜豆柠檬酸的分泌与累积存在着显著的基因型差异. Al3+ 浓度<
50mol!L- 1时,柠檬酸分泌量随 Al3+ 浓度的增大而增加; Al3+ 浓度在 50~ 80mol!L- 1时, 柠檬酸分泌量
随 Al3 + 浓度的增大而减小. 不同菜豆基因型以 G19842 的柠檬酸分泌量最大, 单位干重 Al吸收量最小 .铝
毒胁迫时,不同菜豆基因型叶片柠檬酸累积量无明显差异, 根系柠檬酸累积量为 G19842> AFR> ZPV>
G5273. 菜豆柠檬酸分泌量缺 P处理< 铝毒胁迫, 50mol!L- 1 LaCl3不能诱导菜豆分泌柠檬酸,表明柠檬酸
的分泌与累积是菜豆抗铝毒胁迫的重要生理反应.
关键词 铝毒胁迫 柠檬酸 分泌与累积
文章编号 1001- 9332( 2002) 03- 0307- 04 中图分类号 Q945 文献标识码 A
Exudation and accumulation of citric acid in common bean in response to Al toxicity stress. SHEN Hong , YAN
Xiaolong, ZH ENG Shaoling and WANG Xiurong ( South China Agr icultural Univer sity , Guangz hou
510642) . Chin . J . A pp l . Ecol . , 2002, 13( 3) : 307~ 310.
Significant differences in the exudation and accumulation of citric acid in common bean genotypes were observed
in response to Al tox icity stress by hydroponic cultur al exper iments. Secreted citric acid increased wit h increasing
external concentrations of Al3+ which ranged from 0 to 50 mol!L- 1 , w hile ranged from 50 to 80mo l!L - 1, se
creted citric acid decreased with incr easing ex ternal concentrations of Al3+ . Among different genotypic common
beans, citric acid secreted in G19842 w as the larg est, while A l uptake per unit dry weight in G19842 was the
least. No difference in the accumulation of citr ic acid in leaves was found among different g enotypic common
beans, while the size of the content of citr ic acid in roots was G19842> AFR> ZPV> G5273. The amount of
citric acid exuded w as smaller induced by phosphorus deficiency than that induced by Al tox icity stress. Exposure
to 50 mol!L - 1 LaCl3 could not induce the exudation of citric acid, and it implied that the exudation and accu
mulation of citric acid in common bean was an impo rtant physiological r esponse of resistance to A l toxicity str ess.
Key words Al toxicit y stress, Citr ic acid, Exudation and accumulation.
* 国家自然科学基金 ( 39970431、39925025)、广东省自然科学基金
( 000642)和国际基金( C/ 30421)资助项目.
* * 通讯联系人.
2000- 06- 12收稿, 2001- 09- 18接受.
1 引 言
酸性红壤中,土壤 Al3+ 活性高一直是限制作物
生长的重要因素[ 5] . 传统上, 人们常通过施石灰或
肥料来改良土壤的铝毒问题, 然而施石灰和肥料对
于心土层土壤的改良既不经济, 也有困难[ 6, 9, 17] . 菜
豆( Phaseolus vulgaris L. )是一种经济价值较高的
豆科作物,因其生物固氮、耐瘠能力强而被选为瘦瘠
土壤上的∀先锋#作物[ 22] . 但在酸性红壤上种植菜豆
也存在着土壤铝毒害的问题. 在改土施肥的同时, 很
多学者把注意力转移到充分利用植物自身潜力
上[ 2, 4, 7, 11] . 荞麦在铝毒胁迫时, 根系大量分泌草酸.
草酸与 Al3+ 络合形成草酸铝化合物, 有效减轻了
Al3+ 对根系的毒害作用,同时, 荞麦体内积累大量的
草酸缓解了铝毒害[ 12, 24] . 山芋能专性分泌柠檬酸缓
解铝毒作用[ 13] . 铝毒能诱导小麦根尖分泌苹果
酸[ 3, 19, 20] .这些研究表明, 草酸、柠檬酸、苹果酸等
有机酸在降解土壤铝毒方面具有重要作用[ 14, 16, 18] .
目前,有关铝毒诱导菜豆根系分泌柠檬酸的研究尚
未见系统报道.本试验探讨了铝毒胁迫诱导菜豆柠
檬酸的分泌与累积, 为直接引用耐铝毒的菜豆品种
以及遗传改良菜豆耐铝毒特性提供理论依据.
2 材料与方法
2 1 供试材料
菜豆种子由哥伦比亚国际亚热带农业中心 ( CIAT ) 提
供, 选用 G19842、AFR、ZPV 及 G5273 四种基因型. 每个处理
用一种菜豆基因型, 所需种子数为 6 粒. 具体方法是将种子
大小一致的菜豆种子置于培养皿中, 先用饱和 CaCl2 溶液消
毒 10min,然后用 0 5mmol!L- 1 CaSO4 溶液浸泡20min, 用蒸
馏水饱和的滤纸盖上, 以确保一定的空气湿度. 待种子萌发
应 用 生 态 学 报 2002 年 3 月 第 13 卷 第 3 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Mar. 2002, 13( 3)∃307~ 310
后,取整齐度一致的幼苗放置在 1/ 2 浓度的营养液中生长
2d, 然后换至正常营养液中生长,电动泵通气,营养液 pH 调
至 6 0, 每 3 天换一次营养液, 光照/黑暗时间分别为 14/
10h.整个试验在华南农业大学根系生物学研究中心温室进
行.营养液组成成分别为: KNO3 4 5mmol! L - 1, NH4NO 3
12mmol! L- 1 , Ca( NO3 ) 2 3 6mmol!L - 1, MgSO4 30mmol!
L
- 1
, K2SO 4 1 2mmol ! L - 1, ( NH4 ) 2SO4 1 2mmol ! L- 1 ,
KH2PO4 1 0mmol!L- 1 , F eEDTA 6 % 10- 3mmol!L- 1 , H3BO 3
15 % 10- 3mmol!L- 1 , MnSO 4 45 % 10- 3mmol!L - 1, CuSO 4
15 % 10- 3mmol!L- 1 , ZnSO4!5H2O 45 % 10- 3mmol! L- 1 ,
( NH4 ) 6Mo7O24!4H2O 4 % 10- 4mmol!L- 1 .
22 研究方法
221 试验处理与收集根分泌物 菜豆幼苗正常生长两周
后,进行铝毒、缺 P 和 LaCl3 胁迫处理 (因 Al3+ 、La3+ 电荷数
相同, 水化离子半径不同, 与根系细胞膜相互作用机理不
同[ 10] ; 高浓度时,这两种离子均植物根系有毒害作用, 这里
主要用于比较两种离子对柠檬酸分泌的影响) .铝毒胁迫为:
将菜豆幼苗放入体积为 3L 的铝毒营养液中, 铝毒处理浓度
分别为 20、40、50、60 和 80mol! L - 1, pH 45, 除营养液
KH2PO4 的浓度为 05mol!L - 1外,其它成分与完全营养液
均相同. 缺 P 胁迫为营养液中不加 1 0mmol! L- 1 KH2PO 4
外,其它成分与完全营养液均相同. LaCl3 胁迫是在低 P
( 0 5mol!L - 1 KH2PO 4)营养液中加入 50mol!L- 1LaCl3, 其
它成分与完全营养液相同.每种处理胁迫时间均为 3d, 但植
株干重和 Al吸收量实验胁迫处理时间为 6d. 收集根分泌物
的具体方法是在每天 8∃30, 将处理好的菜豆根系静置在自
来水中 0 5h,然后用自来水轻轻清洗 5~ 10 次, 蒸馏水清洗
3~ 5 次, 去离子水清洗 2~ 3 次,最后将处理好的菜豆根系
放置在盛有百里酚的 0 5mmol!L- 1 CaSO4 的去离子水溶液
中生长 4h, 收集根分泌物. 在旋转蒸发器上浓缩至一定倍
数,过滤冰箱保存( - 20 & )备用.
222 制备根系和叶片提取物 将铝毒处理 ( 50mol!L - 1
AlCl3) 3d的菜豆幼苗用自来水清洗 10 次, 再用蒸馏水和去
离子水分别清洗 5 次和 3 次, 用滤纸将植株表面的水珠吸
干,用剪刀将菜豆植株第三片和第四片剪下, 充分剪碎, 称取
植株鲜样 1g ,放入研磨中, 先加入 2ml去离子水, 用力将样
品充分磨碎,再加入 3ml去离子水一并装入离心管中, 在转
速为 2000g、温度为 5& 时离心 10min; 然后将上清液过阴离
子交换柱 ( 15mm % 25cm, Amberlite IR120B 树脂为 8g)、阳
离子交换柱( 15mm % 25cm, AG 树脂为 4g, 200 目) , 阳离子
交换柱用 5mmol! L- 1 NH4OH 溶液洗脱, 阴离子交换柱用
2mmol!L- 1甲酸溶液洗脱, 部分收集器分管收集, 旋转蒸发
器浓缩后,用微孔滤膜过滤立即分析或放入冰箱( 4& )备用.
223 柠檬酸测定 用离子色谱仪测定柠檬酸. 测试条件
为:Dionex120 离子色谱仪, IonpacAS11HC 分离柱和 Ion
pacAS11HC 保护柱, ASRS∋阴离子微膜抑制器, 电导检测
器, CQ250 型脱气装置. 标准物质均为分析纯试剂. M illipore
去离子纯水器.色谱柱温 25& , 淋洗液为 30mmol!L - 1 NaOH
溶液, 淋洗液流速 1 34ml!min- 1 , 进样量 25l, 电导检测灵
敏度为 1S.
2 2 4 植株Al测定 Al吸收采用铬天青 S溴化十六烷基三
甲铵乙醇分光光度法[ 8] .
3 结果与分析
31 植株生物量与单位干重Al吸收量的比较
植株生物量(以干重表示)是比较植株生长状况
好坏的重要指标. 逆境胁迫条件下,植株生物量是植
物抗逆性的一个重要参数. 50mol!L - 1 AlCl3 胁迫
处理 6d,几种菜豆基因型生物量均有不同程度的下
降(图 1a) .其中 G19842、AFR、ZPV 和 G5273分别
下降了 291、437、461和 347% .可见,铝毒胁迫
诱导菜豆 G19842 生物量下降速率小于 AFR、ZPV
和 G5273 基因型. 正常生长或铝毒胁迫处理时, 几
种菜豆基因型生物量均是 G19842 最大. 铝毒胁迫
诱导菜豆 Al 含量表现出明显的基因型差异. 从图
1b可以看出, 对照和铝毒胁迫处理, 不同菜豆基因
型单位干重Al吸收量以 G19842 为最小, G5273最
大,AFR和 ZPV 基因型之间没有明显差异.
图 1 铝毒胁迫下不同菜豆品种的干重( a)和单位干重Al吸收量( b)
Fig. 1 Dry w eight ( a) andAl uptake per unit dry w eight ( b) in genotpic
common beans in response to Al toxicity.
Seedlings w ere exposed to nutrient solut ion containing 50 mol! L- 1
Al3+ for 6 days. Dry w eight and Al uptake per un it dry w eight w ere de
termined. Vert ical bars represent ( SE ( n= 3) .
32 铝毒诱导柠檬酸的分泌
从图 2 可知, Al3+ 浓度为 0~ 50mol!L - 1时, 4
种菜豆基因型分泌的柠檬酸随 Al3+ 浓度的增大而
增加,在 50mol!L - 1时, 菜豆基因型柠檬酸分泌量
达到最大值.当 Al3+ 浓度超过 50mol!L- 1时,柠檬
酸分泌量减少. 不同菜豆基因型柠檬酸分泌量以
G19842> AFR> ZPV> G5273.
308 应 用 生 态 学 报 13卷
图 2 外部 Al浓度对柠檬酸分泌的影响
Fig. 2 Ef fect of external Al concent rat ion on secret ion of cit ric acid.
S eedlings w ere exposed to nut rient solution containing 20, 40, 50, 60 or
80 mmol!L- 1 Al3+ for 3 days. Cit ric acid in root exudates was deter
mined w ith ion chromatography.
33 La3+ 、Al3+ 及缺 P 胁迫对柠檬酸分泌影响
图3表明, 50mol!L - 1 La3+ 处理在柠檬酸分泌
量上, 与对照没有差异; 缺P胁迫诱导柠檬酸分泌
图 3 La3+ 、Al3+及缺 P 对柠檬酸分泌的影响
Fig. 3 Ef fect of La3+ , Al3+ and phosphorus def iciency on secret ion of ci
t ric acid.
S eedlings w ere exposed to nut rient solution containing 50 mol! L- 1
La3+ , 50 mol! L- 1 Al3+ or phosphorus def iciency respect ively for 3
days. Citric acid in root exudates was determined w ith ion chromato
graphy. Vert ical bars repres ent( SE ( n= 3) .
图 4 铝毒胁迫条件下不同菜豆品种叶片( a)和根系( b)柠檬酸含量
Fig. 4 Cit ric acid concentrat ion in leaves ( a) and roots ( b) of genotypic
common beans in response to Al toxicity.
S eedlings w ere exposed to nut rient solution containing 50 mol! L- 1
Al3+ f or 3 days. Cit ric acid in root an d leave extracts w as determined.
Vert ical bars represent ( SE ( n= 3) .
量大约是对照的二倍,但缺 P 胁迫诱导柠檬酸分泌
量明显小于铝毒胁迫处理. La3+ + Al3+ 处理与 Al3+
处理在柠檬酸分泌量上没有明显差异, 表明 La3+ 胁
迫处理不能诱导柠檬酸的分泌.
34 菜豆根系和叶片中柠檬酸含量
由图 4可见,铝毒胁迫明显诱导柠檬酸在根系
和叶片中累积,铝毒胁迫诱导菜豆柠檬酸累积是对
照的 2~ 3倍. 在对照或铝毒胁迫条件下, 菜豆叶片
柠檬酸含量明显高于根系. 铝毒胁迫条件下,不同菜
豆基因型根系柠檬酸含量为 G19842> AFR> ZPV
> G5273;不同菜豆基因型间的叶片柠檬酸含量没
有明显差异.
4 讨 论
41 柠檬酸与Al相互作用
在长期的进化过程中, 不同植物种类、甚至同一
植物的不同品种在铝毒胁迫条件下, 诱导产生特定
的生理生化反应, 形成了不同的耐铝毒胁迫机
制[ 3, 4, 11] . M a等[ 14]发现, Al3+ 与柠檬酸以 1∃1比例
结合形成螯合物对植物根系无毒害作用, Al柠檬酸
的稳定常数为 1072, 表明螯合剂的浓度和稳定常
数在降解铝毒方面具有重要作用.螯合剂浓度越大,
对 Al3+ 的螯合能力越强, 降解铝毒作用越明显. 铝
毒胁迫时,不同菜豆基因型中, G19842的柠檬酸分
泌量最大,单位干重 Al吸收量最小.这可能是柠檬
酸的大量分泌, 直接与介质中活性 Al 发生络合反
应,降低了 Al的毒性; 同时, 减少了 Al3+ 与磷酸根
等养分元素结合, 增加 Ca、Mg 等元素的植物有效
性,植株生长速率相对变快,生物量累积高于其它基
因型,故单位干重 Al吸收量明显小于其它菜豆基因
型.
42 铝毒诱导有机酸分泌
由于柠檬酸分泌受铝毒胁迫诱导, 因此介质中
活性 Al3+ 浓度对柠檬酸的分泌具有重要影
响[ 13, 19] . Pellet等[ 19]发现, 20mol!L- 1 Al3+ 诱导小
麦分泌苹果酸达到最大值. 在我们的试验中发现,
50mol!L- 1 Al3+ 诱导菜豆分泌柠檬酸达到最大值.
当溶液 Al3+ 浓度< 50mol!L - 1时, 铝毒胁迫诱导菜
豆柠檬酸的分泌量随溶液中 Al3+ 浓度的增大而增
大;当介质Al3+ 浓度> 50mol!L- 1时,菜豆柠檬酸
分泌量逐渐下降. Delhaize和 Pellet等[ 3, 18]运用分根
培养技术研究铝毒诱导有机酸分泌发现, 铝毒诱导
有机酸分泌的主要位点在距根尖的0~ 10mm处.低
浓度的 Al3+ 能激活调控阴离子通道的活性位点,有
3093 期 沈 宏等:铝毒胁迫诱导菜豆柠檬酸的分泌与累积
利于低分子量有机酸的分泌;当 Al3+ 浓度高于一定
值时, Al3+ 对根尖活性位点的激活作用变成了毒害
作用,阴离子通道开通受到抑制或损伤,有机酸分泌
量下降[ 1, 10, 21] .
Bennet 和 Breen[ 1]发现, La3+ 、Yb3+ 与 Al3+ 电
荷数相同,对水稻和茶树根系生长的影响却不相同;
La
3+ 、Yb3+ 比 Al3+ 对根系生长的抑制作用更强烈.
从图 3可以看出, La3+ 不能诱导菜豆分泌柠檬酸,
也不能诱导小麦分泌苹果酸. 这很可能是 La3+ 不能
开启位于植株根尖膜上的阴离子通道[ 20, 24] .
Ishikawa 等人[ 10] 认为, Al3+ 毒害不同于 La3+ 和
Yb3+ 的毒害作用. 主要是它们的离子势不同, 因而
在根尖的结合位点也不同.缺 P 能诱导菜豆分泌柠
檬酸(图 3) . 这与严小龙等[ 22]的报告相一致. 但柠
檬酸的分泌量明显低于铝毒胁迫处理,与缺 P、铝毒
胁迫分别诱导柠檬酸分泌的机理不同有关. 铝毒作
用于根尖,通过一系列生理生化反应,调控细胞膜上
阴离子通道的开闭, 诱导柠檬酸的分泌; 而缺 P 胁
迫主要通过信号传递, 使植物体内代谢途径发生改
变,诱导柠檬酸的分泌[ 13, 15, 20] .
总之,铝毒诱导柠檬酸在菜豆根系和根分泌物
中含量的差异, 体现了不同菜豆基因型对铝毒胁迫
的抗性差异.这是不同菜豆基因型适应铝毒胁迫差
异的实质[ 23, 24] .
参考文献
1 Bennet RJ, Breen CM. 1992. The use of lanthanum to delineate the
alum inum signalling mechanisms funct ioning in the root s of Zea
mays L. Env i ron Exp Bot ,32: 365~ 376
2 Delhaize E, Ryan PR. 1995. Aluminum toxicity an d tolerance in
plants. Plant Physiol , 107: 315~ 321
3 Delhaize E, Ryan PR, Randall PJ. 1993. Aluminum tolerance in
w heat ( T rit icum aesti v um L. ) ∋ . A luminumst imulated ex cre
t ion of malic acid from root apices. P lant Physiol , 103: 695~ 702
4 De la Fuente JM , RamirezRodriguez V, CabreraPonce JL, e t al .
1997. Aluminum tolerance in t ransgenic plants by alterat ion of ci
t rate synthesis. Science , 276: 1566~ 1568
5 Foy CD. 1984. Physiological effect s of hydrogen, aluminum and
manganese toxicit ies in acid soils. In: Adams F ed. S oil Acidity and
Liming. 2nd. S oc Soi l Sci Ag ron , 12: 57~ 97
6 Foy CD,Duke JA, Devine TE. 1992. Tolerance of soybean germplasm to
an acid tatum subsoil. J Plant Nutr , 15: 527~ 547
7 Foy CD, Carter TE, Duke JA, et al . 1993. Correlat ion on shoot and
root grow th and its role in select ing for aluminum tolerance in soy
bean. J Plant Nu tr , 16: 305~ 325
8 He B( 何 斌 ) , L iang J (梁 机 ) . 1996. Highly sensit ive spec
trophotomet ric determinat ion of aluminum in plant an d soil water
w ith chrom azurol S, cetyltrimethylammonium bromide an d alcohol.
J G uangxi Agri c Univ (广西农业大学学报) , 15 ( 2) : 151~ 155
( in Chinese)
9 HuHQ (胡红青) , Huang QY(黄巧云) , Li XY(李学垣) , et al .
1995. The diminishing ef fect of phosphate rock application on alu
minum toxicity in acid soil . S ci Agr ic S in (中国农业科学) , 28( 2) :
51~ 57( in Chinese)
10 Ishikaw a S , Wagatsuma T , Ikarashi T. 1996. Comparat ive toxicity
of Al3+ , Yb3+ , and La3+ t o roott ip cells dif fering in tolerance to
high Al3+ in terms of ionic potent ials of dehydrated t rivalent
cat ions. Soil S ci Plant Nut r , 42: 613~ 625
11 Larsen PB, Degenhardt J, T ai CY, et al . 1998. Aluminumresistant
arabidopsis mutants that exh ibit altered pat terns of aluminum accu
mulation and organic acid release f rom roots. Plant Physiol , 117: 9
~ 18
12 Ma JF, Zheng S J, Matsumoto H . 1997. Detoxif ing aluminium w ith
buckw heat . Nature , 390( 11) : 569~ 570
13 Ma JF, Zh eng SJ, Matsumoto H . 1997. Specif ic secret ion of cit ric
acid induced by Al st ress in Cassia tora L. Plan t Cell Physiol , 38
( 9) : 1019~ 1025
14 Ma JF, Zheng SJ, H iradate S , et al . 1997. Internal detox if icat ion
mechanism of Al in hydrangea. Identif icat ion of Al form in the
leaves. Plant Physiol , 113: 1033~ 1039
15 Marschner H. 1995. M ineral Nut rition of Higher Plants. London:
Academic Press Limited. 121~ 254
16 Miyasaka SC, Buta JG, How ell RK, e t al . 1991. Mechanism of alu
minum tolerance in snapbeans. Root exudat ion of cit ric acid. Plant
Physiol , 96: 737~ 743
17 Paul FB. 1996. Predict ing liming n eeds of soybean using soil pH, a
lum inum, and manganese soil test s. Comm un Soi l Sci Plant A nal ,
27( 13) : 2749~ 2764
18 Pellet DM, Papernik LA, Kochian L V. 1995. Organic acid exuda
tion as an aluminum tolerance m echanism in maize ( Zea mays L. )
Planta , 196: 788~ 795
19 Pellet DM, Papernik LA, Kochian LV. 1996. Multiple aluminum
resistance mechanisms in w heat , roles of root apical phosphate and
malate exudat ion. Plant Physiol , 112: 591~ 597
20 Ryan PR, Delhaize E, Randall PJ. 1995. Characterization of Alstimula
ted ef flux of malate efflux f rom root apices of Alt olerant wheat roots.
Planta, 196: 103~ 110
21 Ryan PR, Skerret t M , Findlay GP, et al . 1997. Aluminum act ivates
an anion channel in the apical cells of wheat root s. Proc Natl A cad
Sci USA , 94: 6547~ 6552
22 Yan XL (严小龙) . 1995. Evaluat ion of common bean germ plasm
tolerant to low P availabilit y in t ropical soils. J Plant Nut r Fert (植
物营养与肥料学报) , 1(1) : 30~ 37( in Chinese)
23 Zhang FS ( 张福锁 ) . 1997. Environment St ress in Response to
Plant Nut rit ion in Rhizospere. Beijing: China Agricultural Press. 2
~ 9 ( in Chinese)
24 Zh eng SJ, Ma JF, Matsumoto H. 1998. High aluminum resistance in
buckw heat I. Al induced specif ic secret ion of oxalic acid from root
t ips. Plant Physiol , 117: 745~ 751
作者简介 沈 宏, 男, 1970 年生, 博士, 副教授, 主要从事
植物根际营养与环境胁迫方面的研究, 发表论文 20 篇. T el:
02085281822, Email: shenong@ 163. net
310 应 用 生 态 学 报 13卷