全 文 ：· 3237 ·中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年8月第31卷第8期 CJTCMP , August 2016, Vol . 31, No. 8
本研究表明，龙鳖胶囊能增加KOA大鼠体质量及脾脏指
数，使降低的胸腺指数恢复至正常水平，其治疗KOA的作用可
能与增强大鼠免疫器官的功能相关，其具体作用机制尚需进一
步深入研究。
参 考 文 献
[1] 李晓初,万豫尧,刘军,等.龙鳖胶囊治疗膝骨性关节炎的临床
研究.中医正骨,2004,16(4):10-11
[2] 黄永明,潘建科,郭达,等.Ⅱ型胶原蛋白酶诱导SD大鼠膝骨关
节炎模型的建立.广东医学,2015,36(8):1145-1148
[3] 刘军,潘建科,黄永明,等.胶原酶诱导的鼠类退行性膝骨关节
炎模型应用进展.实用医学杂志,2013,29(23):3949-3950
[4] 张秀玲,孙永岭,郑世英,等.高校动物学实验的动物福利及
“3R”原则.南方医学教育,2012(1):15-16
[5] De Souza R A,Xavier M,Mangueira N M,et al.Raman spectroscopy
detection of molecular changes associated with two experimental
models of osteoarthritis in rats.Lasers Med Sci,2014,29(2):797-804
[6] Seo B K,Park D S,Baek Y H.The analgesic effect of electroacupuncture
on inflammatory pain in the rat model of collagenase-induced
arthritis:mediation by opioidergic receptors.Rheumatol Int,
2013,33(5):1177-1183
[7] 牟光庆,李霞,李瑶喜,等.乳酸菌胞外多糖增强小鼠免疫功能
的研究.食品科学,2009,30(5):260-262
[8] 向孝兵.龙鳖胶囊治疗膝关节骨性关节炎的临床研究.广州:
广州中医药大学,2000
[9] 马建,刘波,罗小兵,等.大强度肌肉离心训练以及抗肌肉疲劳中
药对家兔体重、血红蛋白和脾脏组织结构影响的实验研究.
中国运动医学杂志,2001,20(1):85-87
[10] 马建,刘波,戴国钢,等.中医消除运动性肌肉疲劳动物实
验研究——外用、内服中药对两周离心训练后兔骨骼
肌形态学、组织学和细胞学影响.中国运动医学杂志,
2002,21(2):146-151
[11] 金龙,葛争艳,刘建勋.五子衍宗丸对小鼠记忆力、免疫
功能、耐缺氧及耐疲劳的影响.中国实验方剂学杂志,
2010,16(16):123-125
[12] 陈利平,吴整军,仝战旗,等.抗疲劳中药对小鼠抗疲劳及调节
免疫作用的研究.中华中医药学刊,2012,30(3):493-494
[13] Gierman L M,van der Ham F,Koudijs A,et al.Metabolic stress-
induced inflammation plays a major role in the development of
osteoarthritis in mice.Arthritis Rheum,2012,64(4):1172-1181
[14] Takada K,Hirose J,Senba K,et al.Enhanced apoptotic and
reduced protective response in chondrocytes following
endoplasmic reticulum stress in osteoarthritic cartilage.Int J Exp
Pathol,2011,92(4):232-242
（收稿日期：2014年12月7日）
·研究报告·
北京地区野生北柴胡种质资源遗传多样性分析
赵香妍，刘长利，薛文峰，张夏楠，罗容
（首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069）
摘要：目的：研究北京地区野生北柴胡种质资源的遗传多样性，对其遗传分化进行分析。方法：应用叶绿体
DNA psbA-trnH序列对北京地区4个居群的野生北柴胡进行遗传多样性分析。结果：北京地区野生北柴胡种质资源
包括6种不同的单倍型，单倍型遗传多样性指数（h）为（0.488±0.082），核苷酸多样性指数（π）为0.00236，
遗传分化系数（Gst）为0.35476，种群间基因流（Nm）为0.45。结论：北京地区野生北柴胡种质资源遗传多样性
较高，但部分地区柴胡遗传多样性较低，急需加强柴胡属野生资源的科学保护与质量评价。
关键词：北柴胡；种质资源；遗传多样性；psbA-trnH序列
基金资助：北京市自然科学基金项目（No.6142002），首都中医药研究专项项目（No.14ZY04）
Genetic diversity analysis of germplasm resources of wild Bupleurum chinense DC. in Beijing
ZHAO Xiang-yan, LIU Chang-li, XUE Wen-feng, ZHANG Xia-nan, LUO Rong
( School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory
Research of Beijing, Beijing 100069, China )
通讯作者：刘长利，北京市丰台区右安门外西头条10号首都医科大学中医药学院，邮编：100069，电话：010-83911633
E-mail：lcl74@126.com
· 3238 · 中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年8月第31卷第8期 CJTCMP , August 2016, Vol . 31, No. 8
柴胡属（Bupleurum L.）是1753年由Linnaeus建立，全世界
约有200种，为伞形科植物中的大属之一。我国柴胡属有42种，
17变种及7个变型，可供药用的柴胡属植物有25种、8变种、3变
型[1]。其中，柴胡Bupleurum chinense DC.是《中华人民共和国药
典》收载可作为正品“柴胡”入药的主要来源[2]，又称“北柴胡”
（为区分其他柴胡属植物，本文称之“北柴胡”），广泛分布于
我国东北、华北、西北、华东、华中等地，这些区域亦分布着其
他柴胡属植物。由于柴胡属植物形态特征极其相近，所以，这
些柴胡属植物的根均被采挖作为“柴胡”流入药材市场。这样
柴胡药材就出现了一药多源的现象，再加上其植物分布的广泛
性，导致了药材质量不稳定，给中医临床疗效带来了不确定性。
保证柴胡药材质量的稳定和优质，需要寻根溯源，评价不同柴
胡种质资源，同时，为选育优良品种开展规范化种植奠定基础。
遗传多样性是生物在经历长期的天择、突变过程中形成的
自然属性，这种属性体现在物种种群间、种群内、甚至个体之
间，其是物种种群和个体遗传变异的总和[3]。丰富的遗传多样
性是植物进化的基础，了解和掌握植物遗传多样性影响因素及
其变化规律，对于植物资源的保护及可持续利用具有十分重要
的意义[4]。张得钧等[5]利用黄管秦艽的叶绿体psbA-trnH序列研
究青海地区栽培黄管秦艽的遗传多样性，认为栽培品的遗传多
样性较高，有利于筛选高品质品种。此外，袁王俊等[6]也利用柴
胡的ITS条带，研究了河南不同产区柴胡的遗传多样性。赵艮贵
等[7]则采用RAPD和AFLP分子标记研究了不同柴胡栽培品种的
遗传多样性，为柴胡栽培种鉴别和药材鉴别奠定了基础。可见，
遗传多样性分析已成为种质资源评价以及良种繁育的基础性
研究。
历史上北京地区燕山、太行山一带是道地药材“北柴胡”
的主要产区之一，经本草考据和产地调查，其原植物来源、外观
性状和内在质量均优于其它[8]。但近些年，基因渐渗等原因致
使柴胡来源混杂，且正品柴胡数量正在不断减少。本研究测定
叶绿体DNA的psbA-trnH片段，分析北京地区不同居群北柴胡的
遗传多样性，为北京山区野生柴胡种质资源的评价、保护和育
种提供科学依据。
材料
1. 药材 实验中所用47份样品于2014年6月-9月采自北京
市门头沟区、房山区、海淀区和延庆县等4个区县山林中，样品
个体数与具体采集地见表1。样品经北京中医药大学刘春生教
授和首都医科大学刘长利副教授鉴定为北柴胡B. chinense。
2. 仪器与试剂 Veriti PCR 仪（美国ABI），DYY-6D电泳系
统（北京市六一仪器厂），离心机（美国，scilogex），紫外凝胶成
像分析仪（法国，VILBER LOURMAT），MM400混合型球磨仪
（德国，Ｒetsch），微量移液器（德国，BRAND）。DNA提取所用
试剂购自天根生化科技（北京）有限公司，引物由生工生物工程
（上海）股份有限公司合成。
方法
1. DNA提取、PCR扩增和测序 取植物新鲜叶片样本20-
40mg，用研磨仪30次/s研磨1min后，采用植物基因组DNA提取
试剂盒提取总DNA。扩增psbA-trnH区所用引物为trnH R：5’-
CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC-3’和psbA F：5’-GTT
ATG CAT GAA CGT AAT GCT C-3’。PCR反应体积50μL，
PCR反应体系包括1μL基因组DNA，10μL 5×Prime STAR GXL
Buffer，4μL dNTP Mix（2.5mmol/L），引物各（10μmol/L）1μL，
1μL Prime STAR GXL DNA Polymerase（1.25U/μL），加ddH2O
至50μL。PCR反应扩增程序为98℃ 3min，98℃ 10s，60℃ 15s，
68℃ 40s，35个循环，68℃ 5min。产物送北京睿博兴科生物技
术有限公司进行双向测序。
2. 数据处理 利用SeqMan对测序峰图进行校对拼接，去
除引物及低质量区，登陆NCBI并将拼接后的序列进行BLAST检
测，证明是柴胡属植物的扩增序列，可用数据纳入后续分析。利
用BioEdit进行多序列比对并查错，将所得序列用软件MEGA 6.0
分析比对，基于K2P模型进行遗传距离等分析，并构建邻接树
（neighbor-joining tree，NJ Tree）。应用DnaSP version 5.0对总体
水平以及每个种群的遗传多样性参数[遗传多样性（h）和核苷
酸多样性（π）]进行估计，并估算种群间的基因流（Nm）与分化
系数（Gst）。
结果
1. 样品DNA提取与psbA-trnH序列扩增 样品提取到的基
因组DNA经电泳后条带都可见清晰的总DNA条带。PCR产物电
泳后均可在500bp左右出现单一的清晰条带，说明各样品均可
以有效扩增出psbA-trnH目的条带。
Abstract: Objective: To analyze genetic diversity of germplasm resources of wild Bupleurum chinense DC. in Beijing.
Methods: Chloroplast DNA psbA-trnH sequences was used to analyze genetic diversity of four populations of wild Bupleurum
chinense DC. in Beijing. Results: Based on the psbA-trnH sequences, the samples were found in six different haplotypes, the
diversity index (h) of haplotypes was 0.488±0.082, nucleotide diversity index (π) was 0.00236, genetic differentiation index
(Gst) was 0.35476, gene fl ow between populations (Nm) was 0.45. Conclusion: Even though the wild populations of Bupleurum
chinense DC. in Beijing area still are high genetic diversity, some areas, however, show low genetic diversity, so it is high time
that Bupleurum wildlife resources be reasonably protected and evaluated.
Key words: Bupleurum chinense DC.; Germplasm resources; Genetic diversity; PsbA-trnH sequences
Funding: Natural Science Foundation of Beijing (No.6142002), Capital Traditional Chinese Medicine Research
Program (No.14ZY04)
· 3239 ·中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年8月第31卷第8期 CJTCMP , August 2016, Vol . 31, No. 8
表1 实验材料来源情况
采集地编号 采集地点 采集地经纬度 采集地海拔（m） 个体数
BHS 门头沟区百花山 E115°35′19.1″ N39°49′43.5″ 1 708.5 7
FHC 房山区蒲洼乡富合村 E115°30′5.7″ N39°43′58.1″ 779.2 11
XS 海淀区西山国家森林公园 E116°11′4.7″ N39°58′9.0″ 299.1 15
SH 延庆县松山 E115°48′52.9″ N40°31′32.3″ 1 207.0 14
表2 柴胡psbA-trnH序列变化情况
单倍型
核酸位置（bp）
10 49 50 51 52 53 60 96 98 104 111 202 242 271 336 337
H1 C G A T T C T A T - C A C A - -
H2 - - - - - - G A T T C A C - A -
H3 C G A T T C T A T T T A C A A -
H4 - - - - - - G A T T C A A - A A
H5 - - - - - - G A G T C - C - - -
H6 C G A T T C T T T T T - C A - -
表3 单倍型分布和遗传多样性指数情况
采集地编号 样品个体数
单倍型分布与单倍型数 遗传多样性指数
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H h π
BHS 7 2 5 0 0 0 0 2 0.476 0.00130
FHC 11 10 0 1 0 0 0 2 0.182 0.00044
XS 15 15 0 0 0 0 0 1 0.000 0.00000
SH 14 6 0 0 1 6 1 4 0.670 0.00431
总和 47 33 5 1 1 6 1 9 0.488 0.00236
注：H：单倍型数；h：单倍型遗传多样性；π：核苷酸多样性。
2. 北京地区柴胡属植物叶绿体trnH-psbA序列特征及分析
见表2。测序后得到的序列长度范围为377-453bp，两端切平后
长度为347bp，AT含量为73.80%-74.78%，GC含量为25.22%-
26.20%，AT含量显著高于GC含量。试验共检测到6种不同的单
倍型，通过单倍型比对，发现16个变异位点。
3. 遗传分化分析 见表3。单倍型在遗传学上是指在同一
染色体上进行共同遗传的多个基因上等位基因的组合。通过
DnaSP version 5.0软件分析可知，单倍型H1数目最多，为33个，
其次单倍型H5为6个，单倍型H2有5个，其余单倍型各有1个。
百花山（BHS）有2个单倍型（H1、H2），房山富合村（FHC）有
2个单倍型（H1、H3），西山国家森林公园（XS）只有1个单倍型
（H1），延庆松山（SH）有4个单倍型（H1、H4、H5、H6），单倍
型H1是所有种群共有的单倍型。
通过DnaSP version 5.0软件分析，根据psbA- t r nH序
列所得柴胡单倍型h=0.488±0.082，π=0.00236。其中，延
庆松山（SH）种群多样性水平和核苷酸多样性水平都最高
（h=0.670±0.00670，π=0.00431），其次为百花山（BHS）种群
多样性（h=0.476±0.171，π=0.00130），房山富合村（FHC）种
群（h=0.182±0.144，π=0.00044），西山国家森林公园（XS）种
群多样性水平最低（h=0.000，π=0.00000）。基于psbA-trnH种
群间Gst为0.35476，即64.524%的遗传多样性存在于种群内，
35.476%的遗传分化存在于种群间，种群间基因流Nm为0.45。
百花山（BHS）与西山国家森林公园（XS）的种群间分化最大
（Gst为0.57816），百花山（BHS）与房山富合村（FHC）次之，为
0.39854，房山富合村（FHC）与西山国家森林公园（XS）的种群
间分化最小，Gst为0.00093。
为进一步分析各单倍型的亲缘关系，将单倍型基因序列
进行比对，共同构建了NJ Tree（图1）。NJ Tree将各单倍型划分
为两个分支，单倍型H6、H3、H1的亲缘关系较近，聚为1支。而
H2、H4、H5则聚为另1支。表明样品北柴胡的单倍型大致可分
图1 各单倍型亲缘关系的NJ Tree
· 3240 · 中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年8月第31卷第8期 CJTCMP , August 2016, Vol . 31, No. 8
为两种类型，观察表3，发现单倍型H3、H6、H1在49-53bp处出
现GATTC片段，而H2、H4、H5则在此处缺失，而在其他各处，
各个单倍型之间也存在不同程度的碱基缺失与突变现象，以上
表明北柴胡基因较为混乱，相互间存在的差异较大。前人研究
中也表明，北柴胡与黑柴胡、小叶黑柴胡、狭叶柴胡等其他柴
胡属植物的亲缘关系较近[9-10]。
讨论
柴胡是中医临床常用的大宗中药材，其在中国分布广泛，
主要分布于东北、西北、华北、华东及河南等地。本研究表明，
基于psbA-trnH序列，在北京不同分布区域的北柴胡种质资源
可分为6种不同单倍型，分布于延庆松山（SH）的北柴胡遗传多
样性最高（h=0.670）。其次是分布于百花山（BHS）的北柴胡遗
传多样性较高（h=0.476），可能与其山顶生长的雾灵柴胡发生
了基因交流（仅在76-79bp碱基有所不同）；而分布于西山国家
森林公园（XS）的北柴胡遗传多样性最低（h=0.000），房山富
合村（FHC）北柴胡遗传多样性也较低（h=0.182）。分析其中的
原因，可能由于松山与百花山属于国家级自然保护区，其植被
受到严格保护，植物的种类较多，环境较为复杂，自然选择压
力相对较大[11]，且样品采自海拔较高区域（1 000m以上），气候
阴凉，花粉可保持相对较长时间的活力[12]，同时低温又可使柴
胡种子胚长度增长，提高其萌发性能[13]，更有利于野生柴胡的
生长，所以，其所在居群多具有丰富的遗传多样性；而西山国家
森林公园与房山富合村海拔则较低（500m以下），生态环境较
为单一，其园区植被受人为影响较大，柴胡种质相对单一，植物
的多样性降低。
研究发现，北京不同山区柴胡群体的基因流<1（Nm =0.45），
表示有限的基因流是促使群体发生遗传分化的主要原因[14]，
较高的遗传多样性存在于居群内，原因可能由于柴胡复伞形
花序中各小花开花时间差异大，且柴胡种子具有胚休眠特性，
含有内源抑制物，种子成熟度不一致，萌发率低[15]，使其居群
内的野生柴胡发育程度不一，难以进行基因交流。此外，测序
结果显示，北京地区北柴胡大致可分为两种类型，单倍型H3、
H6、H1在49-53bp处出现GATTC，而H2、H4、H5则在此处缺
失，且其他核酸位置也有碱基不同程度的缺失现象。梁乾隆
等[16]通过实验研究认为，柴胡属较为混乱，很多种内变异超过
了一些种的种间变异。北柴胡等分布较为广泛的种，具有多个
染色体基数，提出北柴胡可能是一个正在进行分化和变异的复
合类群，可见北柴胡等广泛分布的种还是有些混乱的。而实验
中出现此现象的原因可能是由于柴胡雌雄蕊异熟的特性导致
其异交授粉为主的繁殖方式，在一定程度上促进了居群间基因
交流，而具体还需要进一步研究。
通过对北京地区野生柴胡的psbA-trnH序列的研究表明，
北京地区野生柴胡具有较为丰富的遗传多样性，尤其是百花山
和松山两个国家级自然保护区，丰富的遗传多样性使柴胡属多
个物种得以延续和进化，这为进一步开展柴胡品种选育提供了
物质保证。北京部分地区柴胡遗传多样性较低，主要是受人为
影响。而鉴于一些广泛分布的柴胡属植物较为混乱，柴胡属植
物的分类问题仍有待深入研究。另外，急需加强柴胡属野生资
源的科学保护与质量评价，并对不同种质类型和生态环境下的
柴胡药材质量进行综合评价，为开展优质种苗繁育、不定根培
养以及柴胡规范化种植技术研究奠定基础，大力开展保护柴胡
属植物的遗传多样性研究，防止遗传衰变。
参 考 文 献
[1] 潘胜利,顺庆生,柏巧明,等.中国药用柴胡原色图志.上海:
上海科学技术文献出版社,2002:15-18
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药
科技出版社,2010:263
[3] 钱迎倩,马克平.生物多样性研究的原理与方法.北京:中国科
学技术出版社,1994:1
[4] 文亚峰,韩文军,吴顺.植物遗传多样性及其影响因素.中南林
业科技大学学报(自然科学版),2011,30(12):80-87
[5] 张得钧,高庆波,李福安,等.青海栽培黄管秦艽的叶绿体
DNA psbA-trnH核苷酸变异和遗传分析.安徽农业科学,
2011,39(25):15215-15217
[6] 袁王俊,张维瑞,尚富德.河南产不同居群柴胡遗传多样性分析.
中草药,2012,43(6):1166-1169
[7] 赵艮贵,南晓洁,郝媛媛,等.柴胡栽培种的RAPD和AFLP遗传
关系研究.中草药,2010,41(1):113-117
[8] 魏建和,陈士林,魏淑秋,等.北柴胡适生地分析及数值区划研究.
世界科学技术-中医药现代化,2006,7(6):125-129
[9] 武莹,刘春生,刘玉法,等.5种习用柴胡的ITS序列鉴别.中国中
药杂志,2005,30(10):732-734
[10] 谢晖,晁志,霍克克,等.9种柴胡属植物的核糖体ITS序列及其在
药材鉴定中的应用.南方医科大学学报,2006,26(10):1460-1463
[11] Nevo E.Evolution of genome-phenome diversity under environmental
stress.Proceedings of the National Academy of Sciences,
2001,98(11):6233-6240
[12] 于婧,魏建和,杨成民,等.柴胡花器官发育及繁育系统研究.
贵阳:全国第8届天然药物资源学术研讨会论文集,2008
[13] 杨成民,曹海禄,魏建和,等.发芽温度及种质对柴胡种子萌发
的影响.中草药,2007,38(3):426-429
[14] WRIGH S.Evolution and the Genetic of Population.Vol.4.
Variability Within and Among Natural Population.Chicago:
University of Chicago Press,1978
[15] 姚入宇,陈兴福,邹元锋,等.北柴胡种子生物学研究进展.中国
中药杂志,2011,36(17):2429-2432
[16] 梁乾隆,王长宝,马祥光,等.中国柴胡属染色体数目和核型研究.
植物科学学报,2013,31(1):11-22
（收稿日期：2015年4月29日）