全 文 ：徐兴利 ,金则新 ,李钧敏 ,等.山鸡椒 ISSR扩增条件的优化[ J] .江苏农业科学 , 2011(1):36-38.
山鸡椒 ISSR扩增条件的优化
徐兴利 1, 2 , 金则新2 , 李钧敏 2 , 祈彩虹 1, 2
(1.西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室 ,重庆北碚 400715;2.台州学院生态研究所 ,浙江临海 317000)
　　摘要:采用改进的 SDS法提取山鸡椒基因组 DNA,利用单因素试验对 ISSR反应体系中的 Mg2+浓度 、dNTP浓度 、
模板 DNA用量 、TaqDNA聚合酶用量 、BSA浓度 、引物用量进行筛选和优化 ,得出了适用于山鸡椒 ISSR分析的扩增条
件:10 μLPCR反应体积 , 1×Taq酶配套缓冲液(200 mmol/LTris· HCl, pH值 8.8, 100 mmol/LKCl, 1%TritonX-100,
100 mmol/L(NH4)2SO4 , 15 mmo1/LMgCl2), 0.8 UTaqDNA聚合酶 , 16 ng模板 DNA, 6 pmol引物 , 0.3 mmol/LdNTP,
1.75mmol/LMg2+。利用优化反应体系从 100个 ISSR引物中筛选出 12个重复性好 、稳定性高的引物对 21个山鸡椒
个体的 DNA进行扩增 ,共得到 107个位点 , 其中 , 91个为多态位点 , 多态位点百分率为 85.05%, Nei指数为 0.361 3,
Shannon信息指数为 0.522 1, 表明山鸡椒的遗传多样性处于较高水平。
　　关键词:山鸡椒;ISSR;优化;遗传多样性
　　中图分类号:S567.901　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)01-0036-03
(上接第 35页)
PCR反应体系来说 ,正交试验是较为理想的方法 。
参考文献:
[ 1]梁松筠.百合科(狭义)植物的分布区对中国植物区系研究的意
义 [ J].植物分类学报 , 1995, 33(1):27-51.
[ 2]娄晓鸣 ,成海钟 ,朱旭东.观赏贝母花粉生活力贮藏性研究 [ J].
江苏农业科学 , 2007(1):101-102.
[ 3] ZietkiewiezE, RafslskiA, LabudaD.Genomefingerprintingbysim-
plesequencerepeat(SSR)-anchoredpolymerasechainreactionam-
plification[J] .Genomics, 1994, 20:176-183.
[ 4] DirlewangerE, PronierV, ParveryC.Geneticlinkagemapofpeach
(Prunuspersica)usingmorphologicalandmolecularmarkers[ J].
TheoreticalApplGenet, 1998, 97(5/6):888-895.
[ 5] BlairMW, PanaudO, MccouchSR.Inter-simplesequencerepeat
(ISSR)amplificationforanalysisofmicrosatelitemotiffrequencyand
fingerprintinginrice(Oryzasativa)[ J] .TheoreticalApplGenet,
1999, 98(5):780-792.
[ 6] EsselmanEJ, JianqiangL, CrawfordDJ, etal.Clonaldiversityinthe
rareCalamagrostisporterisp.insperata(Poaceae):comparativere-
sultsforalozymesandrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)
andintersimplesequencerepeat(ISSR)markers[ J].MolEcol, 1999,
8(3):443-451.
[ 7] GilbertJE, LewisRV, WilkinsonMJ.Developinganappropriate
strategytoassessgeneticvariabilityinplantgermplasmcolections
[J].TheoreticalApplGenet, 1999, 98(6/7):1125-1131.
[ 8]杜道林 ,苏　杰 ,周　鹏.香蕉 RAPD分析初步研究 [ J].广西植
物 , 2001, 21(3):243-246.
[ 9]何正文 ,刘运生 , 陈立华.正交设计直观分析法优化 PCR条件
[ J].湖南医科大学学报 , 1998, 23(4):403-404.
[ 10]冯富娟 ,王凤友 ,刘　彤.红松 ISSR-PCR试验系统影响因素
[ J] .植物学通报 , 2004, 21(3):326-331.
[ 11] BrunoWSS, RhondaJH.Highoutputgeneticmappingofpoly-
ploidsusingPCR-generatedmarkers[J] .TheoreticalApplGenet,
1993, 86(1):105-112.
[ 12]谢运海 ,夏德安 ,姜　静 ,等.利用正交设计优化水曲柳 ISSR-
PCR反应体系 [ J] .分子植物育种 , 2005, 3(3):445-450.
[ 13]李文表 ,周先叶, 李　勇.棕榈 ISSR反应条件的筛选与优化
[ J] .广西植物 , 2006, 26(2):204-208.
[ 14]王　佳 ,胡永红 ,张启翔.牡丹 ISSR-PCR反应体系正交优化设
计 [ J] .安徽农业科学 , 2006, 34(24):6465-6466.
　　简单重复序列区间 (inter-simplesequencerepeat, IS-
SR),是 Zietkiewiez等 [ 1 ]于 1994年创建的建立在 PCR基础上
的一种新的分子技术 ,它结合了 SSR和 RAPD的优点 ,并由
于其具有引物开发费用低 、DNA用量少 、多态水平高等特
点 [ 2 ] ,近年来已广泛用于品种鉴定 、物种多样性等相关领域
的研究 [ 3 -4] 。由于 ISSR技术也是基于 PCR的一种分子技
收稿日期:2010-03-19
基金项目:浙江省自然科学基金(编号:Y507660)。
作者简介:徐兴利(1986—),男 ,重庆开县人 ,硕士研究生 , 从事植物
生态学研究。 E-mail:xingli-xu@163.com。
通信作者:金则新 ,教授, 从事植物生态学研究。 E-mail:jzx@tzc.
edu.cn。
术 ,因此 ,影响 PCR效果的因素诸如牛血清白蛋白浓度 、Mg2 +
浓度 、dNTP浓度 、模板 DNA用量 、引物用量以及 TaqDNA聚
合酶用量等均会影响 ISSR的扩增结果 。因此 ,为了获得稳定
而可靠的扩增结果 ,在研究时都应先建立合适的反应体系并
对其进行优化 。
山鸡椒(Litseacubeba),落叶灌木或小乔木 ,花 、叶和果皮
主要提制柠檬醛的原料 ,供医药制品和配制香精等用 ,种子含
油约 40%,为工业用油 。全株可入药 ,有祛风 、散寒 、理气 、止
痛之效 ,主治感冒或预防感冒 ,果实入药 ,称 “毕澄茄 ”,可治
胃寒痛和血吸虫病 [ 5-8 ] 。本研究以山鸡椒的基因组 DNA为
模板 ,探讨 ISSR-PCR反应体系中 6种因素对扩增的影响 ,
以期获得山鸡椒 ISSR反应的最佳体系 ,为山鸡椒遗传多样性
的分析奠定基础 。
—36— 江苏农业科学　2011年第 1期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.01.153
1　材料与方法
1.1　材料
试验材料采自浙江省临海市水磨坑 ,地理位置 28°52′N,
121°07′E,海拔 132 m。随机选取 21株山鸡椒个体 ,每株个体
至少间隔 20 m,采集植株的幼嫩叶片置于保鲜袋中 ,并编号 、
封口 ,于样品贮藏箱(由超低温冰袋保持冷藏条件)带回实验
室 , -70℃低温冰箱保存 ,供 DNA提取 。
1.2　方法
1.2.1　DNA提取与定量　采用改进的 SDS法 [9 ] 。 DNA经
0.8%琼脂糖凝胶电泳分析 ,用 GIS凝胶成像分析系统 (上海
天能科技服务公司)拍照定量 ,稀释成终浓度 20 ng/μL,
-20 ℃保存 ,备用 。
1.2.2　ISSR原初扩增条件及 PCR扩增程序 　ISSR引物采
用加拿大哥伦比亚大学提供的序列 (UniversityofBritishCo-
lumbia, SetNo.9 , No.801 ～ 900),由上海生工生物工程公司合
成 。原初 ISSR扩增反应体系为:10μL的 PCR反应体积中 ,
0.3mmol/LdNTP, 1mg/mL牛血清白蛋白(BSA), 20ng模板
DNA, 6 pmol引物(上海 Sangon公司), 1 UTaqDNA聚合酶
(北京鼎国公司)。 ISSR-PCR扩增采用 TouchdownPCR扩
增程序:94℃预变性 5min;94 ℃变性 1 min, 57℃退火 1min
(每个循环降低 0.5 ℃), 72 ℃延伸 1.5 min,共 10个循环;
94 ℃变性 1min, 52 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1.5 min,共 25
个循环;72℃延伸 5 min。所有反应在美国 Bio-Rad公司生
产的 PTC220PCR仪中进行 。扩增产物在 1.6%的琼脂糖凝
胶(含 0.5 μg/mL溴化乙锭)中电泳 , 电泳缓冲液为 0.5 ×
TBE,用 200 bpDNALadder做分子量标记 ,于 GIS凝胶成像
分析系统 (上海天能科技服务公司)拍照保存 。根据原初
PCR反应条件 ,筛选出扩增条带多且清晰的 UBC810作为优
化的引物 。
1.2.3　山鸡椒 ISSR-PCR扩增反应体系的优化　按常规方
法 ,采用单因素试验 ,共试验了 6个因素各 4个水平 (表 1)。
其余条件同 “1.2.2”。
表 1　ISSR-PCR体系优化的因素与水平
水平
Mg2+
浓度
(mmol/L)
Taq酶
用量(U)
BSA
浓度
(mg/mL)
引物
用量
(pmol)
模板DNA
用量
(ng)
dNTP
浓度
(mmol/L)
1 1.50 0.6 0 3 12 0.2
2 1.75 0.8 1 6 16 0.3
3 2.00 1.0 2 12 20 0.4
4 2.50 1.2 3 18 24 0.5
2　结果与分析
2.1　Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2 +浓度是影响 ISSR-PCR扩增结果的一个重要因素 。
它通过影响 TaqDNA聚合酶的活性从而显著地影响 PCR扩
增 [ 10-11 ] 。在山鸡椒的 ISSR-PCR扩增中 , Mg2 +浓度的变化
对 ISSR的条带量影响不大 。从图 1 -A可以看出 , Mg2+浓度
以 1.75 mmol/L效果最佳 ,可扩增出明亮清晰且稳定的条带;
随着 Mg2 +浓度升高 ,条带数量变化不大 ,而扩增背景略有增
高 。因此 ,本研究中 , Mg2+的最适浓度为 1.75mmol/L。
2.2　TaqDNA聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
在 PCR反应中 , TaqDNA聚合酶用量的变化影响试验结
果 。用量过少 ,不能扩增;用量过多 ,不仅增加试验成本 ,而且
导致非特异性产物增加 。在 10 μL的反应体系中 , 当 Taq
DNA聚合酶用量为 0.8 U时 ,条带最多且最清晰(图 1 -A),
此后随着 TaqDNA聚合酶用量的增加 ,条带变得模糊不清 ,
TaqDNA聚合酶用量过高 ,会引起 PCR扩增效果的降低 ,这
与其他文献报道一致 [ 12 -14] 。当 Taq酶单位低于 0.8U时 ,条
带模糊不清甚至丢失 。因此 ,本试验确定最佳 TaqDNA聚合
酶用量为 0.8U。
2.3　BSA用量对 ISSR扩增的影响
植物 DNA中常含有内源多酚类化合物 ,该类化合物可与
相应的蛋白质结合 ,致使酶失活 ,而 BSA可以通过其上富含
赖氨酸的阳离子与多酚化合物的阴离子相互作用 ,或通过疏
水相互作用力消除内源多酚类化合物 ,起到消除多酚化合物
与蛋白质的作用 ,即阻止它们与 Taq酶结合 ,从而提高酶活
性 ,最终对 PCR反应起到改善的作用 [ 15-16] 。但研究中发现 ,
添加 BSA会使分子量大的条带亮度明显下降甚至丢失 (图
1-A)。因此 ,在本研究采用不添加 BSA的方法 。
2.4　引物用量对 ISSR扩增的影响
引物浓度会对 ISSR-PCR的扩增结果产生明显的影响 ,
—37—徐兴利等:山鸡椒 ISSR扩增条件的优化
浓度过低不能扩增 ,浓度太高则会引起非特异性扩增 ,并形成
引物二聚体 。在本研究中 ,引物用量的变化对扩增条带的数
量和强弱影响较明显 。当引物量为 3 pmol时 ,条带亮度低 ,
且分子量小的条带扩增不出 ,当用量增加到 6 pmol时 ,条带
最多且亮度清晰 ,但是当引物量增加至 12 pmol和 18 pmol
时 ,大分子量的条带亮度减弱 (图 1 -A)。本研究选择的引
物用量为 6 pmol。
2.5　模板 DNA用量对 ISSR扩增的影响
从图 1-A可知 ,模板 DNA用量的变化对 ISSR条带的数
量和强弱影响不大 。 10 μL反应体积中 ,模板 DNA用量从
12 ～ 24 ng均可扩增获得清晰的条带 ,带型与亮度变化不大 ,
只是当模板 DNA用量为 12 ng时 ,扩增的条带亮度较弱 。考
虑到模板 DNA浓度过低 ,将导致扩增产物不稳定 ,而模板
DNA浓度过高 ,又会增加非特异性产物的扩增 ,因此 ,本研究
采用的最适模板 DNA用量为 16 ng。
2.6　dNTP用量对 ISSR扩增的影响
dNTP作为扩增的底物 ,其浓度变化直接影响 PCR扩增
结果 。当 dNTP的浓度为 0.2 mmol/L时 ,分子量小的条带较
清晰 , 但高分子条带 亮度较低弱;当 dNTP浓度大于
0.3mmol/L时 ,小分子条带亮度明显下降甚至丢失 (图 1 -
B)。因此 ,本研究中的最佳 dNTP浓度为 0.3mmol/L。
2.7　山鸡椒 ISSR扩增及遗传多样性
经以上分析 ,确立了山鸡椒最适宜的 ISSR反应体系 ,利
用该反应体系对 100个引物进行了筛选 ,得到 12个扩增条带
清晰 、重复性好 、稳定性高的引物 ,并作为正式扩增的 ISSR引
物(表 2)。用这 12个引物对分布在水磨坑的山鸡椒种群共
21个个体的 DNA进行 ISSR扩增 ,共扩增出 107个 DNA片
段 ,分子量为 200 ～ 2 000 bp。经 POPGENE32软件分析 ,在所
检测到的 107个位点中 ,多态位点为 91个 ,多态位点百分率
为 85.05%, Nei指数为 0.361 3, Shannon信息指数为
0.522 1 ,表明山鸡椒的遗传多样性处于较高水平 。
表 2　用于 ISSR分析的 12个随机引物序列
引物 序列 引物 序列 引物 序列
UBC810 (GA)8T UBC840 (GA)8YT UBC864 (ATG)6
UBC815 (CT)8G UBC842 (GA)8YG UBC866 (CTC)6
UBC817 (CA)8A UBC855 (AC)8YT UBC868 (GAA)6
UBC826 (AC)8C UBC856 (AC)8YA UBC890 VHV(GT)7
3　结论与讨论
ISSR技术是基于 PCR扩增反应的一种新型分子标记技
术 ,虽然具有诸多的优点 ,但同时也易受多种因素的影响 ,本
研究结果表明 , dNTP用量 、引物用量、TaqDNA聚合酶的用量
对反应的影响较大 。如 dNTP用量逐渐增大时 ,条带开始变
得清晰 ,但当其增加至 0.4mmol/L时 ,条带又开始变得模糊;
又如 TaqDNA聚合酶用量过高会产生非特异性扩增产物 ,过
少则扩增不明显 ,所以需要合适的用量 。通过分析 Mg2+浓
度 、dNTP浓度 、BSA浓度 、模板 DNA用量 、引物用量 、Taq
DNA聚合酶用量等因素对山鸡椒 ISSR扩增结果的影响 ,获
得山鸡椒 ISSR-PCR反应体系较适宜的扩增条件为:10 μL
PCR反应体积中 , 1 ×Taq酶配套缓冲液(200 mmol/LTris·
HCl, pH值 8.8 , 100 mmol/L KCl, 1% TritonX - 100 ,
100mmol/L(NH4 )2SO4 , 15 mmol/LMgCl2 ), 0.8 UTaqDNA
聚合酶 , 16 ng模板 DNA, 6 pmol引物 , 0.3 mmol/LdNTP,
1.75 mmol/LMg2 +。
经反复试验 ,在此优化条件下可以获得重复 、稳定的 IS-
SR扩增结果 。采用 12个引物对分布在浙江省临海市水磨坑
的山鸡椒自然种群进行初步检测 , 其多态位点百分率为
85.05%, Nei指数为 0.361 3, Shannon信息指数为 0.522 1 ,表
明水磨坑山鸡椒自然种群的遗传多样性较高 。
参考文献:
[ 1] ZietkiewiczE, RafalskiA, LabudaD.Genomefingerprintingbysim-
plesequencerepeat(SSR)-anchoredpolymerasechainreactionam-
plification[J] .Genomics, 1994, 20:176-183.
[ 2]姜　静 , 杨传平 ,刘桂丰 ,等.桦树 ISSR-PCR反应体系的优化
[ J].生态学杂志 , 2003, 22(3):91-93.
[ 3]葛永奇 ,邱英雄 ,丁炳扬 , 等.孑遗植物银杏群体遗传多样性的
ISSR分析 [ J] .生物多样性 , 2003, 11(4):276-287.
[ 4] LiAG.Geneticvariationandcolonaldiversityofpsammochloavilosa
(Poaceae)detectedbyISSRmarkers[ J] .AnnalsofBotany, 2001,
87:585-590.
[ 5]王崇云 ,陈敬炳 ,芦水珍 ,等.山鸡椒治疗冠心病有效成分的研究
[ J] .中国中药杂志 , 1985, 9(10):30-32.
[ 6]刘子皎 ,朱　惠 ,林建峰 ,等.金针菇、山鸡椒对大鼠萎缩性胃炎
的药效学研究 [ J] .海峡药学 , 1998, 10(4):31-32.
[ 7]金静兰 ,陈桂初 ,文永新 , 等.山鸡椒根部精油化学成分的研究
[ J].广西植物 , 1991, 11(3):254-256.
[ 8]周宏辉 ,葛发欢.山鸡椒化学成分和药理作用的研究概况 [ J].
中药材 , 1990, 13(9):43-45.
[ 9]李均敏 ,金则新 , 柯世省.濒危植物七子花 RAPD条件的优化
[ J].植物学通报 , 2002, 19(4):452-456.
[ 10]卢盛栋.现代分子生物学试验技术 [ M] .2版.北京:中国协和
医科大学出版社 , 1999:458-463.
[ 11]王彦华 ,侯喜林 ,徐明宇.正交设计优化不结球白菜 ISSR反应
体系研究 [ J] .西北植物学报 , 2004, 24(5):899-902.
[ 12]袁长春 ,施苏华 ,叶刨兴.扩增条件对茶类植物 RAPD带的影响
[ J] .热带亚热带植物学报 , 1999, 7(4):313-317.
[ 13]蔡琰琳 , 金则新 ,李钧敏.大血藤 ISSR-PCR反应体系的建立
[ J].江西农业大学学报 , 2006, 28(4):583-586.
[ 14]金则新 ,李钧敏.濒危植物夏蜡梅 ISSR扩增条件的优化 [ J].
植物研究 , 2007, 27(1):68-72.
[ 15] KreaderCA.ReliefofamplificationinhibitioninPCRwithbovine
serumalbuminorT4gene32protein[J].AppliedandEnvironmen-
talMicrobiology, 1996, 62(3):1102-1106.
[ 16]李钧敏 ,金则新.珍稀濒危植物香果树 ISSR-PCR反应体系的
筛选与优化 [ J] .安徽农业大学学报 , 2006, 33(4):458-461.
—38— 江苏农业科学　2011年第 1期