全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 提取物与应用
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2016年 第41卷 第12期
收稿日期：2016-06-07 *通讯作者
基金项目：云南省教育厅重大专项(ZD2014007)；云南省建立农科教相结合新型农业社会化服务体系试点云咖啡项目(2014NG004)。
作者简介：付晓萍(1979—)，男，硕士，讲师，研究方向为食品生物化学。
付晓萍，张云鹤，谷大海，林 奇，刘苏瑶，袁 唯，范江平*
(云南农业大学食品科技学院，昆明 650201)
摘要：云南小粒咖啡已成为云南省热带特色产业。云南小粒咖啡果皮在制作咖啡制品时常作
为副产物丢弃，然而小粒咖啡果皮也可以作为花青素的来源。以人脐静脉内皮细胞(Human
Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)进行培养，通过不同浓度(100、200、300、400 mg/
L)的云南小粒咖啡果皮提取物处理后，再利用400 µmol/L过氧化氢处理建立氧化损伤模型，
对云南小粒种咖啡果皮粗提物的抗氧化损伤活性进行研究。结果表明，加入不同浓度的咖
啡果皮粗提物对于受到损伤的人脐静脉内皮细胞有一定的保护和恢复作用；在对细胞氧化
应激相关物质的分析测定中发现，相比氧化损伤组，400 mg/L浓度的咖啡果皮粗提物处理
组提高了细胞中SOD活性(9.6±0.35)%，MDA含量降低了(23.0±0.063)%以及LDH活性抑制了
(35.1±0.267)%。另外，通过流式细胞仪(FACS)测定结果得出咖啡果皮粗提物对细胞具有保护
作用。
关键词：云南小粒种咖啡果皮；花青素；抗氧化活性
中图分类号：TS 273 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2016)12-0183-05
Effect on anti-oxidative injuries of human umbilical vein endothelial cell
of crude extracts from Yunnan Arabica coffee husk
FU Xiao-ping, ZHANG Yun-he, GU Da-hai, LIN Qi, LIU Su-yao, YUAN Wei, FAN Jiang-ping*
(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201)
Abstract: The Yunnan Arabica coffee has been tropical characteristic industry in Yunnan province. The
coffee husks were removed and discarded during the dehulling process, however, coffee husks could
be used as potential sources of anthocyanins. This paper was aim to investigate anti-oxidative injuries
effect of crude extracts from Yunnan Arabica coffee husk for HUVEC cells. The results indicated that the
extracts possessed potentially protective effects for cells that underwent oxidative injuries due to 400
µmol/L of hydrogen peroxide (H2O2) treatment, compared with the H2O2 treatment alone cells group, 400
mg/L of the extract increased the activity of superoxide dismutase (SOD) in cells by (9.6±0.35)%, and
decreased the concentration of malondialdehyde (MDA) and the activity of lactate acid dehydrogenase
(LDH) by (23.0±0.063)% and (35.1±0.267)%, respectively. In addition, the fluorescence activated cell sorter
(FACS) results by AnnexinV-FITC/PI showed that the extract possess potential anti-apoptosis activity,
云南小粒种咖啡果皮粗提取物对人
脐静脉内皮细胞抗氧化损伤的研究
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2016.12.037
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咖啡属于热带经济作物[1]。我国是咖啡种植
国之一，主要的咖啡种植地是海南省和云南省，
其中云南省产量较大，咖啡是云南省仅次于烟
草、蔬菜的第三大出口创汇农产品[2-3]。云南省咖
啡主要品种是阿拉比卡，即所谓的小粒种咖啡，
国内俗称云南小粒种咖啡[4]。咖啡果的外层是一
层光滑的果皮，未成熟时通常是绿色的，咖啡果
实成熟后，果皮会变成深红色或红紫色(有的品
种会变成黄色或橘色)。在制作咖啡制品时，咖啡
果皮往往作为副产物丢弃，极大地污染了环境。
Emille[5]和Saenger[4]的研究报道，每干制生产1 t咖
啡豆，大约要产生1 t的咖啡果皮，而在半湿和湿
加工过程中，咖啡果皮的量会达到2 t以上。制作
咖啡所产生的咖啡果皮大多被丢弃，不但对环境
造成污染还造成了原料的浪费。尽管现在已有对
咖啡果皮综合应用的报道[6-7]，但对其功能性成分
的研究和应用进展不大。有报道称咖啡果皮可以
作为花青素的来源[5]。花青素是自然界中广泛存
在于植物中的一类水溶性天然色素，属于生物类
黄酮化合物。现在已经报道的体外研究中花青素
在多个细胞系统如白血病细胞、肝癌细胞、乳腺
癌细胞等中表现出抗氧化、抗肿瘤的特性[8-10]，
在体内研究中花青素也具有一定的预防癌症和抗
癌的作用[11-12]，并且花青素中的矢车菊素-3-芸香
糖苷(Cyanidin 3-rutinoside)和矢车菊素-3-葡萄糖
苷(Cyanidin 3-glucoside)被证实可以减少癌症细胞
的体外侵袭性即具有抗癌的作用[13]。前期研究表
明，从云南小粒咖啡果皮提取的色素总酚含量达
30.6%。针对云南小粒咖啡果皮中的提取色素鉴定
到2种花青素，分别为矢车菊素-3-芸香糖苷、矢
车菊素-3-葡萄糖苷。
本实验对云南小粒种咖啡果皮粗提物的活性
进行研究，以HUVEC进行培养，建立过氧化氢氧
化损伤模型，通过不同浓度的云南小粒咖啡果皮提
取物处理后，细胞存活率和超氧化物歧化酶(SOD)
活力、乳酸脱氢酶(LDH)以及丙二醛(MDA)含量的变
化探讨云南小粒种咖啡果皮粗提物抗氧化能力和是
否具有保护细胞的作用，为今后其应用在食品添加
剂、营养保健品等方面提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
云南小粒种咖啡由云南省普洱市北回归咖啡
有限公司提供。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及完全培养基：
上海澳赛尔斯公司；0.25%胰蛋白酶：BI公司；
过氧化氢：国药集团化学试剂有限公司；四甲
基偶氮唑盐(MTT)：美国MP公司；超氧化物歧化
酶(SOD)测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)测定试
剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒：南京建成生物
工程研究所；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂
盒：碧云天生物技术公司；甲醇、磷酸：西陇化
工股份有限公司；盐酸：重庆川东化工集团有限
公司。
1.2 仪器与设备
CO
2
细胞培养箱、全自动酶标仪：美国Thermo
Scientific公司；倒置生物显微镜：上海丹普光学
仪器有限公司；FW-200高速万能粉碎机：北京中
兴伟业仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海爱朗仪
器有限公司；真空冷冻干燥机：上海一恒科学仪
器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 云南小粒种咖啡果皮粗提物样品制备 取
20 g咖啡果皮的冻干粉，在超声震荡的条件下以
HCl-甲醇溶液(pH=5)作为提取剂，提取剂浓度
80%，提取时间120 min，提取温度40 ℃，料液比
1:20 g/mL的提取工艺提取经过浓缩冻干后得到浓
缩冻干粉，将浓缩的冻干粉用色谱级甲醇溶解经
0.22 μm的微孔滤膜过滤后备用。
1.3.2 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养 细胞按
(5000~10000)个细胞/cm2接种细胞于T
25
的培养瓶
中，每个培养瓶中加人脐静脉内皮细胞完全培养
液(完全培养基组成：HUVEC基础培养液，胎牛
血清，生长因子添加剂)(3~5)mL，置于37 ℃、5%
CO
2
培养箱内培养。待细胞贴壁生长正常，培养
至细胞70%~80%融合状态时用0.25%胰蛋白酶消
which apoptosis induced by hydrogen peroxide (H2O2). These results suggested that the extract had
anti-oxidative properties.
Key words: Yunnan Arabica coffee husk; anthocyanins; anti-oxidant activity
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化、传代培养，用于以下实验。
1.3.3 细胞毒性实验(MTT法) HUVEC传代细胞，
按每孔150 μL接种于96孔板，待细胞贴壁生长
正常后，将细胞分为对照组和加样处理组(100、
200、300、400 mg/L)，每组设置8个孔。培养结
束后，每孔均加入无菌的5 mg/mL的MTT溶液50
μL，继续37 ℃培养4 h，吸出各孔中的培养液，
再加入200 μL的DMSO终止反应，摇床震荡10
min，充分溶解甲瓒颗粒，用酶标仪测定吸光度
A，计算各分组的细胞活性。
1.3.4 云南小粒种咖啡果皮粗提物对HUVEC细胞
抗氧化损伤测定 HUVEC传代细胞，按每孔150
μL接种于96孔板，待细胞贴壁生长正常后，将细
胞分为如下几组：对照组、过氧化氢损伤组、加
样过氧化氢损伤组(100、200、300、400 mg/L)，
每组设置8个孔。正常组、损伤组使用完全培养
基，置于培养箱中培养24 h，之后除正常对照组
加入完全培养基，其他各组均加入终浓度为400
μmol/L的过氧化氢培养基进行培养，继续培养24
h。通过测定细胞活性和培养基中MDA、SOD、
LDH的水平判断细胞损伤状况。按上述分组和操
作流程培养处理后，收集培养上清液及细胞裂解
液，按试剂盒说明书操作，比色法和酶标法测
定各组细胞培养上清液、细胞裂解液中MDA、
SOD、LDH的水平。
1.3.5 细胞凋亡测定 细胞经H
2
O
2
处理后，再
以低、中、高剂量(100、300、500 mg/L)的提
取物进行处理，收集的细胞培养液，稍混匀，
转移到离心管中，1000 g离心5 min，丢弃上清
液，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取
(5×104~10×104)重悬的细胞，1000 g离心5 min，
丢弃上清液，加入195 μL Annexin V-FITC结合液
轻轻重悬细胞。分别加入5 μL Annexin V-FITC，
10 µL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20~25)℃
避光孵育(10~20)min，随后置于冰浴中。随即进
行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧
光，碘化丙啶(PI)为红色荧光。
1.4 统计学分析
实验数据以x±s表示，采用SPSS17.0软件的
Duncan测验对数据进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 云南小粒种咖啡果皮粗提物对HUVEC细胞
毒性的影响
由图1可见，HUVEC细胞经过咖啡果皮粗提
物的处理，细胞存活数量并没有降低，而且是随
提物浓度的增加而增加。因此不同浓度的咖啡果
皮粗提物处理对HUVEC细胞没有发生毒性作用。
2.2 云南小粒种咖啡果皮粗提取物对HUVEC细胞
抗氧化活性的测定
图1 细胞毒性实验结果
图2 不同浓度的咖啡果皮提取物对HUVEC抗氧化损伤实验
结果
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 ૮͝ጷጹᑉߚาည ཱࠪጷ    ใऎ NH-
在生长良好的HUVEC细胞中加入不同浓度
的咖啡果皮粗提取物培养24 h，再用400 μmol/
L过氧化氢损伤24 h，利用MTT的方法用酶标仪
进行测定，记录吸光值，计算细胞存活率。由
图2可以看出，加样损伤组与损伤组相比较细胞
存活率都有一定的增加，且随着加样浓度的不
同细胞存活率逐渐增高；将对照组的细胞存活
率定为100.0%，其他组与正常组相比较可得到
损伤组的细胞存活率为(51.5±0.009)%，不同浓
度(100、200、300、400 mg/L)的加样处理组细胞
存活率分别为(52.4±0.008)%、(55.2±0.012)%、
(58.2±0.010)%、(61.7±0.008)%，其中加样处理
组(100、200、300、400 mg/L)分别比损伤组细
胞存活率增加(3.8±0.062)%、(9.5±0.070)%、
(16.7±0.102)%、(24.7±0.106)%。综上可以得出咖
啡果皮粗提取物对H
2
O
2
氧化损伤的人脐静脉内皮
细胞具有一定的保护和恢复性作用。
2.3 云南小粒种咖啡果皮粗提取物对细胞氧化应
激相关物质的测定
在生长良好的HUVEC细胞中加入不同浓度的
咖啡果皮粗提取物培养24 h，用过氧化氢损伤24
h，取细胞培养液，利用试剂盒测定氧化应激有关
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的主要物质：超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛
(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性进行测定，结
果如图3~图5所示。
(16.9±0.016)%、(35.1±0.267)%。因此咖啡果皮
粗提取物可以降低细胞培养液中LDH的活性。
综上所述，不同浓度的咖啡果皮粗提取物处
理组可以有效地提高细胞中清除自由基的SOD活
性，降低MDA含量及抑制LDH活性的增加，有效
地保护细胞，降低氧化损伤对细胞的破坏。
2.4 细胞凋亡测定
在生长良好的细胞中加入不同浓度的咖啡果
皮粗提取物培养24 h，再用过氧化氢损伤24 h，利
用测细胞凋亡的试剂盒处理细胞，用流式细胞仪
检测，测定结果见表1及图6。
表1 咖啡果皮粗提取物对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)
细胞凋亡的影响(X±SD)
组别 剂量/(mg/L) 重复数 平均凋亡率/%
正常组 0 3 34.06±1.23*
损伤组 0 3 44.42±1.11
低剂量组 100 3 30.77±0.92*
中剂量组 300 3 43.79±2.15
高剂量组 500 3 38.65±1.25*
注：与损伤组比较*P<0.05。
图4 不同处理组对HUVEC中MDA含量的影响
图6 不同处理组对HUVEC凋亡的流式分析图

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图3 不同处理组对HUVEC的SOD活力影响

40%าҦ 6N- ૮͝ጷཱࠪጷ    ใऎ NH-
由图3可看出，细胞培养液中SOD的活力
随 着 加 样 浓 度 的 增 加 逐 渐 增 强 ， 加 样 损 伤 组
(100、200、300、400 mg/L)分别比损伤组增加了
(1.4±0.028)%、(8.6±0.037)%、(9.3±0.93)%、
(9.6±0.35)%，虽然其活力没有恢复到正常组的水
平，但也可以看出咖啡果皮粗提取物对于提高细
胞培养液中SOD的活力具有一定的效果，可以减
少细胞的抗氧化损伤。
由 图 4 可 看 出 ， 细 胞 培 养 液 中 M D A 的 含
量 随 着 加 样 浓 度 的 增 加 逐 渐 减 少 ， 加 样 损
伤组(100、200、300、400 mg/L)分别比损伤
组降低了(19.6±0.137)%、(21.3±0.036)%、
(20.1±0.034)%、(23.0±0.063)%。因此咖啡果皮
粗提取物可以降低细胞培养液中MDA的含量。
图5 不同处理组对HUVEC中LDH活性影响

-%)าҦ 6- ૮͝ጷཱࠪጷ    ใऎ NH-
由 图 5 可 看 出 ， 细 胞 培 养 液 中 L D H 的 活
性 随 着 加 样 浓 度 的 增 加 逐 渐 降 低 ， 加 样 损
伤组(100、200、300、400 mg/L)分别比损伤
组降低了(15.8±0.073)%、(16.6±0.045)%、
由图6可知，不同浓度的加样损伤组与损伤
组相比较细胞凋亡率均有下降，低浓度损伤组和
高浓度损伤组与损伤组相比较细胞凋亡率显著下


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降，表明咖啡果皮粗提取物可以降低细胞氧化损
伤，降低细胞凋亡。
3 讨论
人脐静脉内皮细胞是一种血管内皮细胞，具
有多种的生理功能，通过产生和分泌多种活性物
质，维持血管的收缩舒张，在抗凝血和血管构建
等方面起到重要作用[14]。血管内皮细胞的氧化应
激损伤可以由自由基、活性氧、脂质过氧化物、
过氧化氢等通过产生氧自由基导致血管内皮细
胞损伤，当血管内皮细胞受损时，由于功能的失
调，将会导致动脉粥样硬化、脑出血、高血压、
心肌梗死等心血管疾病的发生[15]。HUVEC的体外
培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重
要方法。
血管内皮细胞结构和功能损伤与动脉粥样硬
化的发生和发展有着密切的关系，活性氧自由基
是内皮细胞损伤的主要原因之一[16]。过氧化氢是
机体产生的活性氧，可以促进自由基的生成，当
生物体内的自由基不能及时消除时会同细胞内的
亚铁离子生成活性更强的羟自由基，从而引发脂
类的过氧化导致细胞损伤，使人体产生衰老等疾
病[17]。因此选用人脐静脉内皮细胞作为实验对象
并建立过氧化氢的损伤模型，可以有效地研究咖
啡果皮粗提取物的抗氧化活性的功能。
在本实验中采用400 μmol/L的过氧化氢建立
损伤模型，经过氧化氢处理后，损伤组SOD活力
与对照组相比下降，MDA含量升高，LDH活性降
低，这表明在400 μmol/L的过氧化氢损伤下，细
胞内产生大量的氧自由基，自由基侵害细胞后，
与细胞内的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反
应，生成MDA等代谢产物，大量的MDA使得细胞
磷脂结构发生不可逆的变化，导致细胞膜通透性
增强，细胞活力下降，引起细胞损伤[18]。
综上所述，云南小粒咖啡果皮粗提物对于受
到损伤的人脐静脉内皮细胞有一定的保护和恢复
作用；在对细胞氧化应激相关物质的分析测定中
发现，不同浓度的咖啡果皮粗提物处理组可以提
高细胞中清除自由基的SOD活性，降低MDA含量
及抑制LDH活性的增加，降低氧化损伤对细胞的
破坏。另外，通过流式细胞仪(FACS)测定结果得
出咖啡果皮粗提物对细胞具有保护作用。
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收稿日期：2016-06-12 *通讯作者
基金项目：现代农业产业技术体系专项资金项目(CARS-25&CARS-26)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项新学科培养项目
(KJCX20140204&KJCX20140111-21)；果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室项目(Z141105004414037)。
作者简介：范红梅(1983—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏工程。
范红梅1,2，张 超2，马 越2，赵晓燕2*，江 英1
(1.石河子大学食品学院，石河子 832000；2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，
果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，农业部华北地区园艺作物生物学与
种质创制重点实验室，农业部都市农业(北方)重点实验室，北京 100097)
摘要：研究添加迷迭香和绿茶提取物对茄香酱汁贮藏过程中品质的影响。在茄香酱汁中分别
添加迷迭香提取物0.1、0.25 g/kg，绿茶提取物粉0.05、0.1 g/kg，评价其在4 ℃贮藏过程中品质
的变化。结果表明，迷迭香提取物和绿茶提取物均未对茄香酱汁的风味产生显著影响，但均
显示较强的抗氧化能力，其中迷迭香提取物在0.25 g/kg计量时与Vc在0.05 g/kg时的抗氧化能力
相当。当迷迭香提取物的添加量为0.1 g/kg时，茄香酱汁中微生物的生长明显受到抑制，在货
架期第22天，综合感官评价值优于其他各处理组。因此，添加迷迭香提取物(0.1 g/kg)有效保持
茄香酱汁的品质，延长其货架期。
关键词：茄香酱汁；迷迭香提取物；绿茶提取物；抗氧化
中图分类号：TS 264.9 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2016)12-0188-06
Effects of rosemary extract and green tea extract on qualities of tomato
sauce
FAN Hong-mei1,2, ZHANG Chao2, MA Yue2, ZHAO Xiao-yan2*, JIANG Ying1
(1.Shihezi Univrtsity, Food College, Shihezi 832000; 2.Beijing Vegetable Research Center,
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Key Laboratory of Fruits and
Vegetable Storage and Processing, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of
Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Urban
Agriculture (North), Ministry of Agriculture, Beijing 100097)
迷迭香和绿茶提取物对茄香酱汁
贮藏品质的影响
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2016.12.038