全 文 ：收稿日期:2014-03-24 接受日期:2014-07-03
基金项目:林业公益性行业科研专项(201004081)
* 通讯作者 E-mail:w62338221@ 163． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:1105-1111
文章编号:1001-6880(2015)6-1105-07
响应面法优化杜香多糖提取工艺
张乔会，逄锦慧，杨 喆，王建中*
北京林业大学 北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083
摘 要:杜香是中国东北广泛分布的一种蕴藏量大的植物资源，学者对其成分做了很多的研究，但对杜香多糖
的研究极少，本文以杜香为原料，采取水提醇沉法提取多糖，在单因素实验基础上选取实验因素与水平，根据
Box-Behnken中心组合实验设计原理采用四因素三水平的响应面分析法，得到优化提取工艺为:提取温度为 80
℃，提取时间为 6 h，料液比为 1∶ 35(m/v)，物料粒度为 80 目，在此条件下，多糖提取得率可达 4． 19%。利用红
外和紫外分析，提取物含多糖典型基团，粗提物中多糖含量为 92． 6%。
关键词:杜香;响应面;多糖;提取
中图分类号:TS241 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 06． 030
Optimization of Extraction Conditions of Polysaccharide from
Ledum palustre L． Using Ｒesponse Surface Analysis
ZHANG Qiao-hui，PANG Jin-hui，YANG Zhe，WANG Jian-zhong*
Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China
Abstract:Ledum palustre L．，is a kind of source plant widely distributed in the northeast of China． In this study，water-
soluble polysaccharide extracted from L． palustre with high extraction yield was successfully studied by the method of wa-
ter extraction and ethanol deposition． To improve the extraction yield of the Ledum polysaccharides，a Box-Behnken de-
sign was employed based on four factor experiments． The four independent variables，namely extraction temperature，par-
ticle size，solid-liquid ratio and extraction time on extraction yield of polysaccharides were evaluated by response surface
methodology (ＲSM)． The results showed that the optimum conditions for extracting Ledum polysaccharide were as fol-
lows:extraction temperature 80 ℃，particle size of Ledum 0． 178 mm，solid-liquid ratio 1∶ 35，and extraction time 6h． Un-
der the optimal conditions，the extraction yield achieved 4． 19% ． Furthermore，FT-IＲ and UV analyses showed that L．
palustre extract contained typical group of polysaccharide，the content of polysaccharide in the crude extract of L． palustre
was determined to be 92． 6% ．
Key words:Ledum;response surface methodology;polysaccharide;extraction．
杜香(Ledum palustre L．)为杜鹃花科杜香属的
常绿灌木［1］，是我国东北、内蒙古大兴安岭林区的
主要森林组成树种，其分布面积约占大兴安岭林地
面积的 70%［2］。大兴安岭杜香干叶年生产量达
536925 t /a，小兴安岭杜香的蕴藏量可达 8776． 7 t /
hm2·a，其中允收量以鲜重计为 1843． 2 t /hm2·
a［3］。杜香枝叶含有多种挥发性成分［4］、黄酮类成
分、香豆素类成分等。具有抗菌消炎、透皮吸收、驱
虫、抗辐射等作用［5-7］。可以制作驱虫剂、保健品、日
用品［8］、药品等，在食品、保健品、化妆品及医药等
领域具有广泛的应用前景。
杜香多糖的提取目前鲜见报道，但作为天然的
植物多糖，具有广谱化学结构和生物功能。多糖的
提取可采用水提取法、中性盐溶液提取法、碱提取
法、蛋白酶水解提取法等［9］。其中水作溶剂是提取
植物中多糖的常用方法。植物源多糖常具有提高人
体免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗凝血、抗炎等生理活
性［10-12］，还有抑制脂类氧化、稳定蛋白等作用［13，14］。
本文以杜香为原料采用水提醇沉法提取多糖，利用
红外和紫外光谱分析多糖特征基团及含量，并用响
应面法对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺。
1 材料与方法
1． 1 主要仪器
HHS4-型恒温水浴锅:上海浦东跃新科学仪器
厂;KQ-500E型超声波清洗器:昆山市超声仪器有限
公司;QI-901 涡旋混合器:海门市其林贝尔仪器制
造有限公司;台式离心机:上海安亭科学仪器厂;
ＲE-5203 旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;MET-
TLEＲ TOLEDO-电子天平:梅特勒-托利多仪器(上
海)有限公司;冷冻干燥机 FD-1:北京德天佑科技发
展有限公司;T6 紫外可见分光光度计:北京普析通
用仪器有限责任公司;Tensor27 型 FT-IＲ 红外光谱
仪:德国 Bruker公司。
1． 2 试剂及材料
无水乙醇、去离子水、石油醚、浓硫酸、蒽酮、葡
萄糖等，所有试剂均为分析纯。杜香(由内蒙古金
河林业局 2013 年 7 月中旬采集提供，由北京林业大
学植物专家坚定为杜香)。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 试样的制备
将杜香枝叶切分成 2 ～ 3 cm 的小段后于 40 ℃
烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎，过 20、40、60、80、
100 目筛，存于室内阴凉干燥处备用。
1． 3． 2 杜香多糖提取工艺
采用水提醇沉法。准确称取一定量的杜香枝叶
粉，按一定比例加入去离子水，放入恒温水浴震荡箱
中震荡一定时间，离心分离液体和固体粉末，向上清
液体中加入酒精至浓度为 85%，放置于 4 ℃冰箱中
静置 1 h，分离固液两相，固体为粗多糖。将上一步
得到的样品加入一定量的石油醚处理一定时间进行
脱脂，接着将上一步得到的固相溶解于一定量的去
离子水中，加入酒精至浓度为 85%，放置于 4 ℃冰
箱中静置 1 h，然后分离固液两相，重复上述操作 4
次，冷冻干燥，便可得到杜香多糖成品。
1． 3． 3 杜香多糖定性检测
在 4000 ～ 400 cm-1波长范围内对水提醇沉得到
的杜香多糖进行红外检测，测定分辨率为 2 cm-1。
1． 3． 4 得率计算
按以下公式计算提取得率:
P = m /W ×100%
式中 P-得率;m-提取得到的杜香多糖的干重;
W-杜香枝叶粉末的重量。
1． 3． 5 粗提物中多糖含量测定
杜香多糖粗提物多糖含量的测定采用蒽酮硫酸
法，并以葡萄为参照作标准曲线。
1． 3． 5． 1 标准曲线测定
精密称取 105 ℃下干燥恒重的分析纯葡萄糖
0． 05 g，置于小烧杯中，加去离子水溶解并转移至
1000 mL容量瓶中，摇匀，配制成浓度为 0． 05 mg /
mL葡萄糖标准溶液。准确移取浓度为 0． 05 mg /mL
葡萄糖标准溶液 0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、
0． 8、0． 9 mL于 10 mL 比色管中，加蒸馏水补足至 1
mL。在冰水浴中加入 0． 1%蒽酮硫酸溶液 4 mL，摇
匀。置于沸水浴中加热 15 min 后取出，自来水冷却
至室温并放置 10 min，以蒸馏水代替样液作空白，在
最 580 nm处读取吸光度。以葡萄糖含量为纵坐标、
吸光度为横坐标绘制标准曲线。
1． 3． 5． 2 杜香多糖含量的测定
准确称取提取的杜香多糖 0． 03 g，置于 100 mL
容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成
0． 3 mg /mL的杜香多糖贮备液。将杜香多糖贮备液
稀释 10 倍后，取 1 mL 按 1． 3． 5． 1 方法测定杜香多
糖贮备液的吸光度，根据标准曲线方程求出此杜香
多糖贮备液中含量，从而计算出杜香多糖粗提物中
多糖的含量。
1． 3． 6 杜香多糖提取的单因素试验设计
分别以不同的提取温度、时间、物料粒度及液料
比为单因素，考察各因素对杜香多糖提取得率的影
响。
1． 3． 6． 1 物料粒度
设定料液比 1∶ 20，提取温度 60 ℃，提取时间 2
h，考察物料粒度分别为 20、40、60、80、100 目时对多
糖提取得率的影响。
1． 3． 6． 2 料液比
设定物料粒度 40 目，提取温度 60 ℃，提取时间
2 h，考察料液比分别为 1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、
1∶ 30、1∶ 35(m/v)时对多糖提取得率的影响。
1． 3． 6． 3 提取时间
设定物料粒度 40 目，料液比 1∶ 20，提取温度 60
℃，考察提取时间分别为 1、2、3、4、5 h 时对多糖提
取得率的影响。
1． 3． 6． 4 提取温度
设定物料粒度 40 目，料液比 1∶ 20，提取时间 2
h，考察提取温度分别为 20、40、60、80、100 ℃时对多
糖提取得率的影响。
1． 3． 7 杜香多糖提取工艺的试验设计
在单因素试验的基础上，运用 Design expert 7． 1
软件程序，根据 Box-Behnken 中心组合实验设计原
6011 天然产物研究与开发 Vol. 27
理［5，15］，采用四因素三水平的响应面分析法，以提取
温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、物料粒度(D)
为自变量，以杜香多糖的提取率为响应值，通过响应
曲面分析(response surface analysis，ＲSA)对提取条
件进行优化。
表 1 响应面试验因素水平设计表
Table 1 Analytical factors and levels for ＲSA
水平
Levels
因素 Factors
A温度
Temperature(℃)
B时间
Time(h)
C料液比
Solid∶ liquid ratio(m/v)
D物料粒度
Size of material(目)
-1 60 3 1∶ 25 40
0 80 4 1∶ 30 60
1 100 5 1∶ 35 80
2 结果与分析
2． 1 杜香多糖红外检测结果
杜香多糖红外谱图在 3389、1156-1024、1024、
2889 cm-1的尖峰以及 1567 ～ 1370、1648、1648、903
cm-1等处具有强弱不同的吸收峰。在 3389 cm-1和
1156 ～ 1024 cm-1的峰分别为 O-H 和 C-O 的伸缩振
动，1024 cm-1的较强吸收也说明了杜香多糖中可能
有葡萄糖结构，2889 cm-1的尖峰以及 1567 ～ 1370
cm-1的不太尖的峰分别为 C-H的伸缩振动和变角振
动，1648 cm-1处出现吸收峰，推测该峰为醛基中 C =
O的伸缩振动引起的，谱图在 1648 cm-1波数处还出
现一个较强的吸收峰，说明杜香多糖中可能有酰氨
取代基，谱图在 903 cm-1波数处还出现吸收峰，说明
杜香多糖可能含有 β-型糖苷键。总之，杜香水提醇
沉物具有多糖的一般吸收峰，证明杜香水提醇沉物
为杜香多糖。
2． 2 杜香多糖粗提物中多糖含量测定结果
在葡萄糖含量为 0． 000 ～ 0． 100 mg /mL 的范围
内，葡萄糖含量与吸光度线性关系良好。经线性回
归，标准曲线方程为 y = 9． 790x-0． 002，回归系数 Ｒ2
= 0． 9955。测得杜香粗提物的吸光值为 0． 272，从
而计算出杜香多糖粗提物中多糖的含量为 92． 6%。
2． 3 杜香多糖提取单因素实验结果
从图 1-A可以看出，在提取时间、提取温度、料
液比一定的时候，材料粒度的大小对杜香多糖的提
取得率的影响呈正相关。物料越细，提取得率越大，
且随着物料目数的增大，杜香多糖的提取得率以稳
定的趋势上升。但由于将物料粉碎过细会影响下一
步分离，且能耗大不环保，故只考虑至 100 目。
从图 1-B 看出，料液比从 1 ∶ 10 增加到 1 ∶ 20
时，杜香多糖提取得率稳步上升，可能是因为随着料
液比增大，目的提取物会更易溶于提取溶剂中;料液
比在 1∶ 20 至 1∶ 30 之间时，提取得率增加变缓，可能
是因为一定比例的溶剂已经将有效成分大部分溶
出;料液比在 1∶ 30 至 1∶ 35 之间时，提取得率受到的
影响不大，可能是由于足够的溶剂已经将多糖全部
溶解，再加大料液比会使杂质更多溶出，从而造成多
糖提取得率下降。因此选择 1∶ 30 作为优选料液比。
45
40
35
30
25
20
提
取
得
率
Ex
tra
ct
io
n%
ye
ild
（
%
）
40
35
30
25
20
40
35
30
25
20
40
35
30
25
20
0 20% 40% 60% 80 100% 120
原料粒度
Grain%size（目）
110% 115% 120% 125% 130% 135%
料液比
Solid/Liquid（m/v）
1% 2% 3% 4% 5% 6% 7
提取时间
Extraction%time（h）
0 20% 40% 60% 80 100
提取温度
Extraction%temperature（℃）
A B C D
提
取
得
率
Ex
tra
ct
io
n%
ye
ild
（
%
）
提
取
得
率
Ex
tra
ct
io
n%
ye
ild
（
%
）
提
取
得
率
Ex
tra
ct
io
n%
ye
ild
（
%
）
图 1 物料粒度(A)、料液比(B)、时间(C)、温度(D)对杜香多糖提取得率的影响
Fig. 1 Effects of particle size of Ledum (A)，solid:liquid ratio (B) ，time(C) ，temperature(D)on extraction yield of Ledum poly-
saccharide
7011Vol. 27 张乔会等:响应面法优化杜香多糖提取工艺
从图 1-C可以看出，提取时长 4 h 以内，随着提
取时间的增加，杜香多糖的提取得率逐渐增大，但提
取 2 h后提取得率增加逐渐减缓。提取 4 h后，提取
得率随时间基本没有变化，可能是物料中能溶解的
多糖已经基本溶出。因此确定优选提取时间为 4 h。
从图 1-D可以看出，温度的高低对杜香多糖的
提取有较大的影响。随着温度的升高，提取得率增
大，当温度达到 80 ℃时提取得率最大，之后提取得
率随温度的增加基本没有变化。所以确定优选提取
温度为 80 ℃。
2． 4 响应面模型的建立及结果
2． 4． 1 响应面模型回归分析
以 A(提取温度)、B(提取时间)、C(料液比)、D
(物料粒度)为变量，以杜香多糖的提取得率为响应
值，按响应面软件 Design expert 7． 1 提供设计的组
合进行试验，得到结果见表 2。
表 2 响应面分析的试验结果
Table 2 Program and experimental results of ＲSA
试验序号
No． A B C D
提取得率
Extraction yield(%)
1 1 0 -1 0 0． 3573
2 1 0 1 0 0． 3651
3 0 1 0 -1 0． 1937
4 -1 1 0 0 0． 3707
5 0 0 0 0 0． 3811
6 -1 0 1 0 0． 3803
7 0 0 1 -1 0． 1870
8 -1 -1 0 0 0． 3502
9 -1 0 -1 0 0． 3519
10 0 -1 1 0 0． 3664
11 0 -1 0 1 0． 3724
12 -1 0 0 -1 0． 1722
13 1 1 0 0 0． 3718
14 1 -1 0 0 0． 3515
15 0 -1 -1 0 0． 3698
16 0 0 0 0 0． 3824
17 0 0 -1 1 0． 3921
18 0 -1 0 -1 0． 1875
19 1 0 0 1 0． 3798
20 -1 0 0 1 0． 3514
21 0 0 0 0 0． 3735
22 0 0 -1 -1 0． 1835
23 0 1 -1 0 0． 3717
24 0 1 1 0 0． 3815
25 0 0 1 1 0． 3978
26 0 1 0 1 0． 4102
27 1 0 0 -1 0． 1743
采用 Design expert 7． 1 软件程序对试验数据进
行回归分析，得出杜香多糖提取得率的回归方程如
下:Y = 0． 38 + 1． 925E-003 × A + 8． 483E-003 × B +
4． 317E-003 × C + 0． 10 × D-5． 000E-005 × AB -
8011 天然产物研究与开发 Vol. 27
5. 150E-003 × AC + 6． 575E-003 × AD + 3． 300E-003
× BC + 7． 900E-003 × BD + 5． 500E-004 × CD-0． 017
× A2-1． 912E-003 × B2-1． 038E-003 × C2-0． 089 × D2。
其决定系数 Ｒ2 = 0． 9952，说明回归方程适用于
提取杜香多糖的理论预测值。对回归方程做显著性
检验与方差分析，结果见表 3。
表 3 二次响应面回归模型方差分析
Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table
方差来源
Variance
source
平方和
Sum of
Squares
自由度 DF
Degree of
freedom
均方
Mean
Square
F值
F Value
Prob ＞ F
p-value
显著性
Significance
模型 1． 723 × 10-1 14 1． 230 × 10-6 178． 01 ＜ 0． 0001 ＊＊
A-提取温度 4． 447 × 10-5 1 4． 447 × 10-5 0． 64 0． 4385
B-提取时间 8． 636 × 10-4 1 8． 636 × 10-4 12． 47 0． 0041 ＊＊
C-提取液料比 2． 236 × 10-4 1 2． 236 × 10-4 3． 23 0． 0975
D-物料粒度 1． 210 × 10-1 1 1． 210 × 10-1 1749． 31 ＜ 0． 0001 ＊＊
AB 1． 000 × 10-8 1 1． 000 × 10-8 0 0． 9906
AC 1． 061 × 10-4 1 1． 061 × 10-4 1． 53 0． 2394
AD 1． 729 × 10-4 1 1． 729 × 10-4 2． 50 0． 1400
BC 4． 356 × 10-5 1 4． 356 × 10-5 0． 63 0． 4430
BD 2． 496 × 10-4 1 2． 496 × 10-4 3． 61 0． 0819
CD 1． 210 × 10-6 1 1． 210 × 10-6 0． 02 0． 8970
A2 1． 500 × 10-3 1 1． 500 × 10-3 22． 33 0． 0005 ＊＊
B2 1． 951 × 10-5 1 1． 951 × 10-5 0． 28 0． 6052
C2 5． 741 × 10-6 1 5． 741 × 10-6 0． 08 0． 7783
D2 4． 210 × 10-2 1 4． 210 × 10-2 608． 17 ＜ 0． 0001 ＊＊
Ｒesidual 8． 307 × 10-4 12 6． 923 × 10-5
Lack of Fit 7． 845 × 10-4 10 7． 845 × 10-4 3． 39 0． 2489
Pure Error 4． 622 × 10-5 2 2． 311 × 10-5
Cor Total 1． 734 × 10-1 26
注:* 代表 5%显著水平，＊＊ 代表 1%显著水平。
Note:* Significant at P ＜ 0． 05 level，＊＊ Significant at P ＜ 0． 01 level．
2． 4． 2 响应面与等高线
根据回归方程，作出响应面和等高线图，考察拟
合响应曲面的形状，分提取温度、提取时间、料液比
和物料粒度对杜香多糖提取得率的影响，如图 2 ～ 7
所示。等高线的形状可以反映出交互相的强弱，椭
圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相
反［16］。由二次响应面回归模型方差分析可知，物料
粒度对杜香多糖提取得率的影响最大，提取温度、液
料比、提取时间的影响相对小一些，具体为:物料粒
度(D)＞ 提取温度(A)＞ 液料比(B)＞ 提取时间
(C)。即达到一定的料液比和提取间后，料液比和
提取时间对提取得率的影响十分微小。
0.386
0.37675
0.3675
0.35825
0.349
得
率
6
5 4 3
2 60 70
80 90
100
B:提取时间 A：提取温度
6
5
4
3
2
B:
提
取
时
间
60% 70% 80% 90 100
A：提取温度
得率
图 2 Y = f (A，B)的响应面与等高线
Fig. 2 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f (A，B)
9011Vol. 27 张乔会等:响应面法优化杜香多糖提取工艺
0.383
0.3745
0.366
0.3575
0.349
得
率
35.0
60 70
80 90
100
C:提取料液比 A：提取温度
60% 70% 80% 90 100
A：提取温度
得率
32.5 30.027.525.0
35.0
32.5
30.0
27.5
25.0
C:
提
取
料
液
比
图 3 Y = f (A，C)的响应面与等高线
Fig. 3 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f (A，C)
0.41
0.3475
0.285
0.2225
0.16
得
率
60 70
80 90
100
A：提取温度 60% 70% 80% 90 100A：提取温度
得率100
80
60
40
20
D：
物
料
浓
度
100
80 60
40 20D：物料浓度
图 4 Y = f (A，D)的响应面与等高线
Fig. 5 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f (A，D)
0.383
0.38625
0.3795
0.37275
0.366
得
率
2 3
4 5
6
B：提取时间 2% 3% 4% 5% 6B：提取时间
得率35.0
32.5
30.0
27.5
25.0
C:
提
取
料
液
比
35.0
C:提取料液比
32.5 30.027.525.0
图 5 Y = f (B，C)的响应面与等高线
Fig. 5 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f (B，C)
0.42
0.36
0.30
0.24
0.18
得
率
2 3
4 5
6
B：提取时间 2% 3% 4% 5% 6B：提取时间
得率100
80
60
40
20
D：
物
料
浓
度
100
80 60
40 20D：物料浓度
图 6 Y = f (B，D)的响应面与等高线
Fig. 6 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f (B，D)
0.42
0.36
0.30
0.24
0.18
得
率
C：提取料液比
25.0% 27.5% 30.0% 32.5% 35.0
C：提取料液比
得率100
80
60
40
20
D：
物
料
浓
度
100
80 60
40 20D：物料浓度 25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
图 7 Y = f (C，D)的响应面与等高线
Fig. 7 Ｒesponse surface plot and contour plot of Y = f (C，D)
0111 天然产物研究与开发 Vol. 27
2． 4． 3 优化提取工艺条件的确定
为进一步确定最佳点，利用 Design expert7． 1 软
件程序对工艺条件进行优化，可得杜香多糖提取得
率的最佳方案为:提取温度为 80． 43 ℃，提取时间为
6 h，液料比为 35∶ 1(mL /g)，物料粒度为 84． 55 目。
在此工艺条件下，软件程序对杜香多糖提取得率的
预测值为 4． 26%。为了实际的操作方便，将杜香多
糖的提取工艺参数修正为:提取温度为 80 ℃，提取
时间为 6 h，料液比为 1 ∶ 35(m/v)，物料粒度为 80
目，在此条件下实际测得的平均提取得率为
4. 19%，与理论预测值相比相对误差约为 1． 64%。
因此采用修正后的方法得到的提取参数准确可靠，
具有实用价值。
3 结论
以杜香枝叶粉末为原料，以水为溶剂提取杜香
多糖，主要受物料粒度和提取温度的影响。提取时
间和料液比达到一定程度后对提取得率的影响不
大。利用响应面法对杜香多糖的提取工艺进行了优
化。得到的水提杜香多糖的优化工艺条件为提取温
度为 80 ℃，提取时间为 6 h，料液比为 1∶ 35(m/v)，
物料粒度为 80 目，在此条件下杜香多糖的提取得率
可达 4． 19%。
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1111Vol. 27 张乔会等:响应面法优化杜香多糖提取工艺