全 文 ：EfectofSkulcapandBupleurumonapoptosisandBcl-2/Baxexpressioninthemyocardium
inmicewithviralmyocarditis
LiuFang, WangXuefeng, NanChunhong, etal.
(1 AfiliatedHospital, 2 DepartmentofPharmacy, LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine, Shenyang　110032)
　　 Objective:ToexploretheefectofSkulcapSEandBupleurum(BCE)ontheapoptosisandBcl-2/Baxexpressioninthemyocardium
inmicewithviralmyocarditis.Methods:Viralmyocardititis(VMC)modelwasinducedbyanintraperitonealinjectionofCoxsackievirusB3
(CVB3)intheBALB/cmouse.TheBalb/cmiceweredividedrandomlyinto4 groups:anormalcontrolgroup, aVMCmodelcontrolgroup
, twodrugsgroups(SEgroupandBCEgroup).Miceintwodruggroupsweregiven0.2ml/10gofChineseherbalmedicineextractbygastro-
gavageoncedaily, whileequalvolumeofnormalsalinewasgivenbygastrogavagetomiceinnormacontrolgroupandtheVMCmodelcontrol
group.Althemiceweresacrificedonthe3th, 5th, 7th, 10thand14thdayaftermodeling.Thepathology、theapoptosiscelandtheexpression
ofBcl-2/Baxinmyocardiumofeachgroupwasdetected.Result:TheexpressionofBcl-2 loweredobviouslyinthetwodruggroupsin3th,
5th, 7th, 10thdayascomparedwiththatofthemodelcontrolgroup, andthatinSEgroupismoreobvious.Thedifferenceofresultswasstatis-
ticalysignificant(P<0.005).StatisticalysignificantdifferencesabouttheexpressionofBaxwerenotfoundbetweenVCMcontrolgroup
andtwodruggroups(P<0.05).ItpresentpositivecorrelationbetweenpathologicalscoreandtheproteinexpressionofBcl-2(r=0.658, P
<0.05)onthe3th, 5thand7thdayaftermodeling.Conclusion:Skulcapextract、 Bupleurumchinenseextractmayacceleratetheapoptosis
oftheheartcellinfectedinacutestageofVCM, skullcapextractismoreobvious, whichmaybeinvolvedinaleviationofthemyocardial
pathologicalinjuries.
Keyword　Skullcap;Bupleurumchinense;viralmyocardititis;apoptosis;Bcl-2;Bax
白花丹参水溶性部位抑制脂多糖诱导的血管内皮细胞凋亡 ＊
赵启韬 1 ,王　鹏 2 ,杨　红 3 ,郭庆梅 2
(山东中医药大学 1基础医学院 , 2药学院 ,济南　250100;3济南市中心医院妇产科 ,济南　250014)
　　摘　要　目的:探明白花丹参对脂多糖处理的血管内皮细胞凋亡的影响及作用机制。方法:内毒素处理培养的人脐静脉内皮
细胞造成细胞凋亡。培养液中添加系列浓度的白花丹参水溶性成分培养细胞 ,倒置相差显微镜观测细胞形态变化。吖啶橙染色 ,
共聚焦显微镜观测凋亡细胞核片段化状况;PI染色 , 流式细胞仪检测细胞周期分布。生化试剂盒检测细胞内脂质过氧化物(MDA)
含量 , 超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。结果:脂多糖处理使血管内皮细胞形成大量凋亡小体 ,细胞核
片段化严重 , 并明显降低了细胞存活率 , 改变了细胞周期的正常分布 , 阻止细胞由 G1期进入 S期 , 同时显著上调了细胞中的 MDA
含量 , 而下调了其中的 SOD、GSH-PX活性明显。白花丹参水溶性部位在一定浓度范围内 , 剂量依赖性地逆转脂多糖引起的上述变
化。结论:白花丹参水溶性部位可能通过调节细胞氧化应激状态抑制脂多糖导致的血管内皮细胞凋亡。
　　关键词　白花丹参;脂多糖;血管内皮细胞;应激状态;细胞凋亡
　　白花丹参 SalviamiltiorrhizaBge.f.albaC.Y.WaetH.W.
Li.是丹参的一个变型 , 已作为一个新品种被收录进 2002年版
《山东省中药材标准》。由于分布仅限于山东 , 有关研究资料很
少。已证实 , 白花丹参和丹参化学成分 、药理活性 、临床效果均
有差异 [ 1, 2] , 至今尚无白花丹参对血管内皮细胞药理活性的研
究 , 我们利用内毒素(LPS)诱导人脐静脉血管内皮细胞(Human
UmbilicalVascularEndothelialCels, HUVEC)凋亡 , 研究白花丹
参水溶性部位对血管内皮细胞的保护作用。
1　材料与方法
1.1　试验药物　白花丹参购至山东莱芜白花丹参种植基地 ,
样品经山东中医药大学周凤琴教授鉴定。采用水煎法制备其水
提取物 ,在水提取后 , 采用乙醇沉淀蛋白等物质后得到其水溶性
成分。
1.2　试剂　内毒素(LPS), 胶原酶 , 胰蛋白酶 , 新生牛血清 ,
M199培养基 ,碘化丙啶(PI), RNA酶 , MTT等购至 Sigma公司。
MDA、SOD检测试剂盒购至南京建成。其余试剂均为分析纯。
56 中药药理与临床 2010;26(6)
＊ 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目 ,编号:2006BS03047
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2010.06.017
1.3　 细胞　人脐静脉内皮细胞
1.4 　仪器　A5002型酶标仪(瑞士 Tecan公司), 流式细胞仪
(美国 BD公司)。
1.5　 方法　参考 Jaffe和赵启韬的方法提取 、鉴定及培养人脐
静脉内皮细胞 [ 3, 4] 。简述如下:取新生儿新鲜脐带 , 两端插管 ,
PBS冲洗干净其中血液 , 0.1%胶原酶消化 10分钟。 1000转 , 10
分钟离心收集细胞。细胞接种于含 20% 新生牛血清的 M199
培养液中 , 培养瓶以 0.2%明胶包被 , 37℃、5% CO
2
、饱和湿度
的培养箱中培养。经Ⅷ相关抗原免疫荧光鉴定 , 所提细胞为血
管内皮细胞。 细胞呈单层贴壁培养 , 0.05%胰酶消化 , 1:2传
代。实验用细胞群体倍增系数 10次以上 ,处于对数生长期。内
毒素诱导血管内皮细胞调亡方法参考许冬青等的方法并改进
[ 5] 。血管内皮细胞分为三组 , ①正常对照组:细胞不作处理 ,正
常生长于 M199培养液中。 ②LPS组:M199基本培养液中中添
加 5 mg/L的 LPS。 ③白花丹参组:培养液中同时添加 LPS、系
列浓度(0.5 mg/L、1 mg/L、 5 mg/L、10 mg/L、及 20 mg/L)白花
丹参水溶性部位。各组细胞 37℃孵箱内孵育 24h, 倒置相差显
微镜观察细胞形态变化并做以下检测。
1.5.1　细胞核片段化分析　分别取上述三种方法处理 24h的
细胞 , 95%乙醇固定 3分钟 , 经丫啶橙染液(吖啶橙溶解于 95%
的乙醇中 , 终浓度为 0.1%)染色 5分钟后 , 激光扫描共聚焦显
微镜(德国 Zeiss, LSM510)观察细胞核 DNA的浓缩和片段化。
1.5.2　MTT法检测细胞存活率　细胞以 5×104 /孔接种于 96
孔板 , 200 μl/孔。待细胞长至半满时 , 按上述设计加 LPS及系
列浓度白花丹参处理 ,每组 8个平行孔。处理时间终止时每孔
加入 MTT溶液(5mg/ml)20μl, 37℃, 继续孵育 4h, 终止培养 ,弃
去孔内培养上清夜 , 每孔加入 150 μlDMSO, 震荡 10 min, 使蓝
紫色结晶物甲臜(Formazan)充分溶解 ,酶标仪 570 nm波长测定
每孔的吸收值。按公式:存活率 =实验组 /对照组 ×100%,求出
实验组的存活率。重复 3次。
1.5.3　流式细胞仪检测　0.25%胰酶消化细胞。 PBS洗 2次
(1000rpm离心 10 min, 弃上清), 预冷的 70%乙醇固定 , 4℃过
夜。 PBS洗 2次。 DNA染液(含 PI100μg/ml, RnaseA20单位 /
ml的 PBS溶液), 室温避光染色 30 min, PBS洗 1次。
1.5.4　丙二醛(MDA)含量 、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽
过氧化物酶(GSH-PX)活性检测　收集培养液上清 , 1000rpm离
心去除细胞碎屑 , 按试剂盒说明书逐步检测。
2　结果
2.1 　白花丹参水溶性部位显著抑制内毒素诱导的血管内皮细
胞凋亡　倒置相差显微镜观察发现:血管内皮细胞经 5μg/ml
的内毒素处理 24小时后 ,细胞发生凋亡特有的形态变化 , 由扁
圆形变为具少数分枝的细长条形 , 继而变圆脱离皿底 , 可见大
量的凋亡小体。同样条件下加入白花丹参水溶性部位 , 细胞的
上述形态变化显著被抑制 , 24小时后多数细胞仍保持扁圆形 ,
仅产生少量的凋亡小体。以系列浓度的白花丹参水溶性部位
+LPS处理细胞 ,结果显示该部位对细胞的保护作用呈剂量依
赖效应 , 其中 10μg/ml的药物对内皮素诱导的细胞凋亡保护作
用最明显 , 见图 1。
图 1　相差显微镜照片———白花丹参水溶性部位抑制内毒素诱导的血
管内皮细胞凋亡(A:正常组细胞 ;B:5μg/ml内毒素处理的细胞 ;C:
10μg/ml白花丹参水溶性部位 +5μg/ml内毒素处理的细胞)
2.2　白花丹参水溶性部位抑制内毒素导致的细胞核片段化　
正常细胞核呈弥散均匀淡染荧光 , 早期凋亡细胞细胞核呈现波
纹状或者折缝样 ,部分染色质出现浓缩状态;中晚期凋亡细胞细
胞核染色质高度凝聚 、 边缘化 , 细胞核裂解为碎块。 通过对上
述实验条件下细胞核荧光染色分析 , 发现内毒素处理组伴随着
细胞凋亡的形态变化 ,细胞核 DNA发生了细胞凋亡所特有的浓
缩和片段化 ,而加入白花丹参水溶性部位组 , 细胞核 DNA浓缩
和片段化程度显著被抑制 ,见图 2。
图 2　白花丹参水溶性部位抑制内毒素导致的血管内皮细胞核片段
化(A:正常组细胞 ;B:5μg/ml内毒素处理的细胞 ;C:10μg/ml白
花丹参水溶性部位 +5μg/ml内毒素处理的细胞)
2.3　白花丹参水溶性部位提高内毒素处理的血管内皮细胞存
活率　 MTT检测数据表明 , 和正常对照相比 , 内毒素处理的细
胞 ,其存活率仅为 49.8%。白花丹参水溶性部位能够逆转 LPS
的作用 ,显著提高细胞存活率 , 且呈剂量依赖效应(图 3)。 其中
10～ 20μg/ml浓度的凋亡抑制效果最佳 , 12μg/ml的白花丹参
水溶性部位可将细胞存活率提高到 84.4% (P<0.01)。
图 3　白花丹参水溶性部位对内毒素处理的血管内皮细胞存活率影
响(和内毒素处理的凋亡组 ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01)
2.4　白花丹参水溶性部位逆转内毒素处理的 VEC细胞周期
　通过分析上述实验条件下的细胞周期 , 我们发现和对照组相
比 , 5μg/ml内毒素处理 24小时后的细胞经 , S期细胞所占比例
从 12.58%降至 3.9%。白花丹参水溶性部位可显著逆转内毒
素导致的细胞周期异常 ,使 S期细胞恢复到 10.59%, 和正常对
照组没有显著差异(表 1,图 4)。
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图 4　白花丹参水溶性部位调整内毒素导致的血管内皮细胞周期异常
A:对照组细胞 ;B:5μg/ml内毒素处理的细胞;C:10μg/ml白花丹参水溶性部位 +5μg/ml内毒素处理的细胞
　　表 1　白花丹参水溶性部位对内毒素处理的 VEC细胞周期的影响
组别 G1% S% G2%
对照 80.81 12.58 8.11
内毒素 86.56 3.9 9.8
白花丹参 +内毒素 83.26 10.59 6.15
2.5 　白花丹参水溶性部位调整内毒素导致的 VEC异常氧化
应激状态　内毒素处理组细胞丙二醛(MDA)含量极显著升高 ,
而超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活
性却极显著下降。该结果表明内毒素加重了内皮细胞中脂质
过氧化程度 ,而降低了细胞氧自由基清除能力 , 使细胞氧化还
原状态异常 ,见图 5。
图 5　白花丹参水溶性部位对内毒素处理的内皮细胞 MDA、SOD、GSH-PX的影响
和内毒素处理的凋亡组 ＊ P<0.05, ＊＊ P<0.01
3　讨论
　　已证实 , 血管内皮损伤是多种心脑血管类疾病的始发因素
[ 13]血管内皮细胞凋亡是内皮损伤的重要环节。内毒素诱导的
血管内皮凋亡参与了动脉粥样硬化的病理过程 [ 14] 。我们实验
结果表明 , 内毒素处理使血管内皮细胞形成大量凋亡小体 , 细
胞核片段化严重。同时显著降低了细胞存活率 , 改变了细胞周
期的正常分布 , 阻止细胞由 G1期进入 S期。白花丹参水溶性
部位在一定浓度范围内 ,剂量依赖性地显著抑制了内毒素诱导
的细胞凋亡小体的形成;提高了细胞存活率 , 使细胞周期基本
恢复正常。该结果表明白花丹参水溶性部位能够抑制内毒素
诱导的血管内皮细胞凋亡。
　　细胞内氧化应激状态异常是导致细胞凋亡的关键因素之
一。 SOD、GSH-PX是体内主要的对抗氧自由基的酶。在机体的
氧化与抗氧化的平衡中起着重要的作用 , 其活性高低是机体抗
氧化能力的判断指标 。两种酶活性不足 ,不能及时发挥抗氧化
作用 , 导致细胞内氧自由基增多。氧自由基与细胞膜磷脂中不
饱和脂肪酸发生过氧化反应 ,产生具有细胞毒性的 MDA。 MDA
含量间接反映了组织中氧自由基含量及细胞损伤的程度。已
有研究证明内毒素可引起细胞膜脂质过氧化 , 加剧细胞氧化应
激反应 , 激活细胞凋亡信号转导通路 [ 8] 。我们检测数据显示 ,
在血管内皮细胞中 , 内毒素的处理在促使凋亡的同时 , 显著上
调了细胞中的 MDA含量 , 而下调了其中的 SOD、GSH-PX活性
明显。白花丹参水溶性部位在抑制细胞凋亡的同时 , 明显逆转
了内毒素导致的 MDA含量 、以及 SOD、GSH-PX活性变化。上
述结果表明白花丹参水溶性部位保护血管内皮细胞免于凋亡
的机制可能在于:逆转脂多糖导致的细胞氧化应激状态异常。
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