全 文 ：HPLC-APCI-MS分析半边旗中二萜类化合物
邓亦峰＊ , 梁念慈 , 梁　统
(广东医学院 、广东省天然药物研究与开发重点实验室 , 广东 湛江 524023)
摘要:目的　建立一种准确可靠的分析半边旗中二萜类化合物的方法。方法　用高效液相色谱(HPLC)-大气压
化学电离源(APCI)-质谱(MS)联用的方式 , 以选择离子监测(SIM)方式进行测定。主要的二萜类化合物5F和 4F 的准
分子离子为[ M-H] -1 , 发生源内分子离子碰撞活化解离(CID)现象时 , 出现[M-H] -1和[ M-H2O-H] -1离子峰。 采
用[ M-H] -1为选择监测离子 , 以色谱保留时间和选择监测离子流峰面积定量 , 优选质谱条件和色谱条件。分析色谱
柱为 Diamonsil ODS , 4.6 mm×150 mm ,流动相为 30% CH3CN-70% 2 mmol·L-1 NH4Ac ,流速 1.0 mL·min-1 , 进样 5 μL。
以测定半边旗中二萜类化合物 5F 为例 ,对此方法进行了应用。结果　半边旗中二萜类化合物 5F为 1.18 mg·g-1 , 方
法线性范围 0.05～ 2.5 μg ,相关系数均优于 0.999 , 检出限达 0.4 ng(进样 5 μL)。 5F 的加标回收率为 97.8%(n=3),
5F保留时间为 4.3 min。结论　本法灵敏 、准确 、可靠 , 可应用于半边旗中二萜类抗癌化合物的深入研究和生药标准
的制定。
关键词:高效液相色谱;质谱;大气压化学电离源;半边旗;二萜类化合物
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2002)06-0444-03
　　半边旗(Pteris semipinnata L ,PsL)为凤尾蕨科植
物 ,收载于《中药大词典》 ,民间认为有解毒 、消肿及
治疗蛇伤的功效 ,国外文献[ 1] 报道其含二萜和倍半
萜等化合物 。梁念慈等[ 2 , 3] 首先发现半边旗中有α,
β-亚甲基环戊酮基团结构的贝壳衫烷型二萜类化合
物(具有强烈的抗癌作用),并对它们作了分离鉴定 。
半边旗中二萜类化合物主要以 5F(ent-11α-hydroxy-
15-oxo-kaur-16-en-19-olic acid)和 4F(ent-11α-hydroxy-
15-oxo-kaur-16(R)methyl-19-olic acid)形式存在。5F
与4F仅相差一个双键 , 5F有抗肿瘤活性 ,4F 无抗
肿瘤活性 ,也无紫外吸收 。提取物中二者难以分离 ,
采用通常的 HPLC-UV(紫外检测器)不能评价分离
效果 。它们的结构式如下:
收稿日期:2001-07-05.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(3987099).
作者简介:邓亦峰(1960-),男 ,高级工程师.
＊Tel:(0759)2388405, Fax:(0759)2284104 ,
E-mail:dengfy@gdmc.edu.cn
　　半边旗中二萜类化合物的定量分析方法国内外
尚未见报道。本文以 5F 为例 ,采用 HPLC-APCI-MS
联用的方式 ,选用m z -331作为化合物 5F的选择
监测离子 ,对其实现了灵敏 、准确 、快速的在线测定 ,
同时讨论了5F和 4F的分离鉴定方法 。该法为半边
旗抗肿瘤药物的开发和深入研究以及质量标准的建
立提供了准确 、可靠的分析手段 。
材 料 与 方 法
　　仪器　岛津 LCMS-8000α型高效液相色谱-质谱
联用仪(含在线脱气机 ,两台 LC-10AVP高压输液泵 ,
SPD-10AVP紫外检测计 ,柱温箱 ,APCI源接口 ,四极杆
质谱检测计)。
　　试剂　CH3CN(HPLC 级 ,美国 Fisher 公司),乙
酸铵(分析纯),三重蒸馏水 。
　　对照品　5F和4F对照品(本课题组分离纯化 ,
由日本东京理科大学药学部和广东医学院医用生化
研究所鉴定);半边旗生药材采集于广州市郊 ,由湛
江海洋大学杨燕君副教授鉴定。
　　色谱条件　色谱柱为 Diamonsil C18 , 5 μm(4.6
mm×150 mm);流动相 A 为 CH3CN ,流动相 B 为 2
mmol·L-1 NH4AC 水溶液 , A∶B =35∶75;流速 1
mL·min-1 ,进样 5μL。
·444· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2002 , 37(6):444-446
　　质谱条件　APCI负离子源 ,电极温度 400℃,电
晕(Corona)电压 -4.0 kV ,离子传输电压+55 V 、温
度250℃,偏转电压-40V ,检测器电压1.6 kV ,喷雾
氮气流速 2.5 L·min-1 ,采用选择离子监测(SIM)方
式 ,扫描间隔1 s。以色谱保留时间 4.3 min , m z -
331和色谱保留时间 4.8 min ,m z -333分别为 5F
和 4F 的选择监测离子。采用选择监测离子流
(MIC)图峰面积进行定量 。
　　样品制备　称取干燥的半边旗地上部分粉末
(40目)5.00 g ,用甲醇为溶剂 ,置 80℃水浴 ,Soxhlet
提取 7 h ,虹吸 7次 。提取液以甲醇定容至 100 mL ,
备测 。
结 果 与 讨 论
1　测定条件的优化
1.1　质谱条件　将 5F对照品以甲醇为溶剂配制成
100μg·mL-1的溶液 ,进样 5 μL ,由 HPLC 经 APCI 接
口导入质谱检测器。采用负离子扫描方式 ,以m z
-331[M-H] -1准分子离子峰强度为指标 ,调节接
口和质谱检测器各参数 ,使信号最强 ,选择最佳质谱
条件 。增加偏转电压可观察到源内分子离子碰撞活
化解离(CID)现象 ,出现m z -331[ M-H] -1和m z
-313[M-H2O-H] -1离子峰 ,如图 1。4F质谱行为
相似 ,出现m z -333[M-H] -1和m z -315[M-H2O
-H] -1离子峰 。这些现象可用于定性鉴定 ,但发生
分子离子碰撞活化解离现象会降低[M -H] -1分子
离子峰强度 ,不利于定量分析 。
Figure 1　Mass spectra of ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-
16-en-19-olic acid(5F)
A.Deflect voltage , -40 V;B.Deflect voltage , -80 V
1.2　流动相　HPLC-MS的流动相须同时兼顾色谱
分离和质谱电离源的要求。5F和 4F是含羧基的化
合物 ,在 C18柱反相色谱分离中 ,流动相中加入pH为
4.2的 NH4Ac-HAc缓冲盐(流动相A)作离子抑制剂
可获得良好的效果 。在大气压化学电离负离子源的
诱导电离中 ,弱酸性化合物的诱导电离需要碱性或
中性的介质 ,酸性介质会抑制分子离子的形成 ,文
献[ 4]推荐使用 CH3CN-水作流动相(流动相 B)。本
文在实验中采用了 30% CH3CN-70% 2 mmol·L-1
NH4Ac水溶液作流动相(流动相 C),取得较好效果。
采用上述 3种不同的流动相对 42 μg·mL-1的 5F对
照品溶液进行测定 ,得到的m z -331选择离子流峰
面积比为 A∶B∶C=1∶1.8∶5.8。文献[ 4] 认为APCI负
离子源以气相离子化为主导 ,加入 NH4Ac 对离子化
的增强作用小。本实验中 NH4Ac的加入显著增强
5F和 4F在 APCI负离子电离方式中[M-H] -1分子
离子的质谱响应 ,其机理有待进一步探讨 。
2　色谱行为
以 30%CH3CN-70%2 mmol·L-1 NH4Ac水溶液
作流动相 , 以选择离子监测(SIM)方式监测m z -
331和m z -333的离子流分别检测 5F和 4F ,与 UV
检测器相比 ,不需要精细的色谱分离 ,在保证选择性
的同时 ,可缩短分析时间 ,灵敏度大为提高 。图 2是
UV检测器和质谱检测器串联在线测定半边旗样品
提取液的谱图 , a 为 LC-MS 选择监测离子流(MIC)
图 ,b为 LC-UV谱图。比较可看出 ,b 的分辨率和信
噪比远不如 a ,且 b 对 4F无响应 。UV 检测器与质
谱检测器两种不同检测方法所得到的 5F 对照品回
归曲线斜率之比达 1∶16。同条件下改用扫描方式
得到的 LC-MS总离子流图可作为鉴定半边旗生药
材的指纹图 。
3　标准曲线
在本 实验条 件下 , 浓度 为 0.010 ～ 0.500
mg·mL-1 5F的 MIC峰面积与浓度呈线性关系 ,回归
方程:Y =1.176×108X +9.78×105 ,γ=0.9998 , n =5。
5F的最低检出限为 0.4 ng(二倍信噪比对应的量)。
4　加标回收率试验
平行称取 6份干燥的半边旗地上部分粉末(40
目)5.00 g ,其中 3份作对照 ,另外 3份分别加入含
5F对照品 4.00 mg 的甲醇溶液(加入量与样品含量
相近)。待样品挥干溶剂后 ,按“样品制备”方法制备
样品 ,以本法进行测定 ,计算加标回收率。加标回收
率平均为97.8%,RSD为 2.9%(n=3)。
·445·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2002 , 37(6):444-446
Figure 2　LC MS chromatogram of Pteris semipinnata L
extract with select ion monitor(SIM)mode(A)and LC
UV chromatogram of Pteris semipinnata L extract withλmax
242 nm (B)
1.Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-olic acid(5F),
m z-331 [M-H] -1 ;2.Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-
16(R)methyl-19-olic acid(4F), m z-333 [M-H] -1
5　样品测定结果
按“样品制备”方法平行制取 4份样品 ,进样 5
μL ,同“标准曲线”条件测定 5F的MIC 峰面积 ,以外
标法代入回归方程计算含量 。样品中 5F 含量为
1.18 mg·g-1 ,RSD为 5.3%(n=4)。平行测定浓度
为 0.059 mg·mL-1的试液 , RSD为 0.7%(n =6)。
REFERENCES:
[ 1] Maurakami T , Tanaka N.Occurrence , structure and
taxonomic implications of fern constituents [ J] .Prog Chem
Org Nat Prod , 1988 , 54:1-310.
[ 2] Zhang X , Cui L , Tanaka N , et al.The active constituents
and antitumor action of Pteris semipinnata L [ J] .Chin
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[ 3] Li JH , He CW , Liang NC.Effects of antitumor compounds
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[ 4] Zhou SL, Hamburger M.Application of liquid chromato-
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natural product analysis:Evaluation and optimization of elec-
trospray and heated nebulizer interfaces [ J] .J Chromatogr
A , 1996 , 755(2):189-204.
ANALYSIS OF THE DITERPENOIDS IN THE EXTRACT OF
PTERIS SEMIPINNATA L BY HPLC-APCI-MS
DENG Yi-feng , LIANG Nian-ci , LIANG Tong
(Guangdong Medical College , Key laboratory of Natural Drugs Research and
Development of Guangdong , Zhanjiang 524023 , China)
ABSTRACT:AIM　To establish an accurate and reliable method for quantitative analysis of the diterpenoids in
Pteris semipinnata L.METHODS 　A quadruple mass spectrometer coupled with atmospheric pressure chemical
ionization interface was employed as a detector for HPLC.As to MS detector , selective ion monitoring (SIM)scan mode
was used.For ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-olic acid(5F)and ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16(R)methyl-
19-olic acid(4F), the majority of the diterpenoids in Pteris semipinnata L , the [M-H] -1 ion were observed , and the
[M-H2O-H] -1 ion could be observed from the collision-induced dissociation spectua.[M-H] -1 was selected as the
SIM ion in quantification , the mobile phase and the MS conditions were optimized.The mobile phase of HPLCwas 30%
CH3CN-70% 2 mmol·L-1 NH4Ac , analytical column was Diamonsil ODS (4.6 mm ×150 mm), flow rate 1.0
mL·min-1 , inject volume 5μL.The area of ion flow peak were used for quantitative determination.As an example of its
application , this method was used to determine the content of 5F as an antitumor diterpenoid in Pteris semipinnata L.
RESULTS　The content of 5F accounted 1.18 mg·g-1 in Pteris semipinnata L sample.For 5F , RT is about 4.3min ,
the standard curve showed good linearity over the range of 0.05 ～ 2.5μg , γ=0.9998(n=5);the recovery was 97.8%
(n=5);the limit of detection was 0.4 ng (inject 5μL).CONCLUSION　This method is highly sensitive , accurate
and fast , which can be applied to study the antitumor drug of diterpenoids in Pteris semipinnata L and to establish the
raw herb standard.
KEYWORDS:HPLC;MS;APCI;Pteris semipinnata;diterpenoids
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