全 文 ：【文章编号】1005-4057(2003)03-0201-03 基础研究
半边旗提取物 5F对人病理性瘢痕成纤维细胞增殖的影响
张云松1 ,罗少军2 ,汤少明2 ,吴　平3 ,邓亦峰4(1.广州市红十字会医院(暨南大学医学院第四附属医院)
整形科 ,广州 510220;　2.广东医学院整形研究所 ,广东湛江 524023;　3.广东医学院附属医院
中心实验室 ,广东湛江 524001;　4.广东天然药物开发中心 ,广东湛江 524023)
【基金项目】广东重点学科资金资助(编号:9306)
【收稿日期】2003-01-20;【修订日期】2003-03-06
【作者简介】张云松(1970-), 女 , 硕士 , 主治医师 , E-mail:yszhang
5201314@163.com
【摘要】目的:研究半边旗活性成分 5F对人病理性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:将不同浓度 5F 作用于体外培
养的人病理性瘢痕成纤维细胞 ,检测 M TT 及 LDH 值 ,用免疫组织化学法检测用药前后细胞核内增殖核抗原(prolife rating
cell nuclear antigen , PCNA)的表达。结果:5F 在 10 ～ 120 mg/ L 浓度范围对病理性瘢痕成纤维细胞呈剂量依赖性增殖抑制 ,
LDH 值在 0 ～ 40 mg/ L浓度范围内无明显改变 , PCNA的表达在 5F 作用后明显减弱。 结论:5F 在体外能明显抑制病理性
瘢痕成纤维细胞增殖 ,浓度在 40 mg/ L 范围内不引起细胞坏死性改变。
【关键词】半边旗;成纤维细胞;增殖
【中图分类号】R 965　【文献识别码】A
Effect of compound 5F isolated from Pteris semipinnata L .on proliferation of
pathological scar-derived fibroblasts
ZHANG Y un-song1 , LUO Shao-jun 2 , TANG Shao-ming2 , et al
(1.Department of Plastic Surgery ,Guangzhou Red Cross Hospi tal ,Guangzhou ,510220;2.Institute of
Plastic Surgery ,Guangdong Medical College ,Zhanjiang.524001 ,China)
【Abstract】Objective:To study the effect of compound 5F iso lated from Pteris semipinnata L.(PS L)on proliferation of
pathological scar-derived fibroblasts.Methods:After treated with different concentrations of 5F , inhibition rate , lactate dehydroge-
nase(LDH)and proliferating cell nuclear antig en(PCNA)expression of pathological scar-derived fibroblasts were detected by M TT
assay , automatic biochemical analy sor and immunohistochemical method respectively.Results:5F had a dose-dependent inhibition of
fibroblast proliferation at streng ths of 20-120 mg/ L(P <0.01).LDH level of fibroblasts trea ted with 0-40 mg/ L of 5F showed no
obvious change(P>0.05), but it remarkably elevated with 80-120 mg/ L of 5F(P<0.01).PCNA expression of fibroblasts signif-
icantly decreased after incubated with 20-80 mg/ L of 5F(P<0.01).Conclusion:Compound 5F could substantially inhibit the pro-
liferation of pathological scar-derived fibroblasts in vitro , and there is no fibroblast necrosis at 40 mg/ L or less of 5F.
【Key words】Pteris semipinnata L.;fibroblast;proliferation.
　　中药半边旗(Peris sem ipinnata L)是凤尾蕨科凤
尾蕨属植物 , 已证实从中提取的二萜类化合物 5F
(11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19酸 ,以下简称
5F)对生长增殖活跃的细胞具有抑制作用 ,且具有高
效低毒的多种体内外抗肿瘤活性[ 1] 。病理性瘢痕为
成纤维细胞瘤样增生性疾病 ,本文作者就 5F 对病理
性瘢痕成纤维细胞增殖是否有影响进行了观察 ,现将
结果报道如下。
201
　第 21 卷第 3 期
2003年 6月 　　　　　
广　东　医　学　院　学　报
JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE
　　　　Vol.21 No.3　
Jun.2003　
1　材料与方法
1.1　药品与试剂
半边旗二萜类化合物 5F 由广东医学院生化研究
所惠赠;DMEM 由美国 GIBCO公司出品;新生小牛血
清(FBS)由杭州四季青生物工程材料公司出品;胰蛋
白酶 、四甲基偶氮唑(MTT)由美国 SIGMA公司出品;
鼠抗人 PCNA单克降抗体由美国ZYMED公司出品。
1.2　方法
1.2.1　成纤维细胞(FB)培养[ 2 ,3]标本来源于手术中
切下的病理性瘢痕 ,患者年龄 15 ～ 42岁 ,病程 1 ～ 2 a ,
无菌条件下进行漂洗 、剪碎 ,接种于含 15%小牛血清
(FBS)的 DMEM 培养液中 ,在37℃,CO2 孵箱中培养 ,
待细胞从组织块中长出并融合成致密的单层后用
0.25%胰蛋白酶消化 ,1∶4传代。本实验所用细胞为 3
～ 8代。
1.2.2　MT T 比色法[ 4]测定细胞增殖状况　取对数
生长期细胞 ,在 96孔培养板中接种 2×103 个细胞+
DMEM 培养液 200 μL ,置CO2孵箱内培养 24 h ,吸弃
上清 ,按分组加入条件培养液继续培养 24 h , 加入
MT T 液 10 μL/孔振荡显色 ,自动酶联免疫分析仪测
定 A 值(波长 570 nm)。增殖抑制率(IR)[ 1 ～ (实验
组吸光值 ～对照组吸光值)/对照组吸光值] ×100%。
1.2.3　培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量的
测定　将对数生长期的 FB 接种于 96孔细胞培养板 ,
每孔 5×103细胞 ,置于CO2孵箱中静置培养 6 h ,待细
胞贴壁 、伸展后按分组加入条件培养液 ,继续培养 144
h后吸取上清液 ,加入乳酸脱氢酶-L 试剂 ,经全自动生
化分析仪(波长 340 nm)测定 LDH 活性值 。
1.2.4　免疫组化检测成纤维细胞 PCNA表达　收集
分别用不同浓度 5F 作用 48 h 后的成纤维细胞 ,制成
细胞涂片 ,每瓶取 3张涂片 ,用生理盐水代替第一抗
体 ,作为阴性对照 ,按常规方法行 PCNA染色 , DAB显
色 ,苏木素复染 ,脱水封片后在显微镜下观察结果 。每
张玻片任取 5个视野进行细胞计数 ,至少计数 500个
细胞 。阳性信号为棕黄色 ,定位于细胞核。
1.2.5　统计学处理
所得数据以均数±标准差( x ±s)表示 ,采用单因
素方差分析后 ,多个实验组和对照组比较用最小显著
差法(LSD 法)检验 , P <0.05 差异有显著意义 。
2　结果
2.1　MTT 法检测结果
见表 1及图 1 ,结果显示 ,与对照组相比 ,随着药
物浓度增大 ,细胞抑制率显著增高(P <0.01)。
表 1　MTT法检测不同浓度 5F作用 24 h对 FB增殖的
　　　影响(n =6 , x±s)
5F浓度(ρ/ mg.L-1) 抑制率(%)
　　　　　0(对照) 0
5 1.9±0.8
10 4.3±0.5
20 17.3±1.9＊
40 31.3±3.5＊
80 48.9±5.3＊
120 67.8±7.2＊
　　注:与对照组相比 , ＊P <0.01
　　图 1　不同浓度 5F作用 24 h对 FB的抑制率
2.2　培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量
与对照组相比 , LDH 值在 5F 浓度为 0 ～ 40 mg/L
时无统计学意义 ,而 5F 浓度在 80 ～ 120 mg/L 时 ,有
显著性差(P <0.01)。说明 5F 浓度在 40 mg/L 内无
细胞毒作用。
表 2　5F对细胞上清液中 LDH(IU/ L)含量的影响
　　　(n=6 , x±s)
5F浓度(ρ/ mg.L-1) LDH(IU/ L)
　　　　0(对照) 3.021±1.76
5 2.952±1.83
10 3.117±1.50
20 3.016±1.95
40 3.225±2.17
80 4.506±2.31＊
120 6.782±3.06＊
　　与对照组相比 , ＊P<0.01
202 　　　　　　　　　　　　广　东　医　学　院　学　报　　　　　　　　　　　　　2003年第 21 卷　
2.3　5F 对成纤维细胞 PCNA表达的影响
如表 3所示:用 5F 处理成纤维细胞后 , PCNA 表
达的阳性率均显著下降(P <0.01)。
表 3　不同浓度 5F作用于 FBPCNA的表达(n=6 , x ±s)
5F浓度(ρ/ mg.L-1) PCNA 阳性率(%)
　　　　　0(对照) 60.16±5.62
20 52.39±3.56＊
40 38.21±4.32＊
80 25.48±2.13＊
　　与对照组相比 , ＊P<0.01
3　讨论
胶原过量沉积是形成瘢痕的主要原因之一 ,而成
纤维细胞是合成胶原的主要细胞 ,成纤维细胞合成与
分泌胶原能力的增强或成纤维细胞的大量增殖 ,都可
以导致胶原总量的增加 ,从而产生病理性瘢痕[ 5] 。多
年来 ,很多治疗病理性瘢痕的药物就是通过干扰成纤
细胞活性功能中的一个或多个环节来实现的 。本文通
过体外培养的人病理性瘢痕成纤维细胞的 MTT 实
验 ,发现 5F 浓度高于 10 mg/L 时 , 细胞呈现抑制状
态 ,随药物浓度增高 ,作用效果愈明显 , 5F 浓度在 20
～ 120 mg/L 时 ,与对照组相比 ,细胞抑制率呈显著性
增加(P <0.01),验证 5F 对成纤维细胞呈剂量依赖性
抑制 ,提示 5F 有可能成为抗病理性瘢痕的可行药物。
乳酸脱氢酶(LDH)为所有细胞胞浆内存在的细
胞内酶 ,一旦细胞膜受损 ,LDH 即迅速释放到细胞外 ,
故可作为细胞毒性检测的一项敏感指标 。本实验通过
细胞培养上清中的乳酸脱氢酶的检测 ,发现 5F 浓度
在 5 ～ 40 mg/L 时 ,细胞上清液中 LDH 值与对照组相
比 ,无显著性差异(P >0.05),证实 5F 在 40 mg/L 浓
度范围内对病理性瘢痕成纤维细胞不产生毒性作用;
当浓度在 80 ～ 120 mg/L 时 , LDH 值与对照组相比 ,显
著升高(P <0.01),具有成纤维细胞毒性作用 , 5F 在
120 mg/ L 浓度时可发生细胞坏死性改变 。本结果表
明 ,5F 对成纤维细胞作用的最佳效应浓度 ,可能在 20
～ 80 mg/L 之间 。
PCNA 又称周期蛋白(cyclin),其功能是 DNA 多
聚酶δ的辅助因子 ,它的出现明显与细胞增殖有关 ,在
静止期其量很少 , G1 晚期开始增加 , S 期达到高峰 ,
G2 、M 期明显下降[ 6] 。故 PCNA 是了解细胞增殖活性
状态的重要指标。本实验结果表明经 5F 作用后 ,成
纤维细胞 PCNA 的表达明显减弱(P<0.01),说明 5F
可抑制呈活性增殖状态的瘢痕成纤维细胞 ,使其 DNA
的合成明显减少 ,增殖受阻。
实验结果证实 , 5F 对病理性瘢痕成纤维细胞的增
殖活性有明显的抑制作用 ,在一定浓度范围内不具细
胞毒性 ,但该药对成纤维细胞的其他作用及其机制有
待进一步研究。
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